Micro-CT הוא כלי לא הרסני שיכול לנתח מבנים צמחיים בתלת מימד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת הדגימה כדי למנף מיקרו-CT לניתוח מבנה ותפקוד צמחים טפיליים. מינים שונים משמשים כדי להדגיש את היתרונות של שיטה זו בשילוב עם תכשירים ספציפיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח
במאמר זה
סיכום
תקציר
סריקת מיקרו-CT הפכה לכלי מבוסס בחקירת מבנה ותפקוד הצמח. טבעו הלא הרסני, בשילוב עם האפשרות של הדמיה תלת מימדית וחתך וירטואלי, איפשר ניתוח חדשני ומפורט יותר ויותר של איברי צמח מורכבים. ניתן לחקור גם אינטראקציות בין צמחים, כולל בין צמחים טפיליים לפונדקאים שלהם. עם זאת, הכנת הדגימה לפני הסריקה הופכת להיות קריטית בשל האינטראקציה בין צמחים אלה, אשר לעתים קרובות שונים בארגון הרקמה ובהרכבה. יתר על כן, יש לקחת בחשבון את המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים, החל מגופי צומח מצומצמים מאוד ועד עצים, עשבי תיבול ושיחים, במהלך הדגימה, הטיפול וההכנה של חומר פונדקאי טפיל. כאן מתוארות שתי גישות שונות להחדרת תמיסות ניגוד לטפיל ו/או לצמחים פונדקאים, תוך התמקדות בניתוח האוסטוריום. איבר זה מקדם חיבור ותקשורת בין שני הצמחים. בעקבות גישה פשוטה, ניתן לחקור פרטים על ארגון רקמת האוסטוריום באופן תלת-ממדי, כפי שמוצג כאן עבור מינים טפיליים של אופיטואידים, גפנים ודבקונים. בחירת חומרי ניגוד ספציפיים וגישות יישום מאפשרות גם תצפית מפורטת על התפשטות אנדופרזיט בגוף הפונדקאי ואיתור קשר ישיר בין כלי דם לכלי דם בין טפיל לפונדקאי, כפי שמוצג כאן עבור טפיל שורש מחייב. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול הנדון כאן על המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים כדי לקדם את הבנת התפתחותם, מבנהם ותפקודם.
מבוא
טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (micro-CT) היא שיטת הדמיה שבה צילומי רנטגן מרובים (הקרנות) של דגימה נרשמים מזוויות צפייה שונות ומשמשים מאוחר יותר כדי לספק שחזור וירטואלי של המדגם1. לאחר מכן ניתן לנתח, לתפעל ולפלח אובייקט וירטואלי זה, המאפשר חקירה לא הרסנית בשלושה ממדים2. מיקרו-CT, שתוכנן בתחילה עבור ניתוחים רפואיים ומאוחר יותר עבור יישומים תעשייתיים, מציע גם את היתרון של הדמיה של איברים פנימיים ורקמות ללא צורך בהליכים פולשניים3. כמו צורות אחרות של הדמיה, מיקרו-CT עובד עם פשרה בין שדה הראייה לגודל הפיקסל, מה שאומר שהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות גדולות היא כמעט בלתי מושגת
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בחירת דגימת צמחים טפיליים
- אספו את כל האוסטוריום של הצמח הטפילי, כולל הגבעול/שורש הפונדקאי המצורף ומקטעים של שני הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של האיבר המארח הטפילי; האורך האידיאלי של כל קטע שווה להכפיל את קוטר האוסטוריום.
הערה: עבור האוסטוריה לטרלית, כלול חלק מגבעול/שורש האם של הטפיל שממנו נוצר ההאוסטוריום (איור 1A,B,D). עבור אנדופרזיטים, אספו מקטע של הגבעול/שורש הפונדקאי שבו נראים סימנים של הטפיל (איור 1B). במקרה של חיבורי טרמינל, יש לאסוף את כל הצמח (איור 1E). - השקיעו את כל הדגימה בתמיסה מקבעת (לדוגמה, FAA) ביחס נפחי ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האוסטוריום של צמחים טפיליים הוא איבר מורכב המורכב מרקמות וסוגי תאים שונים המשתלבים ומתחברים לרקמות של צמח אחר, המשמש כפונדקאי20. ניתן למנף סריקת מיקרו-CT כדי להבין טוב יותר את המבנה המורכב הזה בדרך לא הרסנית ותלת ממדית בעת ניתוח האוסטוריה קטנה (איור 1A-C) וגדולה (איור 1D,E). לשם כך, ניתן ליישם פתרונות מנוגדים בממשק הטפיל-פונדקאי, ובכך לאפשר לנתח דגימות שאחרת היו בעלות ספיגת קרני רנטג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש בתמיסות מתכות כבדות לשיפור הניגודיות של רקמות הצמח הפך לשלב מכריע בהכנת הדגימות לניתוח מיקרו-CT. מספר תרכובות הזמינות בדרך כלל במעבדות מיקרומורפולוגיה של צמחים נבדקו על ידי Staedler et al., אשר ממליצים להשתמש phosphotungstate כסוכן היעיל ביותר בחדירה דגימות והגדלת מדד הניגוד8. תוצאות שהתקבלו כאן בניתוח של haustorium של P. pubera מאששות המלצה זו. במונחים של יישום ניגוד, Steadler et al. מתארים כי פתרון הניגוד חדר באופן פסיבי דרך החומר המנותח (פרחים וניצני פרחים הנעים בין 1 מ"מ ל -10 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחבר אין מה לחשוף.
