הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63411

⸱

20 בדצמבר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

תקציר

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של הרקמות הביולוגיות במיקרו-סביבה הטבעית שלה המבוססת על רטט מולקולרי מהותי, ובכך מספקת כלי מושלם לחקר vivo של תהליכים ביולוגיים ברזולוציה תת-תאית. על ידי שילוב הדמיית פלואורסצנטיות נרגשת דו-פוטונית (TPEF) במיקרוסקופ SRS, הדו-מודאלי בהדמיית vivo של רקמות יכול לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי מנקודות מבט מרובות המסייעות בהבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות וכו '. בפרוטוקול וידאו זה, ההתקנה של מערכת מיקרוסקופ TPEF-SRS, כמו גם את שיטת הדמיית in vivo של חוט השדרה החייתי הוא הציג. חוט השדרה, כחלק ממערכת העצבים המרכזית, ממלא תפקיד קריטי בתקשורת בין המוח למערכת העצבים ההיקפית. נדן מיאלין, השופע בפוספוליפידים, מקיף ומבודד את האקסון כדי לאפשר הולכה מלוחה של פוטנציאל פעולה. בהדמיית vivo של נדן מיאלין בחוט השדרה חשוב ללמוד את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה. הפרוטוקול מתאר גם הכנה לבעלי חיים ושיטות הדמיה של vivo TPEF-SRS לרכישת תמונות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה.

מבוא

ראמאן מיקרוסקופיה1,2 מתגלה כשיטה רבת עוצמה ללא תוויות לדמות רקמות ביולוגיות המבוססות על התדרים האופייניים של קשרים כימיים שונים בביומולקולות. הודות ליכולת ההדמיה הלא פולשנית והמסתגלת היטב שלה, המיקרוסקופיה של ראמאן נמצא בשימוש נרחב להדמיית רכיבים מועשרים בשומנים ברקמות ביולוגיות כמו נדן מיאלין3,4,5, אדיפוציטים6,7 וטיפות שומנים בדם8,9,10 . אות פיזור ראמאן מגורה (SRS) שנרכש כרווח ראמאן מגורה (SRG) או אובדן ראמאן מגורה (SRL) הוא ללא רקע, מראה דמיון ספקטרלי מושלם פיזור ראמאן ספונטני 11,12. בנוסף, SRL ו- SRG תלויים באופן ליניארי בריכוז הניתוח, ומאפשרים ניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים9,11,13. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נרגשת דו-פוטונית (TPEF) נמצאת בשימוש נרחב להדמיה ביולוגית in vivo בשל יכולת החתך האופטית הטבועה בה, עומק החדירה העמוק והפוטוטוקסיות הנמוכה14,15,16. עם זאת, הביצועים של הדמיית TPEF תלויים במאפיינים של תגים פלואורסצנטיים, ומספר הצבעים הפתירים מוגבל עקב ספקטרום פלואורסצנטיות בפס רחב8,17,18,19. הדמיית SRS ללא תוויות והדמיה מבוססת פלואורסצנטיות TPEF הן שתי שיטות הדמיה משלימות, והשילוב ביניהן יכול לספק מידע ביופיסי וביוכימי בשפע של רקמות. שתי שיטות הדמיה אלה מבוססות שתיהן על התהליכים האופטיים הלא ליניאריים (NLO), המאפשרים אינטגרציה פשוטה במערכת מיקרוסקופ אחת. השילוב של הדמיית SRS ו- TPEF, מה שמכונה הדמיה דו-מודאלית, מאפשר הדמיה ופרופילים ממדיים גבוהים של תאים ורקמות, ומאפשר הבנה מקיפה של מערכות ביולוגיות מורכבות. באופן ספציפי, picosecond (ps) מיקרוסקופיה SRS יכול להשיג הדמיה כימית-קשר עם רזולוציה ספקטרלית גבוהה לעומת femtosecond (fs) SRS טכניקה11, המאפשר להבדיל בין רכיבים ביוכימיים מרובים ברקמה ביולוגית, במיוחד באזור טביעת האצבע הצפוף20,21. בנוסף, בהשוואה למערכת מיקרוסקופית אחרת של NLO הדו-מודאלית הנפוצה עם שילוב של מיקרוסקופ פיזור אנטי-סטוקס קוהרנטי (CARS), SRS מציג ביצועים מעולים למכוניות במונחים של פרשנות ספקטרלית ותמונה, כמו גם רגישות לזיהוי11. המיקרוסקופ SRS-TPEF שימש ככלי רב עוצמה לחקר מערכות ביולוגיות שונות, כגון Elegans Caenorhabditis9,22, מוח ראשן קסנופוס laevis5, מוח עכבר23,24, חוט השדרה25,26, עצב היקפי27, רקמת שומן7, וכו '.

