מאמר שיטה

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

DOI:

10.3791/63442

⸱

15 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלאוקומה, הגורם השני המוביל לעיוורון בעולם, היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות עיניות המאופיינות בנזק מבני לעצב הראייה ולניוון תאי גנגליון רשתית (RGC), וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של הראייה על ידי הפרעה בהעברת מידע חזותי מהעין למוח. לחץ תוך עיני מוגבר הוא גורם הסיכון החשוב ביותר; לפיכך, מספר מודלים של יתר לחץ דם עיני פותחו במכרסמים על ידי גישות גנטיות או ניסיוניות כדי לחקור את הגורמים וההשפעות של המחלה. בין אלה, דווחו מגבלות מסוימות כגון פולשניות כירורגית, הערכה תפקודית לא מספקת, דרישה להכשרה מקיפה והרחבה משתנה מאוד של נזק לרשתית. העבודה הנוכחית מאפיינת שיטה פשוטה, זולה ויעילה לגרימת יתר לחץ דם עיני במכרסמים, המבוססת על צריבה בטמפרטורה נמוכה ובמעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית, מרכיב מרכזי בניקוז הומור מימי. המודל החדש מספק יתר לחץ דם עיני תת-חריף קל מבחינה טכנית, לא פולשני וניתן לשחזור, הקשור ל-RGC מתקדם וניוון עצבי הראייה, ושיעור התאוששות קליני ייחודי לאחר הניתוח המאפשר מחקרים פונקציונליים in vivo בשיטות אלקטרופיזיולוגיות והתנהגותיות כאחד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הספרות הרפואית מבינה את הגלאוקומה כקבוצה הטרוגנית של נוירופתיות אופטיות המאופיינות בניוון מתקדם של תאי גנגליון רשתית (RGCs), דנדריטים, סומא ואקסונים, וכתוצאה מכך כוסות רוח מבניות (חפירה) של דיסק הראייה והידרדרות תפקודית של עצב הראייה, מה שמוביל לאמאורוזיס במקרים בלתי מבוקרים על ידי הפרעה להעברת מידע חזותי מהעין למוח1. גלאוקומה היא כיום הגורם השכיח ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם, צפויה להגיע לכ -111.8 מיליון אנשים בשנת 20402, ובכך להשפיע עמוקות על איכות החיים של החולים (QoL) ולהוביל לדאגות סוציו-אקונומיות משמעותיות3.

לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) הוא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר והיחיד הניתן לשינוי להתפתחות והתקדמות של גלאוקומה. בין סוגים מרובים של גלאוקומה, כולם, למעט גלאוקומה מתח נורמלי (NTG), קשורים IOP גבוה בזמן כלשהו בהיסטוריה הקלינית של המחלה. למרות התקדמות קלינית וכירורגית יוצאת דופן כדי להתמקד IOP ולהאט או לעצור את התקדמות המחלה, חולים עדיין לאבד את הראייה עקב גלאוקומה 4,5. לכן, הבנה מעמיקה של הפתופיזיולוגיה המורכבת והרב-תכליתית של מחלה זו היא הכרחית לפיתוח טיפולים יעילים יותר, במיוחד כדי לספק הגנה עצבית ל- RGCs.

בין מגוון גישות ניסיוניות להבנת מנגנוני המחלה, מודלים של בעלי חיים המבוססים על יתר לחץ דם עיני (OHT) דומים ביותר לגלאוקומה אנושית. מודלים של מכרסמים שימושיים במיוחד מכיוון שהם זולים, קלים לטיפול, ניתנים למניפולציה גנטית, בעלי תוחלת חיים קצרה, ומציגים תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות עיניות דומות לבני אדם, כגון ייצור הומור מימי וניקוז 6,7,8,9,10,11,12,13 . המודלים המשמשים כיום כוללים טרשת נפוצה של הרשת הטרבקולרית בעקבות הזרקת מי מלח היפרטוניים לורידים אפיסקרליים14, הזרקה תוך-מצלמה של מיקרו-כדוריות15 או חומרים ויסקו-אלסטיים 16, צריבה של וורידי מערבולת 17, פוטוקואגולציה של הרשת הטרבקולרית עם לייזר ארגון 18, תפר היקפי 19, ושימוש במודל מהונדס של עכברי OHT (DBA/2J) הקשורים לגיל)8. עם זאת, פולשניות, אופסיפיקציה לאחר הניתוח של הקרנית, הפרעה במקטע הקדמי, עקומות למידה נרחבות, ציוד יקר ו- IOPs משתנים מאוד לאחר הניתוח, הם בין המלכודות המדווחות הקשורות למודלים הנוכחיים, מה שהופך את הפיתוח של מודל חלופי של OHT לדרישה להתגבר על בעיות אלה20,21,22.

