Method Article

זרימת עבודה ניסיונית וניתוח נתונים עבור ננו-אינדנציה של חומר רך

DOI:

10.3791/63401

⸱

January 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציג זרימת עבודה מלאה לניסויים בננו-אינדנציה של חומרים רכים, כולל הידרוג'לים ותאים. ראשית, מפורטים הצעדים הניסיוניים לרכישת נתוני ספקטרוסקופיית כוח; לאחר מכן, הניתוח של נתונים כאלה מפורט באמצעות תוכנת Python קוד פתוח שפותחה לאחרונה, אשר ניתן להוריד בחינם מ- GitHub.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-אינדנטציה מתייחסת לקבוצה של טכניקות ניסיוניות שבהן נעשה שימוש בגשושית כוח מיקרומטרית כדי לכמת את התכונות המכניות המקומיות של ביו-חומרים ותאים רכים. גישה זו קיבלה תפקיד מרכזי בתחומי המכנוביולוגיה, תכנון ביו-חומרים והנדסת רקמות, כדי להשיג אפיון מכני נכון של חומרים רכים ברזולוציה דומה לגודלם של תאים בודדים (μm). האסטרטגיה הפופולרית ביותר לרכישת נתונים ניסיוניים כאלה היא להשתמש במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM); בעוד שמכשיר זה מציע רזולוציה חסרת תקדים בכוח (עד pN) ובמרחב (תת-ננומטר), השימושיות שלו מוגבלת לעתים קרובות על ידי המורכבות שלו המונעת מדידות שגרתיות של אינדיקטורים אינטגרליים של תכונות מכניות, כגון מודולוס של יאנג (E). דור חדש של ננו-אינדנטרים, כגון אלה המבוססים על טכנולוגיית חישת סיבים אופטיים, צבר לאחרונה פופולריות בזכות קלות האינטגרציה שלו תוך שהוא מאפשר להפעיל כוחות תת-nN ברזולוציה מרחבית של מיקרומטר, ולכן הוא מתאים לחקור תכונות מכניות מקומיות של הידרוג'לים ותאים.

בפרוטוקול זה מוצג מדריך שלב אחר שלב המפרט את ההליך הניסויי לרכישת נתוני ננו-אינדנטנציה על הידרוג'לים ותאים באמצעות ננו-אינפנטר חישת סיבים אופטיים זמין מסחרית. בעוד שחלק מהצעדים הם ספציפיים למכשיר המשמש כאן, ניתן לקחת את הפרוטוקול המוצע כמדריך למכשירי ננו-אינדנטציה אחרים, שכן חלק מהצעדים מותאמים בהתאם להנחיות היצרן. יתר על כן, מוצגת תוכנת Python חדשה בקוד פתוח המצוידת בממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש לניתוח נתוני ננו-אינדנציה, המאפשרת סינון של עקומות שנרכשו באופן שגוי, סינון נתונים, חישוב נקודת המגע באמצעות הליכים מספריים שונים, חישוב קונבנציונלי של E, כמו גם ניתוח מתקדם יותר המתאים במיוחד לנתוני ננו-כניסה של תא יחיד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקידה הבסיסי של המכניקה בביולוגיה נקבע כיום 1,2. מרקמות שלמות לתאים בודדים, תכונות מכניות יכולות להודיע על המצב הפתופיזיולוגי של החומר הביולוגי הנחקר 3,4. לדוגמה, רקמת שד המושפעת מסרטן נוקשה יותר מרקמה בריאה, מושג המהווה את הבסיס למבחן המישוש הפופולרי5. יש לציין כי לאחרונה הוכח כי מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) הנגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) מודגשת על ידי שינויים בתכונות המכניות של תאי הדם, כולל ירידה בעיוות אריתרוציטים וירידה בנוקשות לימפוציטים ונויטרופילים בהשוואה לתאי דם של אנשים תמימי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מצעים/תאים למדידות ננו-אינדנטציה

  1. בצע את השלבים המפורטים בפרוטוקול המשלים להכנת הידרוג'לים/תאים של PAAm לניסויים בננו-אינדנטנציה. ההליך מסוכם באיור 2.
    הערה: הידרוג'לים של PAAm נבחרו מכיוון שהם ההידרוג'לים הנפוצים ביותר המשמשים בתחום המכנוביולוגיה. עם זאת, הפרוטוקול חל באותה מידה על כל סוג של הידרוג'ל25 (ראה דיון, שינויים בשיטה).