חוט השדרה יחד עם המוח מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית (CNS). הדמיית הפעילות התאית במערכת העצבים המרכזית במערכת העצבים המרכזית ב-vivo בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים היא קריטית להבנת המנגנונים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית28,29,30 ולפיתוח טיפולים מקבילים31,32,33. נדן מיאלין, העוטף ומבודד אקסונים להולכה פוטנציאלית של פעולה במהירות גבוהה, ממלא תפקיד משמעותי בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. Demyelination נחשב כסימן היכר בהפרעות חומר לבן, כגון טרשת נפוצה34. בנוסף, לאחר פגיעה בחוט השדרה35, פסולת מיאלין יכולה לווסת את הפעלת המקרופאג ', התורמת לדלקת כרונית ולפציעה משנית36. לכן, בהדמיית vivo של נדן מיאלין יחד עם נוירונים ותאי גליה במודלים של עכבר חי הוא לעזר רב להבין את התהליכים הדינמיים בהפרעות במערכת העצבים המרכזית.

בפרוטוקול זה מתוארים הליכי ההתקנה הבסיסיים של מיקרוסקופ TPEF-SRS ביתי ומוכנסים המודאליות הכפולות בשיטות הדמיית vivo לחוט השדרה של העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים המבוצעים בעבודה זו מתנהלים על פי הנחיות מתקן בעלי החיים במעבדה של אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של HKUST. הכשרת בטיחות לטיפול בלייזר נדרשת כדי להגדיר ולהפעיל את מיקרוסקופ TPEF-SRS. תמיד ללבוש משקפי בטיחות לייזר עם טווח אורך גל מתאים בעת התמודדות עם לייזר.

1. התקנת המיקרוסקופ TPEF-SRS (לכיוונון סכמטי ראו איור 1)

  1. השתמש במתנד פרמטרי אופטי משולב (OPO) המחובר ללייזר סיבי Ytterbium נעול במצב כמקור לייזר PS להדמיית SRS.
    הערה: OPO מפיק קרן סטוקס (1031 ננומטר) וקרן משאבה (מ-780 ננומטר ל-960 ננומטר) עם משך פעימה של 2 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ. קרן סטוקס מווסתת במהירות של 20 מגה-הרץ על ידי אפנן אלקטרו-אופטי מובנה (EOM) לזיהוי SRS רגיש לפאזה בתדר גבוה ברמת MHz.
  2. השתמש fs טיטניום (Ti): לייזר ספיר כמקור לייזר להדמיית TPEF.
  3. השתמש בזוג עדשות (L1 ו- L2) כדי לאסוף ולהתאים את גודל קרן fs ל -3 מ"מ.
  4. השתמש בזוג עדשות (L3 ו- L4) כדי לאסוף את קרן הלייזר PS ולהרחיב את הקוטר שלה ל -3 מ"מ.
  5. שנה את הקיטוב של קרן הלייזר fs מקיטוב p לקיטוב באמצעות צלחת חצי גל.
  6. שלבו את שתי קרני הלייזר עם מפצל קרן מקוטב (PBS).
  7. הוסף זוג מראות גלוונומטר סריקת XY 3 מ"מ מאחורי PBS לסריקת קרן.
  8. השתמש בעדשת סריקה טלצנטרית (L5) ועדשת צינור מתוקנת אינסוף (L6) כדי להצמיד את מראה הסריקה ואת האישון האחורי של העדשה האובייקטיבית 25x. הרחב את קרן הלייזר על ידי עדשת הסריקה ועדשת הצינור כדי למלא את הצמצם האחורי של המטרה.
  9. מקם PBS או מראה דיכרואית (D2) בין עדשת הצינור לעדשה אובייקטיבית עבור אוסף אותות SRS או פלואורסצנטיות. השתמש סנפיר ממונע כדי לעבור בין PBS ו- D2.
    הערה: חלק מאות ה-SRS המפוזר לאחור אובד כאשר הוא עובר דרך ה-PBS כתוצאה מהקיטוב שהוזז באופן אקראי.
  10. השתמש בזוג עדשות (L7 ו- L9) כדי לצמצם את קרן האיתור ולהצמיד את האישון האחורי של העדשה האובייקטיבית 25x עם חיישן פוטודיודה.
  11. השתמש בזוג עדשות (L8 ו- L10) כדי לצמצם את קרן האיתור ולהצמיד את האישון האחורי של המטרה 25x עם משטח הזיהוי של הפוטומולטיפלייר (PMT).
  12. השתמש במראה דיכרואית (D3) כדי להפריד את נתיב הזיהוי של אותות פלואורסצנטיות ו- SRS.
  13. הנח ערכת מסננים (Fs1) מול גלאי הפוטודיודה כדי לחסום את הלייזר סטוקס ולהעביר את קרן המשאבה בלבד.
  14. מקם ערכת מסננים (Fs2) מול גלאי PMT כדי להעביר את אות הפלואורסצנטיות של היעד בלבד.
  15. חבר את ה- PMT למגבר הנוכחי להגברת אותות.
  16. חבר את הפוטודיוד למגבר נעילה.
  17. חבר את אות הסינכרון מפלט EOM המובנה לקלט ההפניה של מגבר הנעילה עבור הורדה בדרגה של אות SRS.
  18. חבר את מגבר PMT ואת יציאות מגבר הנעילה למודול רכישת הנתונים.

