הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי
במאמר זה
סיכום
תקציר
הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר עופות היא קרום דק, חוץ-עובריוני, המתפקד כאיבר נשימה ראשוני. תכונותיו הופכות אותו למודל ניסויי מצוין של in vivo לחקר אנגיוגנזה, גידול גידולים, מערכות אספקת תרופות או אבחון פוטודינמי (PDD) וטיפול פוטודינמי (PDT). יחד עם זאת, מודל זה נותן מענה לדרישה להחלפת חיות הניסוי בחלופה מתאימה. עובר מעובד לשעבר מאפשר יישום חומרים קלים, גישה, ניטור ותיעוד. הנפוץ ביותר הוא צ'יק CAM; עם זאת, מאמר זה מתאר את היתרונות של CAM שליו יפני כמודל בעלות נמוכה ותפוקה גבוהה. יתרון נוסף הוא ההתפתחות העוברית הקצרה יותר, המאפשרת תחלופה ניסיונית גבוהה יותר. ההתאמה של CAM שליו עבור PDD ו- PDT של סרטן וזיהומים מיקרוביאליים נחקרת כאן. כדוגמה, מתואר השימוש בהיפריצין פוטוסנסיטייזר בשילוב עם ליפופרוטאינים או ננו-חלקיקים כמערכת משלוח. נקבע ציון הנזק מתמונות באור לבן ושינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של רקמת CAM תחת אור סגול (405 ננומטר), יחד עם ניתוח של קטעים היסטולוגיים. CAM שליו הראה בבירור את ההשפעה של PDT על כלי הדם והרקמות. יתר על כן, ניתן היה לראות שינויים כמו דימום נימי, פקקת, תזה של כלי דם קטנים ודימום של כלי דם גדולים יותר. שליו יפני CAM הוא מודל מבטיח in vivo לאבחון פוטודינמי ומחקר טיפול, עם יישומים במחקרים של אנגיוגנזה של גידול, כמו גם טיפול אנטי-וסקולרי ואנטי-מיקרוביאלי.
מבוא
מודל קרום העוף הכוריאלנטואי (CAM) ידוע ונמצא בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים. זהו איבר אקסטרה-אמבריוני עשיר בכלי הדם המספק חילופי גזים והובלת מינרלים1. בשל השקיפות והנגישות של קרום זה, כלי דם בודדים ושינויים מבניים שלהם ניתן לראות בזמן אמת2. למרות היתרונות, ל-Chick CAM יש גם כמה מגבלות (למשל, מתקני רבייה גדולים יותר, ייצור ביצים וצריכת מזון) שניתן להימנע מהן על ידי שימוש במיני עופות אחרים. בפרוטוקול זה מתואר מודל ex ovo CAM חלופי המשתמש בעובר שליו יפני (Coturnix japonica). בשל גודלו הקטן, הוא מאפשר שימוש במספר גדול בהרבה של אנשים ניסיוניים מאשר עוף CAM. יתר על כן, ההתפתחות העוברית הקצרה יותר של 16 יום של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות. כל הציוד והריאגנטים חייבים להיות אוטומטיים או מעוקרים עם 70% אתנול או אור UV.
1. דגירה של ביצים
- אחסנו ביצי שליו מופרות בטמפרטורה של 10-15 מעלות צלזיוס למשך 4-5 ימים לכל היותר לפני תחילת הדגירה. יש להשתמש רק בביצים נקיות ולא פגומות.
- לדגור את הביצים באינקובטור דראפט כפוי במשך ~ 53-54 שעות. מטילים את הביצים בצורה אופקית כאשר סיבוב הביצים כבוי, בלחות של 50%-60% ובטמפרטורת דגירה של 37.5 מעלות צלזיוס.