הפרוטוקול הנוכחי ממסד הליך כירורגי חדשני להשראת OHT כפרוקסי לגלאוקומה, המבוסס על צריבת מקלעת לימבל (LPC) במכרסמים23. זהו מודל קל, ניתן לשחזור, נגיש ולא פולשני המספק יעילות גבוהה ושונות נמוכה של גובה IOP, הקשורים לשיעור גבוה באופן ייחודי של התאוששות קלינית מלאה, ולכן מספק הערכה תפקודית in vivo במספר מופחת של בעלי חיים המשמשים בכל ניסוי. טכניקת הניתוח גורמת ל- OHT תת-חריף עם חזרה הדרגתית לרמות הבסיס תוך מספר ימים, המדמה את התקף יתר לחץ דם שנראה בגלאוקומה חריפה של סגירת זווית. יתר על כן, התאוששות IOP במודל ואחריו ניוון עצבי גלאוקומטי מתמשך, אשר שימושי עבור מחקרים מכניסטיים עתידיים של ניוון משני של RGCs, אשר מתרחשת במספר מקרים של גלאוקומה אנושית למרות שליטה נאותה של IOP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בוצעו בהתאם להצהרה לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה של האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים בניסויים מדעיים מהמרכז למדעי הבריאות, האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (פרוטוקול 083/17). בעבודה הנוכחית נעשה שימוש בחולדות ליסטר ברדס משני המינים, בנות 2-3 חודשים ובמשקל 180-320 גרם. עם זאת, ניתן להתאים את ההליך בזני חולדות שונים בטווחי גיל שונים.