2. כיול מערכת מיקרוסקופ TPEF-SRS

  1. הפעלת הלייזרים
    1. החלף את מתג המפתח ממצב המתנה למצב פעיל כדי להפעיל את טי: לייזר ספיר והמתן 30 דקות עד שהלייזר יתחמם.
    2. הפעל את OPO על ידי לחיצה על לחצן התחל בלוח הבקרה של OPO והמתן 20 דקות עד שהלייזר יתחמם.
    3. לאחר שהלייזר PS מתחמם, השתמש בפוטודקטור במהירות גבוהה כדי לבדוק את עומק האפנון של קרן סטוקס. פתח את תריס הלייזר לקרן סטוקס. לחץ על התיבה הגדר צריכת חשמל OPO והזן 20. מקם את הפוטו-דקטור במהירות גבוהה בפלט OPO כדי לזהות את הקרן. חבר את יציאת היציאה של הפוטודטקטור ליציאת הקלט של אוסצילוסקופ באמצעות כבל קואקסיאלי עם מחבר כידון ניל-קונסלמן (BNC) לניטור פעימת הלייזר.
    4. פתח את החלון בקרת EOM בתוכנת בקרת OPO. התאם את העוצמה והפזה של EOM בהתאם לדיאגרמת עוצמת הדופק המוצגת באוסצילוסקופ כדי להשיג עומק אפנון מרבי של 20 מגה-הרץ.
      הערה: ביצועי EOM הם בדרך כלל יציבים ויש לבדוק אותם רק כאשר אות ה- SRS נמצא בירידה משמעותית.
  2. יישור אופטי של מיקרוסקופ TPEF-SRS המשולב
    1. בצע יישור אופטי עבור colocalization של קורות ps ו- fs כמתואר בשלבים 2.2.2 עד 2.2.13.
    2. פתח את תריס הלייזר של המשאבה תוך עצירת יציאת סטוקס בתוכנת הבקרה של OPO. השתמש בתוכנת בקרת OPO כדי להגדיר את אורך הגל של קרן המשאבה ל- 796 ננומטר על-ידי לחיצה על התיבה הגדר אות והזנת ערך אורך הגל 796. לחץ על התיבה הגדר POWER OPO והזן 20 כדי להגדיר את העוצמה שלה למינימום (~ 20 mW) ליישור אופטי.
    3. הפעל את מחשב המיקרוסקופ ואת כל הרכיבים האלקטרוניים המשויכים, כולל סורקים, מפעילים אובייקטיביים, פוטודיודות, PMTs, מגברים נוכחיים, מגברי נעילה וסנפירים ממונעים. הפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ.
      הערה: תוכנת בקרת המיקרוסקופ היא ממשק תוצרת בית.
    4. מקם שני לוחות יישור (P1 ו- P2 באיור 1) בנתיב האופטי. מניחים את P1 מאחורי PBS במרחק של כ-10 ס"מ ומניחים את P2 מאחורי P1 במרחק של כ-30 ס"מ.
      הערה: קורות ה-ps וה-fs משולבות באמצעות PBS (איור 1). שתי לוחות היישור משמשים לבדיקת היישור, כמו גם את colocalization של שתי קרני הלייזר.
    5. פתח את תריס המיקרוסקופ לקרן הלייזר של PS.
    6. התאם את המראה M1 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר ps בחור המעבר של P1. השתמש בטווח אינפרא-אדום (IR) כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P1 בעת התאמת המראה M1.
    7. התאם את המראה M2 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר ps בחור המעבר של P2. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P2 בעת התאמת המראה M2.
    8. חזור על שלבים 2.2.6 ו- 2.2.7 עד שמרכז קרן ps מאתר את החור העובר של שתי לוחות היישור. סגור את התריס של קרן ps בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.