2. הכנת תרבות אובו לשעבר
הערה: לאחר הדגירה הראשונית, הביצים מתאימות להתחלת טיפוח האקס-א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לוקליזציה של הגידול על פני השטח CAM קשה באור לבן. פוטוסנסיטייזר (כאן, היפריצין) המשמש ב- PDD צפוי להיקלט באופן סלקטיבי על ידי הגידול ומסייע לדמיין את הגידול. תוספת של היפריצין והשימוש באור פלואורסצנטי (למשל, 405 ננומטר) הראו את מיקום הגידול (קרצינומה של תאי קשקש TE1) בצורה טובה מאוד (איור 6A). ניתוח היסטולוגי הראה כי תאי גידול חיוניים פולשים לרקמות בריאות. מבנים קונצנטריים של תאי קשקש לא תקינים, המתוארים לעתים קרובות ברקמת קרצינומה של תאי קשקש (פניני קרטין), נראו לעין (א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לטיפוח מוצלח של ex ovo , חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול לעיל. יתר על כן, אם הביצים לא נפתחות בזהירות מספקת או שאין לחות מספקת במהלך הטיפוח, שק החלמון נדבק לקליפה ולעתים קרובות נקרע. תחילתו של גידול אובו לשעבר בזמן של כ -60 שעות של דגירה ביצה מבטיחה את שיעור ההישרדות הגבוה של העוברים, שכן הם כבר גדולים מספיק כדי לשרוד את הטיפול. בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר, ה- CAM הופך דק יותר ונצמד לקליפת הביצה, מה שמוביל לקרעים בממברנה.
מיום הדגירה 7 ואילך, העוברים פחות רגישים לתסיסה; אזור CAM .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
העבודה נתמכה על ידי VEGA 2/0042/21 ו- APVV 20-0129. תרומתו של V. Huntošová היא תוצאה של יישום הפרויקט: קהילה מדעית פתוחה למחקר בינתחומי מודרני ברפואה (ראשי תיבות: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 הנתמכת על ידי התשתית המשולבת של התוכנית התפעולית, במימון ERDF.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת תרבית תאים 6 בארות | Sarstedt | 83.392 | פוליסטירן שקוף, |
| חממת CO2 סטרילית ESCO CCL-0508 | ESCO, סינגפור | CCL-050B-8 | CO2 חממת תרבית תאים |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, ארה"ב | ||
| מצלמה דיגיטלית Canon EOS 6D II | Canon, יפן | ||
| דיודה לייזר 405 ננומטר | אופטיקה אוקיינוס, ארה"ב | ||
| DMSO | סיגמא-אולדריץ' | 67-68-5 | דימתיל סולפוקסיד |
| אאוזין | סיגמא-אולדריץ' | 15086-94-9 | |
| אתנול | סיגמא-אולדריץ' | 64-17-5 | |
| מברשת עדינה בגודל 2 מברשת | 281802 Faber-Castell | להפרדה ומניפולציה של CAM | |
| גלוטרלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | 111-30-8 | |
| המטוקסילין | סיגמא-אולדריץ' | 517-28-2 | |
| היפריצין | סיגמא-אולדריץ' | 84082-80-4 | |
| חממה Bios Midi | Bios Sedl any, צ'כיה | חממת טיוטה כפויה לחממת דגירה ראשונית | |
| Memmert IF160 | Memmert, גרמניה | חממת זרימת אוויר כפויה לחממת CAM | |
| Kaiser slimlite plano, תיבת אור LED | קייזר, גרמניה | 2453 | Transilluminator |
| אור LED 405 ננומטר | בהתאמה אישית עגולה אור | ||
| LED עדשת מאקרו Canon MP- E 65 מ"מ f/ 2.8 | Canon, יפן | ||
| מיקרוסקופ Kapa 2000 | Kvant, סלובקיה | מיקרוסקופ אופטי | |
| מיקרוטום Auxilab 508 | Auxilab, ספרד | מיקרוטום סיבובי ידני | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | מדיום פרפין להטמעת רקמות |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | מספריים מאגר מלח פוספט |
| Castroviejo | Orimed | OR66-108 | מספריים מיקרו לתוכנת הפרדת CAM |
| ImageJ 1.53 | פתרון מלאי של תוכנית עיבוד וניתוח תמונה | הציבור | |
| HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | מלאי ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה |
| LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה |
| Tissue-Tek O.C.T. תרכובת | Sakura Finetek | 4583 | תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית 118 מ"ל בקבוקי סחיטה |
מקורות
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