1. ניתוח יתר לחץ דם עיני ומעקב קליני

  1. חיות בית בסביבת טמפרטורה מבוקרת ומחזור אור/חושך של 12 שעות (06:00: אור דולק / 18:00: אור כבוי) עם מזון סטנדרטי מוקרן גמא (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, ברזיל) ומים (מסנן משולש, עם פחם פעיל לא רעיל) זמין ad libitum.
  2. הכינו תערובת קוקטיילים מרדימה המורכבת משלושה חלקים של 10% קטמין הידרוכלוריד וחלק אחד של 2% קסילזין הידרוכלוריד (מדלל: מים סטריליים).
  3. יש לרסן בעדינות את בעל החיים על ידי החזקת העור הגבי ולגרום להרדמה על ידי מתן תוך צפקי של 1 מיקרוליטר/גרם ממשקל הגוף של התערובת (קטמין: 75 מ"ג/ק"ג; קסילזין: 5 מ"ג/ק"ג). בדוק אם יש הרדמה נכונה לאחר כ -5 דקות על ידי ביצוע תגובת צביטה בבוהן.
  4. הרדמה מקומית של שני משטחי העיניים על ידי החדרת proxymetacaine hydrochloride 0.5% eyedrop. המתן 30-60 שניות והסר את התמיסה הנותרת מהאספקט הקדמי של כדור הארץ, על ידי נגיעה עדינה בלחמית האף או הבולבר לרוחב עם צמר גפן סטרילי קטן.
  5. מדוד IOP בסיסי של עיני בקרה ניסיוניות ונגדיות על ידי הצבת החיה במצב דקוביטוס גחוני על הספסל, כך שמשטח הקרנית נגיש בקלות לקצה הטונומטר.
  6. השתמשו בטונומטר כף יד עם אפלנציה או ריבאונד (איור 1A). מקמו את קצה הטונומטר כך שייגע מעט באזור הקרנית המרכזי בניצב. רכוש ממוצע של 3-5 ממוצעים אמינים שנוצרו על-ידי מכונה. כל ממוצע מחושב אוטומטית על ידי המכשיר לאחר שש מדידות נפרדות מוצלחות.
    1. טען את טונומטר הריבאונד עם בדיקה ולחץ על כפתור המדידה פעם אחת כדי להפעיל אותו, תוך הנחת קצה המכשיר כלפי מעלה, על מנת למנוע מהגשושית ליפול. לאחר ההפעלה, התצוגה תציג 00 המציין שהציוד מוכן למדידה.
    2. מקם את המכשיר עם קצה הגשושית במרחק של 1-4 מ"מ מהקרנית וקבל מדידות על ידי לחיצה מהירה וזהירה על כפתור המדידה, מבלי להזיז את הציוד. כל מדד מוצלח מזוהה על ידי צפצוף קצר ולאחר שש פעמים, הממוצע מוצג על מסך המכשיר.
      הערה: למרות ניסיון רב עם טונומטר applanation, כדי לייעל את ההליך כולו המחברים ממליצים על שימוש טונומטר ריבאונד, אשר מספק רכישה קלה יותר של מדידת IOP אמין.
  7. הניחו את בעל החיים על מנח דקוביטוס רוחבי קל תחת מיקרוסקופ סטריאו, ותכננו בזהירות את הניתוח על ידי בדיקת עין הניסוי בהגדלה של פי 40. אל תשכח לשמור על עין הבקרה הנגדית משומנת במהלך ההליך על ידי החדרת טיפת נתרן כרמלוז או נתרן היאלורונאט.
  8. בעזרת מלקחיים מעוקלים, דחפו בעדינות קדימה את גלגל העין הניסיוני כדי לחשוף את כלי הדם המקיף 360° של הלימבוס13. מצד שני, צרוב בעדינות את כלי הדם סביב הקרנית עם צריבה אופתלמית בטמפרטורה נמוכה (1,300 ° F; Bovie Medical, ארה"ב) (איור 1B-E).
    הערה: לצוואר הנ"ל יש קצה עגול שאמור לגעת בכלי הדם הגפיים לאורך.
  9. יש להיזהר שלא לצרוב את שולי הקרנית, שכן הדבר עלול לגרום לאופסיפיקציה של הקרנית לאחר הניתוח, המונעת הערכה in vivo של תפקוד הרשתית.
  10. שימו לב להופעתם של סימנים מעגליים קטנים של צריבה על הלימבוס הסקלרלי, מחיקת כלי הדם הלימבליים והתרחבות האישונים בעין המנותחת, שהם סימנים להליך כירורגי מוצלח.
    הערה: מכיוון שכלי הדם הלימבליים של חולדות ועכברים דומים אנטומית13,24 ולצריבה המשמשת יש קצה קטן ועדין, פרוטוקול זה יכול לעבוד גם עבור עין העכבר ללא כל הסתגלות.
  11. לאחר הניתוח, בדוק את IOP מיד לאחר הניתוח בשתי העיניים כמתואר בשלב 1.5.
  12. יש למרוח טיפה של פרדניזולון אצטט אופתלמי (1.2 מ"ג/מ"ל) ולשמור על מגע עם המשטח הקדמי של עין הניסוי במשך כ-40 שניות, ולאחר מכן להחליף אותה במשחה אופתלמית של אנטיביוטיקה (אוקסיטטראציקלין הידרוכלוריד 30 מ"ג/גרם בתוספת פולימיקסין B 10,000 U/g; או ציפרופלוקסצין 3.5 מ"ג/גרם). בצע הזרקה תוך שרירית של tramadol hydrochloride (מנה אחת; 2 מ"ג / ק"ג) כדי למנוע כאב לאחר ההליך.
  13. עקוב מקרוב אחר התאוששות בעל החיים מהרדמה, עדיף בסביבה חמה כגון כרית חימום או בתוך כלוב הדיור שלה עם מצעים מתאימים. שימו לב לדפוס הנשימה.
  14. בצע מעקב קליני יומי של עין הניסוי עם תרופות מקומיות המורכבות מתרופה נוגדת דלקת לא סטרואידית (NSAID, למשל, ketorolac trometamol 0.5% טיפת עיניים) ומשחה אנטיביוטית (רצוי אותה אחת בשימוש מיד לאחר הניתוח).
    הערה: מומלץ להשתמש בטיפות עיניים נוגדות דלקת מסוג NSAID במקום סטרואידים מכיוון שהאחרונות עשויות לגרום ל-OHT והן מיושמות באופן קבוע עבור מודלים של גלאוקומה הנגרמת על ידי גלוקוקורטיקואידים במכרסמים.
    1. תחת הרגעה קלה (קטמין: 18.75 מ"ג / ק"ג; xylazine: 1.25 מ"ג / ק"ג), למדוד IOP מועדף באותה תקופה של היום, כדי למנוע הטיה עקב תנודות IOP פיזיולוגי IOP.
    2. במהלך בדיקת העין, שימו לב לאינטראקציות קליניות נדירות, כגון היפמה, פיברוזיס בקרנית או דילול סקלרלי הקשור לצניחת הענבה. בצקת בקרנית, כימוזה והיפרמיה של הלחמית שכיחות אך זמניות.
    3. שימו לב להחלמה קלינית מלאה בסביבות היום השביעי שלאחר הניתוח. רה-וסקולריזציה לימבלית מתחילה בדרך כלל ביומיים הראשונים לאחר הניתוח, בהתאם לחזרה ההדרגתית הצפויה של IOP לקו הבסיס.