    9. הגדר את אורך הגל של fs Ti: לייזר ספיר ב 740 ננומטר ולפתוח את תריס הלייזר. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 5 mW (נמדד ביציאת הקלט של מערכת המיקרוסקופ) ליישור אופטי.
    10. פתח את תריס המיקרוסקופ עבור קרן הלייזר fs.
    11. התאם את המראה M3 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר fs בחור המעבר של P1.
    12. התאימו את המראה M4 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר בחור המעבר של P2.
    13. חזור על שלבים 2.2.11 ו- 2.2.12 עד שמרכז קרן הלייזר fs מאתר את החורים העובריים של שני לוחות יישור. סגור את תריס המיקרוסקופ עבור קרן fs.
    14. בצע חפיפה מרחבית של המשאבה וקורות סטוקס כמתואר בשלבים 2.2.15 עד 2.2.18.
      הערה: למרות שהמשאבה וקורות סטוקס חופפות בערך בתוך לייזר ps, כוונון עדין של מיקומן של שתי קרני הלייזר נדרש כדי להשיג ביצועי SRS אופטימליים. מכיוון שקרן המשאבה מיושרת תחילה כפי שתואר קודם לכן, קרן סטוקס הבאה מותאמת לשיתוף פעולה עם קרן המשאבה.
    15. מקם מצלמה במיקום המטרה כדי לדמיין את המיקום של שני כתמי קרן. סמן את מיקום קרן המשאבה במסך המצלמה כהפניה.
    16. מקם לוח יישור P0 לפני L3 (איור 1). השתמש במקש כישוף כדי לכוונן את המראה האופטית 1 (OM1) כך שמרכז קרן סטוקס יעבור את חור הכניסה של לוח היישור וייצור colocalizes עם קרן המשאבה ביציאת יציאת הלייזר. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לאשר את מיקום נקודת הקרן ב-P0 במהלך ההתאמה.
      הערה: OM1 ו- OM2 הן שתי מראות בראש OPO כדי להתאים את המיקום של קרן סטוקס 1031 ננומטר.
    17. הסר את לוח היישור P0 ולהשתמש במקש כישוף כדי להתאים את OM2 כך מרכז קרן סטוקס colocalizes colocalizes עם סימן הייחוס של קרן המשאבה על המצלמה.
    18. חזור על שלבים 2.2.16 ו- 2.2.17 עד שקרן סטוקס חופפת לחלוטין עם קרן המשאבה הן במישורי P0 והן במישורי המצלמה.
      הערה: בעת הדמיה של כתמי הקרן במצלמה, יש להסיר את כל לוחות היישור מהנתיב האופטי.
  3. מטב את תנאי ההדמיה
    1. בצע התאמת פאזה של מגבר הנעילה כמתואר בשלבים 2.3.2. ל-2.3.7.
      הערה: זיהוי SRS מבוסס על ערכה רגישה לפאזה בתדר גבוה. לגילוי SRL, עוצמת קרן סטוקס מווסתת ב- 20 MHz ומגבר נעילה משמש להורדת האות. השלב וההיסט של מגבר הנעילה צריכים להיות מותאמים כדי להשיג את ניגודיות התמונה האופטימלית.
    2. פתח את תוכנת בקרת מגבר הנעילה.
    3. הגדר את אורך הגל של לייזר המשאבה ל 796 ננומטר ואת הכוח של המשאבה ואת קרן סטוקס להיות 15 mW ו 25 mW על המדגם, בהתאמה.
      הערה: הנה להשתמש בשמן זית עבור אופטימיזציה וכיול הדמיה SRS. פסגת ראמאן של שמן זית באזור פחמן-מימן היא 2863.5 ס"מ-1, המקבילה אורך הגל של קרן המשאבה ב 796 ננומטר.