תודות
ברצוני להודות לד"ר סימון גומז פריירה (מעבדה למיקרוטומוגרפיה, אוניברסיטת סאו פאולו, ברזיל) ולד"ר גרג לין (המרכז למערכות ננומטריות, אוניברסיטת הרווארד, ארה"ב) על עזרתם החשובה ביותר והדרכת המשתמשים החיונית שלהם עבור מערכות מיקרוטומוגרפיה שונות ותוכנות ניתוח נתונים. אני מודה גם לצוות בחממת EEB באוניברסיטת קונטיקט (ארה"ב), במיוחד לקלינטון מורס ומתיו אופל על שסיפקו את הדגימות של Viscum minimum. ד"ר ג'ון ונצל סיפק את ההזדמנות ועזרה רבה לדגימה של Pyrularia pubera. MSC. קרולינה בסטוס, MSc. יסמין היראו וטליתה מוטה עזרו מאוד בדגימה של פטריות סקיבליום. אריאדנה פורטדו, וד"ר פרננדה אוליביירה וד"ר מריה אלין נבס סיפקו את ההתייחסות לשימוש בפלוקסין B לניתוח פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
P. pubera
3D מיקרוסקופ רנטגן + A2:D22 Zeiss Versa 620 משמשת לסריקת המין CT-Pro תוכנת תלת מימד Nikon גרסה XT 3.1.11 משמשת לשחזור תלת מימדי של סריקות תוכנת CT-Vox Bruker ORS SPLab סריקה סריקה
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת מיקרוסקופ רנטגן תלת-ממדי (XRM) | Zeiss Versa 620 | המשמשת לסריקת Pyrularia pubera | |
| גרסה 3.3.1 | משמשת לניתוחים ורכישה של תמונות וסרטונים | ||
| תוכנת שפירית | מערכות מחקר אובייקטים - | גרסת | משמשת לניתוחים ורכישה של תמונות וסרטונים |
| בקבוקוני זכוכית | בקבוקוני זכוכית בע"מ SE | V2708C-FM-SP | נמכר על ידי VWR - ארה"ב; ודא שהבקבוקונים מסוגלים לעמוד בוואקום בסביבות 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | גרסה XT 3.1.11 | משמש לשליטה במערכת Nikon X-Tek HMXST225 |
| תמיסת יוד 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | נמכר על ידי VWR - ארה"ב |
| עופרת חנקתית II PA 500 גרם | Vetec | 361.08 | נמכר על ידי סורק |
| מיקרוטומוגרפיה | Bruker | Skyscan1176 | משמש לסריקת המין C. americana, S. martianus, וS. fungiforme |
| סורק מיקרוטומוגרפיה | Nikon | X-Tek HMXST225 | משמש לסריקת המינים V. minimum |
| NRecon software | Bruker | גרסה 1.0.0 | משמש לשחזור תלת מימדי |
| חומצה פוספוטונגסטית הידרט 3% בתמיסה מימית | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 101410-756 | נמכר על ידי VWR - ארה"ב |
| סרט פלסטיק (Parafilm) | הית'רו סיינטיפיק | PM996 | נמכר על ידי VWR - ארה"ב |
| פלסטיק IV שקית 500 מ"ל | Taylor | 3478 | נמכר על ידי Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| צינורות PVC 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | נמכר על ידי VWR - ארה"ב |
| מערכת | Nikon X-Tek HMXST225 | המשמשת לסריקת Viscum מינימום | |
| מערכת | Bruker Skyscan 1176 | המשמשת לסריקת C. americana | |
| >Scout-and-ScanTM תוכנה | Zeiss | גרסה 16 | משמשת לשליטה במערכת Zeiss Versa 620 ולשחזור תלת מימדי של סריקות |
| שסתום תלת כיווני | ToToT | DMTWVS-5 | נמכר על ידי אמזון ארה"ב |
| מזרק דו-חלקי | HSW Henke-Ject | 4850001000 | בשימוש ללא קלסר |
| תא הבוכנה | 80080-434 | נמכר על ידי VWR - ארה"ב; כולל משאבה וצינורות חיבור | |
| תוכנת VG Studio Max | Volume Graphics | גרסה 3.0 | משמש לניתוחים ורכישת תמונות וסרטונים |
מקורות
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