2. ניתוח תגובה אופטומוטורית (OMR)

הערה: עבור הליך זה, נעשה שימוש במערכת ספציפית25.

  1. סדרו ארבעה צגי מחשב בריבוע, התוחמים זירה עם פלטפורמה באמצע. על הצגים, להציג תמונה של גליל וירטואלי עם גרגרים אנכיים של גלי סינוס (פסים שחורים ולבנים לסירוגין), מסתובב סביב הפלטפורמה במהירות קבועה (12 מעלות לשנייה) וניגודיות (100%).
  2. מקם מצלמת וידאו מעל הפלטפורמה, המאפשרת לנסיין לצפות בתנועות החיה. בצע את הבדיקה בתנאי צילום והגדר את התוכנה באופן מועדף למצב ידני/נפרד על מנת להעריך כל עין בנפרד.
  3. אפשרו לבעלי חיים להתרגל במשך כ-2 דקות על הרציף. שמרו על סמן הצלב האדום על מסגרת הווידיאו בין עיניה של החיה הנעה בחופשיות, שכן הוא מציין את מרכז הגליל הווירטואלי (איור 1G)25.
  4. התבונן ב- OMR, המורכב ממעקב רפלקסיבי אחר ראשו וצווארו של בעל החיים המתעורר על ידי הגרגירים המסתובבים. בדוק את המסלולים החזותיים השמאלי והימני על-ידי סיבוב הכיוונים של גרגרי גלי הסינוס בכיוון השעון ונגד כיוון השעון, בהתאמה.
    1. בתחילה להציג גירוי עם תדר מרחבי נמוך (0.042 מחזורים / מעלות). לאחר מכן, הגדילו את התדירות בהדרגה עד שלא תבחינו יותר בתנועת המעקב. התדירות המרחבית הגבוהה ביותר שבה מופק OMR ברור מתאימה לתדירות הסף המרחבית של העין הנבדקת.
    2. אם בסופו של דבר בעל החיים נופל מהרציף במהלך הבחינה, החזירו אותו מיד לרציף וחדשו את הבדיקה.

3. הקלטה של דפוס אלקטרורטינוגרמה (PERG)

הערה: האלקטרורטינוגרמה הוקלטה באמצעות מערכת ספציפית לעיבוד אותות ותוכנה נלווית לאחסון וניתוח צורות הגל.