    4. לאטום את שמן הזית במגלשה ולחבר נייר טישו מקופל לתחתית השקופית כדי לשפר את backscattering האות לגילוי epi-SRS. מניחים את דגימת שמן הזית על הבמה ומתאימים את המוקד של המטרה 25x על המדגם.
    5. השתמש בתוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה באופן הבא: 512 x 512 פיקסלים עבור 500 מיקרומטר x 500 μm שדה ראייה (FOV), 6.4 μs זמן השתהות פיקסלים. השתמש בתוכנת בקרת מגבר הנעילה כדי להגדיר את ערך קבוע הזמן כ- 10 μs, הקרוב לזמן ההשתהות של הפיקסלים.
    6. סרוק את קרן הלייזר מעל הדגימה. השתמש בתוכנת בקרת מגבר הנעילה כדי לכוונן את השלב (0-180°) בגודל צעד של 22.5° עד שעוצמת האות SRS תגיע למקסימום.
      הערה: במגבר נעילה אנלוגי זה, פלט האות הוא הרכיב בשלב, התלוי בשלב של אות ההפניה. השלב יכול להיות מותאם על ידי תוכנת בקרת מגבר נעילה עם רזולוציה של 11 °, המאפשר למקסם את האות שזוהה בתוך ~ 2%12. מגבר הנעילה יוצא מהפאזה לאחר שיבוש אות הסינכרון. יש להתאים מחדש את השלב בכל פעם שאות הסינכרון נוצר מחדש.
    7. סרוק את הדגימה עם תריס לייזר סגור. השתמש בתוכנת בקרת מגבר הנעילה כדי לכוונן את ערך ההיסט בגודל שלב של 1 mV עד שאות ה- SRS הממוצע קרוב לאפס.
      הערה: אות ה- SRS הממוצע מוערך כעוצמה הממוצעת של כל הפיקסלים בתמונת SRS, המחושבת באופן אוטומטי על-ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ. היסט שימושי לביטול אותות לא רצויים קוהרנטיים בשלבים.
    8. בצע מיטוב סינכרון זמני כמתואר בשלבים 2.3.9 עד 2.3.14.
    9. פתחו את תיבת הדו-שיח 'מנהל ההשהיה' (איור 2) בתוכנת בקרת OPO.
    10. סרוק את שמן הזית וכוון את שלב ההשהיה עד שאות SRS שמן הזית מגיע למקסימום.
      הערה: בפעם הראשונה של הדמיית SRS, כאשר השלב של מגבר הנעילה לא עבר אופטימיזציה, סינכרון זמני מותאם תחילה באופן גס כדי להמחיש את אות ה- SRS של המדגם לפני מיטוב השלב של מגבר הנעילה.
    11. הפסק את הסריקה ולחץ על לחצן הוסף נתונים בתיבת הדו-שיח של מנהל ההשהיה כדי להקליט את נתוני ההשהיה הנוכחיים.
    12. חזור על שלבים 2.3. 10 ו 2.3.11 עבור דגימות כימיות שונות באורכי גל שונים.
      הערה: חרוזי פוליסטירן, מים כבדים, 5-אתיניל-2′-deoxyuridine, גליצרול משמשים למדידת נתוני העיכוב ברצועות רטט שונות.
    13. בחר את התאמת הנתונים וההזמנה 5 בתיבת הדו-שיח מנהל ההשהיה כדי להתאים את נקודות הנתונים הנוכחיות לפונקציה הפולינומית מסדר חמישי. החל את הנתונים המותאמים על-ידי לחיצה על לחצן השתמש כמותאם אישית וסימון תיבת הסימון. שלב ההשהיה יותאם אוטומטית באורכי גל שונים בהתאם לעקומת ההשהיה המותאמת.
    14. שמור את כל נתוני ההשהיה בקובץ טקסט, שניתן לטעון לשימוש עתידי.