2. הפעלת המכשיר, בחירת הבדיקה וכיול הבדיקה

  1. בצע את השלבים המפורטים בפרוטוקול המשלים להפעלת המכשיר. לקבלת פרטים טכניים על פעולתם של ננו-אינדנטים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול, מתקבלת קבוצה של עקומות F-z. מערך הנתונים יכיל ככל הנראה עקומות טובות, ועקומות שיש להשליך לפני שתמשיך בניתוח. באופן כללי, יש למחוק עקומות אם צורתן שונה מזו המוצגת באיור 4A. איור 5AI מראה מערך נתונים של ~100 עקומות המתקבלות על הידרוג'ל PAAm רך של E 0.8 KPa35 הצפוי שהועלה בממשק המשתמש הגרפי של NanoPrepare GUI. רוב העקומות מציגות קו בסיס ברור ושטוח, אזור מעבר ואזור משופע שהוא פרופורציונלי לנוקשות הנראית לעי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מראה כיצד להשיג בחוזקה נתוני ננו-אינדנטנציה של ספקטרוסקופיית כוח באמצעות ננו-אינדנטר בעל ראש ברזל זמין מסחרית הן על הידרוג'לים והן על תאים בודדים. בנוסף, ניתנות הוראות לשימוש בתוכנת קוד פתוח המתוכנתת בפייתון הכוללת זרימת עבודה מדויקת לניתוח נתוני ננו-אינדנציה.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
השלבים הבאים זוהו כבעלי חשיבות מיוחדת בעת ביצוע פרוטוקול זה.

הכנת דוגמאות

חשוב מאוד שלפני התחלת המדידות, המדגם מוכן תוך התחשב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GC ו-MAGO מודים לכל חברי ה-CeMi. MSS מאשרת תמיכה באמצעות מענק תוכנית EPSRC (EP/P001114/1).

GC: תוכנה (תרומה לפיתוח תוכנה ואלגוריתמים), ניתוח פורמלי (ניתוח נתוני ננו-אינדנציה), ולידציה, חקירה (ניסויי ננו-אינדנציה בג'לים פוליאקרילאמידים), אוצרות נתונים, כתיבה (טיוטה מקורית, סקירה ועריכה), ויזואליזציה (איורים וגרפים). MAGO: חקירה (הכנת ג'לים ודגימות תאים, ניסויי ננו-אינדנטציה על תאים), כתיבה (טיוטה מקורית, סקירה ועריכה), הדמיה (איורים וגרפים). NA: אימות, כתיבה (סקירה ועריכה). IL: תוכנה (תרומה לפיתוח תוכנה ואלגוריתמים), ולידציה, כתיבה (סקירה ועריכה); MV

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 מ"מ כיסוייםVWR631-1577P
35 מ"מ כלי תרבית מטופלים בתאיםגריינר CELLSTAR627160
אקרילאמידסיגמא-אולדריץ'A4058
אקרילסילןאלפא AesarL16400
אמוניום פרסולפטמרק7727-54-0
ביסקרילאמידמרק110-26-9
קיארו ננו-אינדנטראופטיקה 11 חיים  אין מספר קטולוג
אתנולכללי
סרום בקר עובריGibco16140071
גלוקוז גבוה DMEMGibco11995065
איזופרופנולכללי
Kimwipeקימברלי קלארק21905-026
מיקרוסקופ זכוכית שקופיות VWR631-1550P
מערכת MilliQMerk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 אינטרפרומטראופטיקה11 חייםללא מספר קטלוגי
אופטיקה 11 בדיקת חיים (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)אופטיקה 11 חייםללא מספר קטולוג
אופטיקה 11 בדיקת חיים (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)אופטיקה 11 חייםללא מספר קטלוג
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140122
RainX דוחה גשםRainX26012
צלחות פטרי סטנדרטיות (90 מ"מ)Thermo Scientific101RTIRR
TetramethylethylenediamineSigma-Aldrich110-18-9
מייבש ואקוםThermo Scientific531-0250
<חזק>תוכנה
תוכנה לרכישת נתונים (גרסה 3.4.1)Optics 11 Life
GitHub Desktop (אופציונלי)Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code (אופציונלי)Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Gu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soft Matter NanoindentationNanoindentation WorkflowAtomic Force MicroscopyOptical Fiber NanoindenterYoung s ModulusMechanical PropertiesHydrogel StiffnessCell NanoindentationHertz ModelElasticity Spectra

Related Articles