  1. הרדמה עמוקה של בעלי חיים על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין הידרוכלוריד וקסילזין הידרוכלוריד (75 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). הרדמה עמוקה (מישור ניתוחי) מקטינה את הסיכוי לממצאים על ידי תנועות שרירים לא רצוניות או מקורות רעש חלופיים במהלך הבדיקה. בדוק אם יש הרדמה נכונה על ידי ביצוע תגובת צביטה בבוהן.
    הערה: חומרי ההרדמה שהוזכרו אינם משפיעים על המשרעת של התגובה26. מכיוון שמחט קטנה שהוחדרה לקרנית שימשה כאלקטרודה הפעילה, הרדמה תוך שרירית עדיפה על פני תוך צפקית, מכיוון שקל יותר להזריק מחדש במקרה שהחולדה זקוקה למנת דחף (1/2 מהמנה הראשונית), עם סיכויים נמוכים יותר לשנות את מיקום האלקטרודה ובכך להוביל לרישומים ניתנים לשחזור רבים יותר במהלך כל הניסוי, אשר עשוי להימשך עד 60 דקות.
  2. להרדים את הקרנית באופן מקומי עם טיפה של proxymetacaine hydrochloride 0.5%, ולשמור על העין העמית רטוב עם חומרי סיכה אופתלמיים.
  3. הכנס בזהירות את האלקטרודה הפעילה (מחט נירוסטה 0.25 מ"מ × 15 מ"מ) בשוליים הרקתיים של הקרנית. בנוסף, הכניסו את אלקטרודות הייחוס והארקה (מחט נירוסטה 0.4 מ"מ × 37 מ"מ) לרקמה התת-עורית של הקנטוס הרקתי האיפסילטרלי ובאחת הגפיים האחוריות, בהתאמה (איור 1I).
  4. עבור PERG, הגדר את הגירוי ללוח דמקה שמור שחור-לבן, לסירוגין ב- 15 היפוכים לשנייה עם בהירות ממוצעת קבועה (250 cd/m2). הגדר את מסנן הפס ל- 1 Hz-100 Hz.
    הערה: גירוי ההיפוך המהיר יוצר את PERG במצב יציב, סינוזואיד יציב וניתן לשחזור שאוסף את מרכיב הגל הקשור ככל הנראה לתגובה ביו-חשמלית של RGC: סטיית NII של PERG במצב חולף.
  5. מקם את החיה במרחק של 20 ס"מ ממסך הגירוי (צג LCD 0.58 מ '; איור 1I), נטר את קו הבסיס של האות והתחל רכישת PERG על-ידי לחיצה על לחצן ניתוח במערכת הרכישה.
  6. במהלך ההליך, לשמור על בעלי החיים מותאמים לאור הסביבה (אור לבן של ~ 140 לוקס). כאן הוצגו שישה תדרים מרחביים נפרדים (במחזורים לכל מעלה: 0.018, 0.037, 0.073, 0.146, 0.292, 0.585) ברצף אקראי.
    הערה: התוכנה המשמשת לעיבוד אותות מבצעת בממוצע באופן אוטומטי. הממוצע של 200-300 גלים בודדים נחשב מספיק כדי לבלוט מהרעש ולנתח את משרעת הגל.

4. כימות של תאי גנגליון רשתית סומאס

הערה: ההליך הבא הוא לכימות סומות RGC, המבוססות על צביעה אימונוהיסטוכימית של תושבות שטוחות ברשתית עם נוגדן כנגד חלבון תחום ההומיאופ/POU הספציפי למוח 3A (Brn3a).