3. הכנה כירורגית של עכבר לפלואורסצנטיות ויוו והדמיה SRS

  1. חטאו את כל הכלים הנדרשים, כולל אזמלים, מספריים קפיציים, מלקחיים, כיסויים ורפידות גזה.
  2. לחטא את כל המשטחים, אשר יהיה נגע במהלך הניתוח עם 70% אתנול. לכסות את אזור העבודה של הספסל עם וילונות סטריליים. שים כרית חימום מתחת לוילון.
  3. השתמש Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 עכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטיות צהוב משופר (EYFP) בתאי עצב גנגליון שורש גב עבור הדמיה בחוט השדרה vivo . לשקול את העכבר ולגרום מרדים על ידי הזרקה תוך-אפריטונית (i.p.) של תערובת קטמין-קסילזין (87.5 מ"ג ק"ג-1 ו 12.5 מ"ג ק"ג-1).
  4. צבוט את הבוהן של העכבר כדי להבטיח הרדמה עמוקה. להשלים עם מחצית המינון המקורי של הרדמה במידת הצורך. יש למרוח משחה על עיני העכבר כדי למנוע יובש בקרנית.
  5. גילחו את השיער על הגב מעל עמוד השדרה החזי, ולאחר מכן הסירו לחלוטין את השיער באמצעות קרם depilating. לחטא את האזור המגולח עם תמיסת יוד.
  6. צור חתך קטן בקו האמצע (~ 1.5 ס"מ) של העור מעל חוליית T11-T13 עם אזמל.
  7. יש לכרות שרירים וגידים הן למעלה והן בצדדים של חוליית T11-T13 עם מספריים קפיץ ומלקחיים. חשוף את שלוש החוליות הסמוכות. השתמש רפידות גזה סטריליות מלוחים סטריליים מלוחים סטריליים כדי לשלוט בדימום ולנקות את האתר הניתוחי.
  8. ייצבו את עמוד השדרה בעזרת שני סרגלי הצד מפלדת אל-חלד בשלב ייצוב מעוצב בהתאמה אישית (איור 2B).
  9. השתמש במלקחיים מס' 2 כדי לבצע כריתת למינכטומיה ב-T12. בזהירות להשתמש במלקחיים כדי לשבור את lamina חתיכה אחר חתיכה עד הלמינה כולה של חוליית T12 מוסר.
  10. לשטוף את הדם מעל חוט השדרה עם תמיסת מלח סטרילית ולהשתמש כרית גזה לספוג נוזל מוגזם. הפעל לחץ על אתר הדימום עם חתיכת כרית גזה כדי לשלוט בדימום.
  11. מניחים כיסוי (22 x 22 מ"מ) על מוט ההידוק וממלאים את החלל הבין-מרחב בין כיסוי לחוט השדרה בתמיסת מלח.