  1. נושא בעלי חיים ניסיוניים להמתת חסד של נקע צוואר הרחם, שקדמה לו שאיפת פחמן דו חמצני כדי לגרום לאובדן הכרה.
  2. מיד לאחר המתת חסד, לנתח את שתי העיניים תחת מיקרוסקופ סטריאו, באמצעות מלקחיים שיניים מספריים מעוקלים.
  3. בצע דיסקציה זהירה כך שגם החלק הדיסטלי של השרירים החוץ-עיניים וגם הקרונקל יישארו מחוברים לגלובוס, שכן הם ציוני דרך חשובים להתמצאות טופוגרפית של הרשתית (המתוארים בשלב 4.5). נסו לחסוך מתיחה של עצב הראייה המחובר לגלובוס זמן רב ככל האפשר לניתוח עתידי.
  4. לאחר השאיבה, הניחו את העיניים בתמיסה של 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (4% PFA) במאגר פוספט 0.1M (PBS) ושמרו אותו למשך 24 שעות לצורך קיבוע כימי תקין.
  5. להפריד את הרשתית משאר רקמות העין.
    1. תחת מיקרוסקופ מנתח מניחים את גלגל העין בצלוחית פטרי המכוסה ב-PBS 1x, ושמים לב לציוני דרך חשובים כגון קרונקל באף, סדקים כורואידים וטביעות סקלרליות מוורידי מערבולת להתמצאות טופוגרפית נכונה27.
    2. לחדור את החדר הקדמי מן הקרנית המרכזית באמצעות מלקחיים שיניים מספריים מעוקלים (westcott). בצע שני חתכים רדיאליים באספקט העליון (גבי) של הסקלרה, לכיוון הפתח הסקלרלי של עצב הראייה, כדי לתחום את הרביע הגבי של גלגל העין.
    3. יש להפריד את הקרנית משאר כדור הארץ באמצעות חתך אורכי של 360 מעלות בלימבוס הסקלרלי. הסר את העדשה ואת הקשתית ותחם את רביע הרשתית הגבי באמצעות אותם תיחום רדיאלי סקלרלי שתואר לעיל (שלב 4.5.2).
    4. נתקו בזהירות את רקמת הרשתית מהכורואיד והסקלרה, והימנעו הן מחתכים אקראיים לאורך הרקמה והן מאובדן התמצאות טופוגרפי בסופו של דבר.
    5. להפריד את הגוף הרירי מן הרשתית ora serrata. הסר בזהירות את גוף הזגוגית שנותר מגביע הרשתית באמצעות מלקחיים מעוקלים ללא שיניים בתוספת מספריים מעוקלים (משוך את הזגוגית ונתח אותה קרוב לקרום המגביל הפנימי) ומברשת קטנה.
      הערה: הסרת הומור הזגוגית היא צעד חשוב להשגת אות אימונוהיסטוכימי חזק ונקי.
  6. מעבירים רשתיות מבודדות לצלחת תרבית בת 24 בארות (רשתית אחת לכל באר) המכילה 1 מ"ל של PBS 1x ושומרים על הרשתית הפנימית פונה כלפי מעלה.
  7. חדרו רקמות על ידי שטיפה 3x במשך 10 דקות עם חומר פעילי שטח לא יוני 0.5% מדולל ב 1x PBS (0.3 מ"ל). לאחר מכן יש לשמור את הרקמה רועדת בעדינות בסרום בקר 5% אלבומין (BSA) בחומרים פעילי שטח לא יוניים 2% ו-1x PBS (תמיסה חוסמת; 0.25 מ"ל) למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. במהלך שלב 4.7, הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית Brn3a על ידי דילול 1:200 בסורפקטנט לא יוני 0.5% ו-1x PBS בתוספת 5% BSA, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
  9. לאחר 60 דקות של חסימת רקמות, יש לדגור על הרשתית ב-0.2 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית ב-4°C למשך 72 שעות עם רעידות עדינות.
  10. שטפו את הרקמה 3x במשך 10 דקות עם 1x PBS, ולאחר מכן דגרו על הרקמה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ב-0.2 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת 1:750 ב-1x PBS בתוספת 5% BSA.
  11. יתר על כן, לדגור את הרקמה במשך 10 דקות בתמיסת נגד גרעינית עבור צביעת גרעינים פלואורסצנטיים. סיימו את האימונוהיסטוכימיה עם שלב שטיפה אחרון עם 1x PBS (0.3 מ"ל) חוזר על עצמו 3x.
  12. מעבירים רשתיות בעזרת שתי מברשות קטנות על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית, תוך שמירה על צד הזגוגית כלפי מעלה. מקם את רביע הרשתית הגבי כלפי מעלה על שקופיות המיקרוסקופ (שהופרד בעבר בשלב 4.5.3). בצע שני חתכים רדיאליים נוספים לכיוון ראש עצב הראייה כדי לתחום את 3 הרבעים האחרים (אף, גחון וטמפורלי).
    הערה: מידות החיתוך אינן קבועות. הם לא צריכים להיות קצרים מדי הפוגעים בהשטחה יעילה של הרשתית במגלשה ולא צריכים להיות ארוכים מדי, כך שהיא מגיעה לפתח עצב הראייה ומפרידה לחלוטין את רביע הרשתית התחום משאר הרקמה.
  13. לבסוף, יש למרוח 0.2 מ"ל של אמצעי הרכבה נגד דהייה על כיסוי זכוכית ולהניח אותו על הרשתית השטוחה לניתוח מיקרוסקופי של רקמות. כדי להעריך את צפיפות ה-RGCs, בחנו את התושבות השטוחות תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונפוקלי באמצעות מטרה של 40x/1.3.
  14. עבור כל רביע של הרשתית, צלמו שמונה תמונות: שתיים מהרשתית המרכזית (~0.9 מ"מ מדיסק אופטי), שלוש מאמצע הרשתית (~2.0 מ"מ מדיסק אופטי), ושלוש מהרשתית ההיקפית (~3.7 מ"מ מדיסק אופטי), בסך הכל 32 תמונות לכל רשתית. השתמש בתוכנת FIJI כדי לספור תאים חיוביים ל-Brn3a ולהעריך את צפיפות התאים הממוצעת.

5. בדיקת עצב הראייה

  1. לאחר המתת חסד והשתלבות גלגל העין (שלבים 4.1-4.3), יש להסיר את המקטע הפרוקסימלי של החלק התוך אורביטלי של עצב הראייה (1-2 מ"מ), כולל חלק מהחלק התוך עיני, ולהכניס מיד את הדגימות לבקבוקונים/צינורות המכילים 0.2-0.3 מ"ל של תמיסת קיבוע קר (2.5% תמיסת גלוטראלדהיד במאגר נתרן קקודילט 0.1 M (pH 7.4)) למשך שעתיים.
    הערה: השלבים הבאים לעיבוד עצב הראייה מבוצעים באותם בקבוקונים/צינורות משלב 5.1
  2. שטפו את החומר 3x במשך 5 דקות עם חיץ נתרן קקודילט קר 0.1 M. לאחר קיבוע רקמה במשך 1 שעה תחת ניעור עדין בתמיסה של 1.0% אוסמיום טטרוקסיד ב 0.8% אשלגן פרוציאניד ו 5 ננומטר סידן כלורי מדולל ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב 4 ° C (0.1-0.2 מ"ל).
  3. יש לשטוף שברי עצב אופטי 3 פעמים למשך 5 דקות עם חיץ נתרן קקודי קר 0.1 מ' ולאחר מכן במים מזוקקים קרים, 3 פעמים למשך דקה אחת. יש לשמור את החומר למשך הלילה תחת ניעור עדין בתמיסה של 1.0% אורניל אצטט במים מזוקקים להכתמה בטמפרטורה של 4°C (0.1-0.2 מ"ל). יש לשטוף את השברים 3 פעמים במים מזוקקים קרים.
  4. לייבש בהדרגה את הרקמה עם סדרת אצטון מדורגת (0.5 מ"ל כל אחד), עם החלפות הבאות של הדילולים הבאים במים מזוקקים: 2x 7 דקות דגירה ב 15% אצטון קר כקרח; 2x 7 דקות דגירה ב 30% אצטון קר כקרח; 2x 7 דקות דגירה ב 50% אצטון קר כקרח; 2x 7 דקות דגירה ב 70% אצטון קר כקרח; 2x 7 דקות דגירה 80% אצטון קר כקרח; 2x 7 דקות דגירה 90% אצטון קר כקרח; 2x 15 דקות דגירה ב 100% אצטון בטמפרטורת החדר (RT).
  5. בצע 3 שלבי חדירה / הטבעה, עם החלפה לאחר מכן של התמיסות הבאות: 1 חלק אפוקסי שרף: 2 חלקים אצטון (נפח כולל: 0.5 מ"ל), ב RT במשך 12 שעות; 1 חלק שרף אפוקסי: 1 חלק אצטון (נפח כולל: 0.5 מ"ל), ב RT במשך 12 שעות; 2 חלקים שרף אפוקסי: 1 חלק אצטון (נפח כולל: 0.5 מ"ל), ב RT במשך 12 שעות. לבסוף, לחדור רקמה בתוך שרף אפוקסי טהור ב RT במשך 24 שעות.
  6. הסר דגימות מנשא הדגימה, העבר אותן לתבניות הטבעה ותן לו להתפלמר במשך 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס. חתכו מקטעים רוחביים חצי דקים (300-400 ננומטר) של שברי עצב הראייה באמצעות אולטרה-מיקרוטום, אספו והעבירו אותם לשקופית זכוכית במיקרוסקופ. מקטעי צביעה בכחול טולוידין ומדמיינים באמצעות מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 100.
  7. לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי, בצעו חתכים דקים במיוחד (70 ננומטר), אספו אותם על רשתות נחושת וצבעו אותם באורניל אצטט ועופרת ציטראט. בחנו את הקטעים במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המשתנים הכמותיים מבוטאים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). מלבד השוואת דינמיקת IOP בין OHT וקבוצות ביקורת (איור 1F), ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של סידאק. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