4. in vivo TPEF-SRS הדמיה של חוט השדרה של העכבר

  1. הרם את שלב הייצוב על שלב חמישה צירים מתחת למיקרוסקופ TPEF-SRS.
    הערה: שלב חמשת הצירים מאפשר תרגום תלת-צירי ותנועת כיפוף ±5° גובה וגליל.
  2. אבטחו את ראש העכבר עם שני מוטות ראש והנמיכו את לוח האחיזה כדי להציע מספיק מקום לתנועת החזה במהלך הנשימה, תוך הקלה על ממצאי תנועה.
  3. הכנס משטח חימום מתחת לעכבר כדי לשמור על חום העכבר במהלך ההדמיה.
  4. התאם את שלב התרגום z כדי לכוונן את המוקד עד שניתן יהיה לראות את תמונת השדה הבהיר של כלי הדם של חוט השדרה תחת מטרה של פי 10.
  5. אתר את וריד הגב של חוט השדרה במרכז ה- FOV על-ידי כוונון השלב התרגומי הדו-צירי של שלב חמשת הצירים.
  6. כוונן את זוויות הגליל וההגשה של שלב חמשת הצירים כדי להתאים את פני השטח הגביים של חוט השדרה בניצב לציר המטרה בהתבסס על תמונת השדה הבהיר.
  7. החלף את 10x עם יעד טבילת מים 25x להדמיית TPEF-SRS.
  8. הגדר את אורך הגל של קרן fs ל 920 ננומטר. כוונן את כוח קרן fs להיות 10 mW על המדגם.
  9. הגדר את אורך הגל של קרן המשאבה ל- 796 ננומטר. כוונן את העוצמה של המשאבה ואת קרן סטוקס להיות 60 mW ו 75 mW על המדגם, בהתאמה.
    הערה: הדמיית חוט השדרה SRS מבוצעת במספר הגלים של 2863.5 ס"מ-1, אשר תואם את פסגת ראמאן של נדן מיאלין באזור פחמן-מימן בהתבסס על ספקטרום SRS נמדד7,9. כוח הלייזר נקבע כדי להבטיח הדמיית TPEF-SRS ברזולוציה גבוהה של חוט השדרה. נזק לרקמות אינו נצפה בתנאי ההדמיה הנוכחיים.
  10. להדמיית SRS, בחרו PBS מעל המטרה באמצעות סנפיר ממונע על ידי לחיצה על כפתור ההחלפה המחובר לסנפיר הממונע.
  11. הגדר את הפרמטרים הדמיה כדלקמן: 512 x 512 פיקסלים עבור 150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר FOV, 3.2 μs זמן השתהות פיקסל, 2 μs זמן קבוע.
  12. התחל לסרוק את המדגם והגדר את המוקד על פני השטח הגביים של חוט השדרה.
  13. כוונן היטב את שלב ההשהיה על-ידי תוכנת בקרת OPO עד להשגת אות SRS מרבי לחוט השדרה.
    הערה: דגימות ביולוגיות יכולות לגרום לפיזור כרומטי נוסף, ייתכן ששלב ההשהיה ידרוש התאמה כדי למטב את הסינכרון הזמני. עם זאת, כאשר הדמיית SRS מבוצעת ליד פני השטח העליונים של הרקמה, ההבדל הזמני של שני פולסים לייזר הציג על ידי הרקמה הביולוגית ואת חלון ההדמיה הוא בדרך כלל קטן (פחות מכמה מאות fs).
  14. להדמיית TPEF, בחר מראה D2 dichroic מעל המטרה באמצעות סנפיר ממונע על ידי לחיצה על כפתור מתג המחובר לסנפיר הממונע.
  15. הגדר את פרמטרי ההדמיה והתחל לסרוק את הדגימה. כדי ללכוד את מחסנית התמונות TPEF-SRS, רכשו את התמונות TPEF ו- SRS ברצף עם מרווח של 1 s באותו עומק לפני המעבר לעומק הבא. פרמטרי ההדמיה עבור הדמיית TPEF הם 512 x 512 פיקסלים, 150 מיקרומטר x 150 מיקרומטר FOV, זמן השתהות פיקסלים של 3.2 μs.
  16. הסר את החיה משלב הייצוב לאחר איסוף כל התמונות.
  17. נקו את הרקמה החשופה על ידי שטיפה של תמיסת מלח וספגו את הנוזל העודף באמצעות כרית גזה. החל ג'ל סיליקון על חוט השדרה החשוף ולחכות ~ 5 דקות עד שהוא מקבל נרפא.
  18. תפרו את העור עם תפר כירורגי מס' 6-0 כדי לסגור את הפצע. החל קרם כוויות על העור של האתר הניתוחי כדי למנוע זיהום. מתן טיפול משכך כאבים תת עורית (0.1 מ"ג / קילוגרם buprenorphine).
  19. מניחים את החיה בכלוב נקי ומניחים את הכלוב על כרית חימום עד שהעכבר מתאושש לחלוטין מהרדמה.
  20. חזור על ניהול משככי כאבים כל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח.
  21. סגור את התריס של OPO ולייזר fs. הגדר את כוח המשאבה ואת קרן סטוקס למקסימום.
    הערה: הגדרת עוצמה מרבית לפני כיבוי הלייזר מועילה לתחזוקת הלייזר.
  22. הגדר את אורך הגל של קרן המשאבה ואת fs לייזר ל 800 ננומטר.
  23. הגדר את שני הלייזרים במצב המתנה, סגור את כל תוכנות בקרת האלקטרוניקה וכבה את כל הציוד המשויך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה דו-מודאלית של אקסונים בעמוד השדרה, כמו גם נדן מיאלין, מתבצעת באמצעות העכברים הטרנסגניים Thy1-YFPH, המבטאים EYFP בתאי עצב של גנגליון שורש גב (איור 3). נוירונים אלה המסומנים כמתויגים מעבירים את המידע החושי מהעצב ההיקפי לחוט השדרה, כאשר הענף המרכזי ממוקם בעמוד הגב של חוט השדרה. עם מיקרוסקופ TPEF-SRS, נדן מיאלין מבוזר בצפיפות ניתן לדמיין בבירור באמצעות הדמיית SRS ללא תוויות, ו אקסונים YFP בדלילות שכותרתו YFP ניתן לראות באמצעות הדמיה TPEF. בהדמיה הכפולה מתגלה כי האקסונים עטופים היט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, ההתקנה הבסיסית של מיקרוסקופ TPEF-SRS מתוארת בפירוט. עבור הדמיית SRS, המשאבה וקורות סטוקס חופפות זמנית ומרחבית בתוך OPO. עם זאת, חפיפה זו יכולה להיות משובשת לאחר שעבר דרך מערכת המיקרוסקופ. לכן, הן אופטימיזציה מרחבית והן אופטימיזציה זמנית של colocalization של המשאבה וקורות סטוקס הוא הכרחי וקריטי להשגת הדמיית SRS אופטימלית. העיכוב הזמני בין המשאבה לקרן סטוקס קשור להבדל הנתיב האופטי של שתי הקורות, אשר נקבע על ידי פיזור של אלמנטים אופטיים במערכת המיקרוסקופ38. כאשר אורך הגל של קרן המשאבה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף ואין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת מענקי המחקר של הונג קונג באמצעות מענקים 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, ועדת החדשנות והטכנולוגיה (ITCPD/17-9), תחום תוכנית המצוינות של ועדת המענקים של האוניברסיטה (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12), ואוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) באמצעות מענק RPC10EG33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#2 מלקחייםDumont11223-20לכריתת למינקטומיה
10X אובייקטיביNikonCFI Plan Apo Lambda 10X
25X אובייקטיביאולימפוסXLPLN25XSVMP2
קרם לשרוף מצלמתבטדין
סוניואלפא; 6300
מגבר זרםמחקר סטנפורדSR570
מודולי פוטו-מכפיל זרםHamamatsuH11461-01
D2 665 ננומטר מראה דיכרואית ארוכת מעברSemrockFF665-Di02-25x36להכוונת אות אפי-פלואורסצנטי למודול הזיהוי
D3 700 ננומטר מראה דיכרואית קצרת מעבראדמונד69-206להפרדת SRS מ נתיב זיהוי TPEF
קרם אפילציהVeet
FS1 975 ננומטר מסנן מעבר קצראדמונד86-108לחסימת קרן סטוקס
FS1 מסנן פס פסSemrockFF01-850/310לחסימת סטוקס קרן
Fs2 מסנן פס פסSemrockFF01-525/50לבחירת אות YFP
Fs2 מסנן מעבר קצרSemrockFF01-715/SP-25לחסימת קרן לייזר עירור fs
צלחת חצי גלThorlabsSAHWP05M-1700
גלאי פוטו מהירMenloSystemsFPD 310-Fלבדיקת אפנון קרן סטוקס
יודבטדין
IR היקףFJWFIND-R-SCOPE מציג אינפרא אדום 2X ערכת דגם 84499C2X
איריסThorlabsCPA1
L1ThorlabsAC254-060-B-ML
L10ThorlabsLA4052-A
L2ThorlabsLA1422-B
L3ThorlabsAC254-050-B
L4ThorlabsAC254-060-B-ML
L7f=100 מ"מ, ציפוי AB
L8ThorlabsLA4874-A
L9ThorlabsAC254-035-B-ML
מגבר נעילהAPE
מראהThorlabsPF10-03-P01
סנפיר ממונעThorlabsMFF101/M
כרטיס רכישה רב תכליתימכשיר לאומיPCIe-6363
אוסילוסקופTektronixTDS2012C
פוטודיודהAPEלזיהוי אות SRS
מקור לייזר פיקו-שנייהAPEpicoEmerald
מפצל קרן מקטבThorlabsCCM1-PBS252/M
מד כוחניופורט843-R
מלחבראון
עדשת סריקה L5ThorlabsSL50-CLS2
מראה סריקהקיימברידג' טכנולוגיה6215H
ג'ל סיליקוןWorld Precision Inc.KWIK-SIL
Ti: ספיר fs לייזרקוהרנטיזיקית Ultra II
עדשת צינור L6ThorlabsTTL200-S8

מקורות

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283(2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012(2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005(2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894(2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715(2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501(2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109(2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008(2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084(2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530(2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691(2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SRSTPEF
In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.