איור 1 מדגים שלבים כירורגיים של מודל הצריבה של מקלעת הלימה במעגל מלא (LPC), עם ציוני דרך חשובים כגון היעלמות תרמית של 360° של כלי דם לימבליים, כמו גם מידריאזיס קל עד בינוני בעין המנותחת בסוף ההליך.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צריבת מקלעת לימבל (LPC) הוא מודל פוסט-טרבקולרי חדשני עם היתרון שהוא מכוון למבני כלי דם נגישים בקלות שאינם דורשים דיסקציה של לחמית או טנון17,28. בשונה ממודל הצריבה של וורידי מערבולת, מודל OHT ידוע המבוסס על הפגיעה הניתוחית בניקוז ורידי כורואידים, גודש ורידי לא צפוי להשפיע על עליית IOP במודל LPC, שכן ורידים לימבליים ממוקמים במעלה הזרם בזרימת הומור מימית. כמו כן, זה קל מבחינה טכנית ללמוד בעלות נמוכה, דורש בעיקר צריבה תרמית בטמפרטורה נמוכה. יתר על כן, הוא קשור לשיעור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בטכנאי המעבדה שלנו חוסה; נילסון דוס סנטוס, דיאן מנדרינו טורס, חוסה פרנסיסקו טיבורסיו, גילדו בריטו דה סוזה ולוצ'יאנו קבלקנטה פריירה. מחקר זה מומן על ידי FAPERJ, CNPq ו- CAPES.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוןאיזופר201משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
אלקטרודה פעילה לאלקטרורטינוגרפיהHansol MedicalCo-Rustמחט נירוסטה 0.25 מ"מ ופעמים; 15 מ"מ
AnestalconNovartis Biociê ncias S/AMS-1.0068.1087Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
סידן כלוריVetec560משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
קוטריה בטמפרטורה נמוכה קצה עדין 10/bxBovie Medical CorporationAA00צריבה עיניים בטמפרטורה נמוכה
CetaminSyntec do Brasil Ltda000200-3-000003קטמין הידרוכלוריד 10%
DAKODako North AmericaS3023Antifade הרכבה בינונית
DAPIThermo Fisher Scientific28718-90-3diamidino-2-phenylindole; כתם נגד גרעיני פלואורסצנטי כחול; פליטה ב-452± 3 ננומטר
EcofilmCristá lia Produtos Quí מיקוס Farmacê uticos LtdaMS-1.0298.0487נתרן כרמלוז 0.5%
EPON שרףPolysciences, Inc.-שרף אפוקסי המשמש למיקרוסקופ אלקטרונים, המורכב מתערובת של ארבעה ריאגנטים: שרף פולי/מיטה 812 (CAT#08791); DDSA - אנהידריד דודצניל סוקסיני (CAT#00563); NMA - Nadic מתיל אנהידריד (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16110משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
HyabakUniã o Quí נציץ Farmacê utica Nacional S/AMS-8042140002נתרן היאלורונאט 0.15%
Icare TonolabIcare פינלנד OyTV02 (מספר דגם)ריבאונד טונומטר כף יד
IgG חמור נוגדן נגד עכבר + Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA31570נוגדנים משני
צג LCD 23 אינץ'Samsung Electronics Co. Ltd.S23B550דגם LS23B550, להקלטת אלקטרורטינוגרמה
LSM 510 MetaCarl Zeiss-Confocalאפיפלואורסצנטי מיקרוסקופ
MaxifloxCristá lia Produtos Quí מיקוס Farmacê uticos LtdaMS-1.0298.0489Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400KNihon KohdenCorporation-מערכתלהקלטת אלקטרורטינוגרמה
מונו-רטינוגרמה עכבר IgG1 חד-שבטי אנטי-Brn3aMilliporeSigmaMAB-1585Brn3a תמיסת נוגדנים ראשונית
Neuropack Manager v08.33Nihon KohdenCorporation-תוכנהלעיבוד
אותות אלקטרורטינוגרמהאופטימוטומטריהמוחמכניקה-מערכתלניתוח תגובה אופטומוטורית
אוסמיום טטרוקסידמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית19100משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
אשלגן פרוציאנידמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים20150משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
אלקטרודות ייחוס וקרקע לאלקטרורטינוגרפיהChalgren Enterprises110-63מחטי נירוסטה 0.4 מ"מ ופעמים; 37 מ"מ
מאגר נתרן קקודילאטמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית12300משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
Ster MDUniã o Quí נציץ Farmacê utica Nacional S/AMS-1.0497.1287פרדניזולון אצטט 0.12%
TerolacCristá lia Produtos Quí מיקוס Farmacê uticos LtdaMS-1.0497.1286Ketorolac trometamol 0.5%
TerramicinaLaborató rios Pfizer LtdaMS-1.0216.0024Oxytetracycline hydrochloride 30 מ"ג/גרם + פולימיקסין B 10,000 U/g
Tono-Pen XLReichert Technologies230635טונומטר כף יד להתאמה דיגיטלית
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605כתם נגד גרעיני פלואורסצנטי אדום רחוק; פליטה ב-661 ננומטר
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5חומר פעילי שטח לא יוני
אורניל אצטטמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי22400משמש להכנת רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים (שלב 5)
XilazinSyntec do Brasil Ltda7899קסילזין הידרוכלוריד 2%
קרל זייס-מיקרוסקופסטריאו לניתוח ודיסקציה של הרשתית
פתרון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1(2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050(2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13(2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286(2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209(2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים