הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63446

⸱

1 במרץ 2022

 , 
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.

תקציר

בריזוספירה יש קהילה מיקרוביאלית מורכבת ביותר שבה שורשי הצמח מאותגרים כל הזמן. שורשים נמצאים במגע הדוק עם מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, אך מחקרים על אינטראקציות הנישאות בקרקע עדיין נמצאים מאחורי אלה המבוצעות על איברים מעל פני הקרקע. אף על פי שכמה אסטרטגיות חיסון להדבקת צמחי מודל בפתוגנים שורשיים לדוגמה מתוארות בספרות, עדיין קשה לקבל סקירה מתודולוגית מקיפה. כדי להתמודד עם בעיה זו, מתוארות במדויק שלוש מערכות חיסון שורשים שונות שניתן ליישם כדי לקבל תובנות על הביולוגיה של אינטראקציות שורש-מיקרובים. לשם המחשה, מיני Verticillium (כלומר, V. longisporum ו - V. dahliae) שימשו כפתוגנים פולשי שורשים. עם זאת, ניתן להתאים את השיטות בקלות לחיידקים אחרים המתיישבים בשורשים - הן פתוגניים והן מועילים. על ידי התיישבות הצמח xylem, פטריות הנישאות בקרקע כלי דם כגון Verticillium spp. מציגות אורח חיים ייחודי. לאחר פלישת השורשים, הם מתפשטים דרך כלי הקסילם באופן אקרופטלי, מגיעים לירי ומעוררים תסמיני מחלה. שלושה מיני צמחים מייצגים נבחרו כמארחים לדוגמה: אראבידופסיס תליאנה, אונס זרעי שמן חשוב מבחינה כלכלית (Brassica napus) ועגבניות (Solanum lycopersicum). פרוטוקולים שלב אחר שלב ניתנים. מוצגות תוצאות מייצגות של מבחני פתוגניות, ניתוחי שעתוק של גנים של סמנים ואישורים בלתי תלויים על ידי מבנים מדווחים. יתר על כן, היתרונות והחסרונות של כל מערכת חיסונים נדונים ביסודיות. הפרוטוקולים המוכחים האלה יכולים לסייע במתן גישות לשאלות מחקר על יחסי גומלין בין שורש למיקרובים. הכרת האופן שבו צמחים מתמודדים עם מיקרובים בקרקע היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשיפור החקלאות.

מבוא

קרקעות טבעיות מאוכלסות על ידי מספר מדהים של מיקרובים שיכולים להיות ניטרליים, מזיקים או מועילים לצמחים1. פתוגנים צמחיים רבים נישאים באדמה, מקיפים את השורשים ותוקפים את האיבר התת-קרקעי. מיקרואורגניזמים אלה שייכים למגוון רחב של קלדות: פטריות, אומיצטים, חיידקים, נמטודות, חרקים וכמה וירוסים 1,2. ברגע שתנאי הסביבה מעדיפים זיהום, צמחים רגישים יחלו ותנובת היבולים תרד. ההשפעות של שינויי האקלים, כגון התחממות כדור הארץ וקיצוניות מזג האוויר, יגדילו את שיעור הפתוגנים הצמחיים הנישאים בקרקע3. לכן, יהיה חשוב יותר ויותר לחקור את המיקרובים ההרסניים האלה ואת השפעתם על ייצור מזון ומזון, אך גם על מערכות אקולוגיות טבעיות. בנוסף, ישנם הדדים מיקרוביאליים באדמה שמקיימים אינטראקציה הדוקה עם שורשים ומקדמים צמיחה, התפתחות וחסינות של צמחים. כאשר הם מתמודדים עם פתוגנים, צמחים יכולים לגייס באופן פעיל יריבים ספציפיים בריזוספירה שיכולים לתמוך בהישרדות המארח על ידי דיכוי פתוגנים 4,5,6,7. עם זאת, פרטים מכניסטיים ומסלולים המעורבים באינטראקציות מועילות בין שורש למיקרובים עדיין אינם ידועים6.

לכן, חיוני להרחיב את ההבנה הכללית של אינטראקציות שורש-מיקרובים. יש צורך בשיטות אמינות לחיסון שורשים עם מיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע כדי לבצע מחקרי מודל ולהעביר את הממצאים ליישומים חקלאיים. אינטראקציות מועילות בקרקע נחקרות, למשל, עם סרנדיפיטה אינדיקה (שנקראה בעבר Piriformospora indica), ריזוביום spp. מקבע חנקן, או פטריות מיקוריזאליות, בעוד שפתוגנים ידועים של צמחים הנישאים בקרקע כוללים את Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp., ו- Verticillium spp.1. שני האחרונים הם סוגים פטרייתיים המופצים ברחבי העולם וגורמים למחלות כלי דם2. Verticillium spp. (Ascomycota) יכול להדביק מאות מיני צמחים - בעיקר דיקוטילדונים, כולל חד-שנתיים עשבוניים, רב-שנתיים עציים וצמחי יבול רבים 2,8. ההיפאה של Verticillium נכנסת לשורש וגדלה הן באופן בין-תאי והן תוך-תאית לכיוון הגליל המרכזי כדי ליישב את כלי הקסילם 2,9. בכלים אלה, הפטרייה נשארת במשך רוב מחזור החיים שלה. מכיוון שמוהל הקסילם דל בחומרים מזינים ונושא תרכובות להגנת הצומח, הפטרייה חייבת להתאים את עצמה לסביבה ייחודית זו. זה נעשה על ידי הפרשה של חלבונים הקשורים להתיישבות המאפשרים לפתוגן לשרוד בפונדקאישלו 10,11. לאחר ההגעה לשורש כלי הדם, הפטרייה יכולה להתפשט בתוך כלי הקסילם באופן אקרופטאלי לעלווה, מה שמוביל להתיישבות מערכתית של המארח 9,12. בשלב זה, הצמח מושפע לרעה בגידול 9,10,13. לדוגמה, פעלולים ועלים צהובים מופיעים, כמו גם תסיסה מוקדמת 13,14,15,16.

אחד החברים בסוג זה הוא Verticillium longisporum, המותאם מאוד לפונדקאים פלסיקאיים, כגון אונס זרעי השמן החשובים מבחינה אגרונומית, כרובית, וצמח המודל Arabidopsis thaliana12. מספר מחקרים שילבו את V. longisporum ו- A. thaliana כדי לקבל תובנות נרחבות על מחלות כלי דם הנישאות בקרקע ותגובות הגנת השורשים הנובעות מכך 13,15,16,17. ניתן לממש בדיקות רגישות פשוטות על ידי שימוש במערכת המודל V. longisporum / A. thaliana ומשאבים גנטיים מבוססים היטב זמינים עבור שני האורגניזמים. קרוב ל- V. longisporum הוא הפתוגן Verticillium dahliae. אף על פי ששני המינים הפטרייתיים מבצעים סגנון חיים ופלישה דומה של כלי דם, יעילות ההתפשטות שלהם משורשים לעלים ותסמיני המחלה המתעוררים ב-A. thaliana שונים: בעוד ש-V. longisporum בדרך כלל גורם לסנסנציה מוקדמת, זיהום V. dahliae גורם ל-18. לאחרונה, סיכום מתודולוגי הציג אסטרטגיות שונות לחיסון שורשים להדבקת A. thaliana עם V. longisporum או V. dahliae, וסייע בתכנון מערכי ניסוי19. בשטח, V. longisporum גורם מדי פעם לנזק משמעותי בייצור אונס זרעי שמן12, בעוד של-V. dahliae יש טווח פונדקאים רחב מאוד הכולל מספר מינים מעובדים, כגון גפן, תפוח אדמה ועגבנייה8. זה הופך את שני הפתוגנים למודלים מעניינים מבחינה כלכלית למחקר.

לפיכך, הפרוטוקולים הבאים משתמשים הן ב - V. longisporum והן ב - V. dahliae כפתוגנים שורשיים לדוגמה כדי להדגים גישות אפשריות לחיסונים שורשיים. אראבידופסיס (Arabidopsis thaliana), אונס זרעי שמן (Brassica napus) ועגבנייה (Solanum lycopersicum) נבחרו כמארחים לדוגמה. תיאורים מפורטים של המתודולוגיות ניתן למצוא בטקסט שלהלן ובסרטון הנלווה. נדונים יתרונות וחסרונות לכל מערכת חיסונים. יחד, אוסף פרוטוקולים זה יכול לסייע בזיהוי שיטה מתאימה לשאלות מחקר ספציפיות בהקשר של אינטראקציות שורש-מיקרוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מדיה לתרבויות פטרייתיות ומערכות חיסון צמחים

  1. מרק דקסטרוז תפוחי אדמה נוזלי (PDB): מכינים 21 גרם/ליטר PDB במים אולטרה-אפורים בבקבוקון יציב בחום.
  2. מרק Czapek Dextrose נוזלי (CDB): מכינים 42 גרם/ל' CDB במים אולטרה-אפורים בבקבוקון יציב בחום.
  3. בינוני למערכת החיסון של צלחת פטרי: הכינו בקבוקון יציב בחום עם 1.5 גרם/ל' מוראשיגה ומדיום סקוג (MS) ו-8 גרם/ל' אגר במים אולטרה-אפורים.
    הערה: הימנעו מסוכר במדיום זה מכיוון שהוא יוביל לצמיחה פטרייתית מוגזמת לאחר החיסון.
  4. בינוני עבור מערכת החיסון על בסיס פלסטיק: הכינו בקבוקון יציב בחום עם 4.4 גרם/ליטר MS, 0.2 גרם/ל' MgSO4, 1 גרם/ל' KNO3, 0.5 גרם/ל' 2-(N-מורפולינו)חומצה אתאנסולפונית (MES), ו-6.0 גרם/ל' אגר במים אולטרה-אפורים והתאימו את ה-pH ל-5.7 עם 5 M KOH.
    הערה: הימנעו מסוכר במדיום זה מכיוון שהוא יוביל לצמיחה פטרייתית מוגזמת לאחר החיסון.
  5. 1/4 טרשת נפוצה בינונית: מכינים 1.2 גרם/ליטר טרשת נפוצה במים אולטרה-יבשתיים.
  6. השתמש באוטוקלב כדי לעקר את כל הפתרונות הנ"ל. מכניסים את צלוחיות הזכוכית לסל, סוגרים את המכסה ומעקרים למשך 15 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ו-98.9 kPa.

2. עיקור פני השטח של זרעי הצמחים

הערה: השתמש בפרוטוקול שלהלן תמיד כדי לעקר את פני השטח של זרעים מאראבידופסיס, אונס זרעי שמן ועגבנייה לפני הזריעה.

  1. מעבירים את הזרעים לצינור תגובה של 2 מ"ל. מניחים את הצינור באקסיקטור עם קיבולת פנימית של 5.8 ליטר.
  2. צור גז כלור באקסיקטור על ידי הוספת 6 מ"ל של 33% חומצה הידרוכלורית (HCl) ל-100 מ"ל של 12% נתרן היפוכלוריט מימי (NaClO).
  3. מיד לסגור את המכסה של exsiccator ולדגום את הזרעים במשך 3 שעות בגז.

3. הכנת האינוקולום עם נבגי ורטיצ'יליום (קונידיה שמקורה בא-מיניים)

הערה: טפח V. דליה (זן JR2) באותו אופן כמו V. longisporum (זן Vl43)17,18,19. ודא שכל הציוד והמדיה נקיים מחיידקים ושכל השלבים מבוצעים במכסה זרימה למינרי כדי לשמור על אקסני אינוקולום.

  1. יש למלא 150 מ"ל של PDB נוזלי (שלב 1.1) בבקבוקון צ'יקנרי של 500 מ"ל ולהשלים את המדיום ב-500 מ"ג/ל' cefotaxime.
  2. הוסף את Verticillium conida מאחסון מלאי הגליצרול למדיום PDB. סגור את הבקבוקון עם פקק קצף סטרילי.
  3. דגירו את התרבית למשך 7-10 ימים בקופסה חשוכה בטמפרטורת החדר (RT) תחת טלטולים אופקיים רציפים (שייקר סיבובי; 60 סל"ד). התוצאה היא כדורי תפטיר קטנים ולבנים.
  4. הסר והשליכו את ה-PDB בזהירות. רוב המיצילים צריכים להישאר בבקבוקון.
  5. הוסיפו 100 מ"ל של CDB נוזלי (שלב 1.2) על המיציליה בבקבוקון הצ'יקנרי והוסיפו את המדיום ל-500 מ"ג/ל' cefotaxime.
  6. דגירה של עוד 4-5 ימים בקופסה חשוכה ב-RT תחת טלטול רציף ואופקי (שייקר סיבובי, 60 סל"ד) כדי לגרום לספורולציה. ה-supernatant יהפוך לצהבהב-אפרפר עם שחרור הקונידיה.
  7. סנן חלק (5-10 מ"ל) של הנוזל המכיל קונידיה דרך נייר מסנן (רמת שימור חלקיקים של 8-12 מיקרומטר) לתוך צינור איסוף סטרילי של 50 מ"ל. זה מפריד בין נבגים לתמיסליה.
  8. קבעו את ריכוז הנבגים באמצעות תא ספירת תאים ומיקרוסקופ. דיללו עם 1/4 טרשת נפוצה ללא נבטים בינוניים במים אולטרה-פוריים עד לקבלת ריכוזי הנבגים המפורטים להלן.
    הערה: תחת המיקרוסקופ, הקונידיה מ- V. longisporum מצוירת ברובה לאורך זמן וגודלה 7.1-8.8 מיקרומטר, בעוד ש- V. dahliae conidia קצרים יותר (3.5-5.5 מיקרומטר) וכדוריים למדי20.
  9. השתמש בקונידיה שנקטפה זה עתה כאינוקולום. הקפידו לערוך את הניסויים תמיד עם קונידיה שנקטפה זה עתה ולא עם מלאי קפוא, שכן הקפאה מפחיתה משמעותית את מספר הנבגים בני הקיימא19.
  10. לאחסון לטווח ארוך, הקפיאו את הנבגים כתמיסת נבגים מרוכזת גבוהה (כ-1 x 108 נבגים /מ"ל) ב-25% גליצרול בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (ניתן לאחסן עד שנה אחת). לניסויים הבאים, השתמשו במלאי הגליצרולים האלה כדי לחסן את מדיום ה-PDB בשלב 3.2.

4. מערכת חיסון חוץ גופית סטרילית המבוססת על צלחות פטרי

הערה: עבור מערכת כלי הפטרי17, ודא שכל הציוד והמדיה נקיים מחיידקים ושכל השלבים מבוצעים במכסה זרימה למינרי.

  1. לאחר האוטוקלבינג, יוצקים את המדיום (ראו שלב 1.3) לתוך צלחות פטרי.
  2. לאחר התקשות המדיום, ארזו מחדש את כלי הפטרי בשקית ניילון סטרילית ואחסנו אותם במהופך למשך הלילה במקרר (4-10 מעלות צלזיוס). מדיום מצונן מסייע במניעת החלקה של המדיום בשלבים הבאים.
  3. חותכים ומסירים תעלת זיהום ואת השליש העליון של המדיום הממוצק באמצעות אזמל (איור 1A). הימנע מקבל נוזל או אוויר מתחת למדיום אגר בזמן חיתוך; אחרת, המדיום יחליק ויסגור את ערוץ ההדבקה.
  4. מפיצים 50-100 זרעי ערבידופסיס מעוקרים על פני השטח עם קצה פיפטה סטרילי על המשטח העליון החתוך. שימו את הזרעים בזווית שבה משטח האגר החתוך נוגע בדופן של צלחת הפטרי, כך שהשורשים יכולים לצמוח בין המדיום לקיר צלחת הפטרי. זה יקל על החיסון מאוחר יותר.
  5. סגרו את כלי הפטרי ואטמו אותם בנייר דבק חדיר לאוויר כדי לאפשר החלפת גזים.
  6. לאחר ריבוד במשך יומיים בחושך ב 4 °C (4 °F), למקם את הצלחות אנכית במדף מתאים ולגדל את הצמחים ב 22 ° C ± 1 ° C בתנאים של יום ארוך (16 שעות אור / 8 שעות חושך) בתא צמיחה.
  7. כאשר רוב השורשים מגיעים לתעלת ההדבקה (שתילים בני כ-9-11 יום), מניחים את הלוחות אופקית, פותחים אותם ומוסיפים 500 μL של Verticillium conidia שזה עתה נקטפו עם ריכוז של 4x105 נבגים /מ"ל ישירות לתעלת ההדבקה, תוך הקפדה על כך שהנוזל מופץ באופן שווה בתעלה.
  8. באופן דומה, הכינו לוחות בקרה על ידי הוספת 500 μL של תמיסת דמה במקום נבגים (מדיום 1/4 MS ללא חיידקים).
  9. דגירו את הצלחות אופקית במשך מספר דקות עד שהנוזל נספג פנימה ולא יוכלו לדלוף החוצה כאשר הצלחות מוגדרות שוב אנכית. לאחר מכן, סגרו את המכסה ואטמו את הצלחות בנייר דבק חדיר לאוויר.
  10. דגירה אנכית של הלוחות בתא הגידול. לחלופין, כסו את חלקי השורש בקופסאות נייר שחורות כדי להכהות שורשים ופטריות הנישאות באדמה (ראו19).
  11. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון בהתאם לשאלת המחקר (עיין באגדות האיור עבור נקודות הזמן המדויקות המשמשות כאן). להלן כמה הצעות.
    1. חותכים את העלים מהשורשים וקוצרים את שניהם בנפרד. הוציאו את רצועות האגר מכלי הפטרי כדי לגשת בקלות לשורשים ומשכו אותן בזהירות מהאגר באמצעות מלקחיים. להקפיא את כל החומר הצמחי באופן מיידי בחנקן נוזלי.
      1. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי. הוציאו דנ"א כולל מ-100 מ"ג של חומר עלים כדי לקבוע באמצעות PCR כמותי (qPCR) את כמות הדנ"א הפטרייתי ביחס לדנ"א הצמחי (ראו19).
      2. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי. יש ליטול 100 מ"ג של חומר צמחי ולחלץ סך הכל RNA. בצע PCR של שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR) כדי לקבוע את הביטוי של גנים צמחיים (או גנים פטרייתיים) במהלך התפשטות (ראו19).
    2. יש להסיר בזהירות את השורשים מהאגר תוך הימנעות מפציעה ולבחון אותם תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
      1. לקבוע אינדוקציה של גנים של סמן בקווים של כתבי צמחים (למשל, לוציפראז, β-גלוקורונידאז, או כתבים פלואורסצנטיים 17,19,21).
      2. דמיינו את ההתפשטות הפטרייתית בשורש על ידי שימוש בקווי כתב פטרייתיים (למשל, V. longisporum המבטא באופן מכונן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, Vl-sGFP9) או על ידי טכניקות צביעה (למשל, באמצעות 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוקסיל-N-אצטיל-בטא-ד-גלוקוזאמיניד (X-בטא-D-Glc-Nac)18).

5. מערכת חיסון חוץ גופית סטרילית המאורגנת בכוסות פלסטיק

הערה: כפי שצוין בתיאור הראשון של טכניקה זו19, ודא שכל הציוד והמדיה נקיים מחיידקים וכי כל הצעדים מבוצעים במכסה זרימה למינרי.

  1. השתמשו בכוסות פלסטיק שקופות בנפח כולל של 500 מ"ל ועקרו אותן באמבט אתנול של 70%-75% למשך 20 דקות לפחות. מייבשים את הכוסות במכסה הזרימה הלמינרי.
  2. יוצקים את המדיום האוטוקלבי (ראו שלב 1.4) לתוך כוסות הפלסטיק. לחלופין, יש להוסיף cefotaxime (ריכוז סופי של 50 מ"ג/ל') למדיום האוטוקלבי כדי למנוע זיהומים חיידקיים. השתמשו ב-150 מ"ל של בינוני לכוס לניסויים עם אראבידופסיס או יותר בינוני (250-300 מ"ל לכוס) לניסויים במיני צמחים גדולים יותר (אונס זרעי שמן, עגבניות).
  3. מניחים שכבת פלסטיק (מעוקרת בעבר על ידי דגירה ב-70%-75% אתנול למשך 20 דקות) על המדיום לפני שהיא מתמצקת (איור 1B).
    הערה: שכבת פלסטיק זו מכילה ארבעה חורים טרומיים בפינות להנחת זרעים מעוקרים על פני השטח. זה מאפשר לזרעים לגשת למדיום. מאוחר יותר, שכבה מפרידה זו מונעת מהעלים לגעת בתווך המכיל פטרייה, כך שהמיקרובים אינם יכולים לתקוף ישירות את העלים ועליהם לעבור את מסלול השורש. חור נוסף נמצא במרכז, המאפשר חיתוך תעלת ההדבקה.
  4. כאשר המדיום התמצק, חותכים את האגר עם אזמל דרך החור המרכזי הטרומי לעומק של כ-1.5 ס"מ. הסר את האגר החתוך כדי ליצור תעלת זיהום שאליה ניתן להוסיף את הנבגים הפטרייתיים מאוחר יותר.
  5. שורטים מעט את מדיום האגר עם קצה פיפטה בארבעת החורים הקטנים יותר כדי להפריע לעור המוצק (זה מאפשר לזרעים לספוג מים ממדיום האגר המימי). מניחים את הזרעים בעזרת קצה פיפטה לתוך החורים הקטנים יותר.
  6. סגרו את הפלסטיק עם פלסטיק שנייה הפוכה ואטמו עם סרט דבק חדיר לאוויר. הקלטת חייבת לאפשר חילופי גז.
  7. לאחר ריבוד במשך 3 ימים בחושך ב 4 °C (4 °C ), דגירה של מערכות הגביע תחת חושך של 12 שעות אור / 12 שעות (חושך 12 שעות / 12 שעות ( Arabidopsis, אונס זרעי שמן) או 16 שעות אור / 8 שעות תנאי חושך (עגבניות) בתאי גדילה בטמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס ו -60% לחות.
  8. עקוב אחר הגיל המומלץ של צמחים לחיסון: 21 ימים עבור Arabidopsis; 5-7 ימים לאונס זרעי שמן; 12 ימים לעגבנייה.
  9. לחסן צמחים עם Verticillium על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת conidia (ריכוז מומלץ: 4 x 105 נבגים / מ"ל) לתעלת הזיהום. כדי להכין דגימות בקרה, הוסף 1 מ"ל של תמיסה מדומה ללא נבגים (1/4 MS בינוני ללא חיידקים) לתעלה.
  10. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון בהתאם לשאלת המחקר (עיין באגדות האיור עבור נקודות הזמן המדויקות המשמשות כאן). להלן כמה הצעות.
    1. צלמו את הצמחים עם מצלמה דיגיטלית מלמעלה תוך שמירה על מרחק זהה עבור כל תמונה. לכמת את אזור העלה (לדוגמה, עם ImageJ22 או BlattFlaeche17,19; השתמש באורך הכוסות כדי לקבוע את קנה המידה) ולהשוות בין קבוצות נגועות וקבוצות ביקורת. סווג את התפתחות תסמיני המחלה (למשל, עלים קטנים יותר, צהבהבים יותר או נמקיים).
      הערה: אם יש גבעולים על Arabidopsis, להסיר אותם כדי לקבל תמונות טובות יותר של רוזטות.
    2. הסר את השורשים והגדר את הביומסה (משקל טרי) של יורה מדגימות נגועות ובקרה על ידי שקילה. קבע את המשקל הטרי היחסי19.
    3. אסוף את הדגימות לניתוחים מולקולריים כדלקמן.
    4. ערבידופסיס: הסר גבעולים אם יש כאלה. חותכים את הרוזטות בבסיס מהשורשים. הקפידו להוציא את כל חומר השורש מהדגימה ולקצור רוזטות שלמות. שלבו 4-5 רוזטות מצמחים שונים בדגימה אחת והקפיאו את חומר העלים בחנקן נוזלי.
    5. משכו את השורשים בזהירות מהמדיום בעזרת מלקחיים, לחצו עליהם וטפטפו אותם במגבת נייר כדי להסיר שרידי אגר, וערבבו 4-5 שורשים מצמחים שונים בדגימה אחת. להקפיא מיד בחנקן נוזלי.
    6. אונס/עגבניה מזרעי שמן: חתכו מקטעי גזע מההיפוקוטיל (למשל, 1 ס"מ אורך; קחו תמיד את אותו אזור גבעול). שלבו חומר מ-4-5 צמחים בכל דגימה והקפיאו את החנקן הנוזלי.
    7. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי. הוציאו סך הדנ"א מ-100 מ"ג של חומר העלה או הגבעול כדי לקבוע באמצעות qPCR את כמות הדנ"א הפטרייתי ביחס לדנ"א הצמחי (ראו19).
    8. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי, לוקחים 100 מ"ג של חומר צמחי ומוציאים סך הכל RNA. ביצוע qRT-PCR כדי לקבוע את הביטוי של גנים צמחיים (או גנים פטרייתיים) עם התפשטות (ראה19).

6. מערכת חיסון מבוססת קרקע בעציצים

  1. ערבבו היטב אדמה וחול ביחס נפחי של 3:1 (אדמה:חול) כדי להקל על שטיפת המצע מהשורשים. יוצקים את התערובת לתוך שקית אוטוקלאב. אם התערובת יבשה מדי, מוסיפים כמות מתאימה של מים ומערבבים אותה לתוך המצע. אדים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באוטוקלב כדי למזער את הזיהומים המיקרוביאליים.
    הערה: הימנע מחימום ליותר מ-80 מעלות צלזיוס, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על חומרי מזון אורגניים בקרקע.
  2. ממלאים את העציצים בתערובת חול האדמה ומעבירים אותם למגשים. מוסיפים מים למגשים בערך 1/3 מגובה הסיר, כך שתערובת חול האדמה נספגת היטב במים. בנוסף, מרססים את המצע במים בבקבוק תרסיס כדי להבטיח תנאי התחלה רטובים.
  3. זרעו 3-4 זרעים בכל עציץ (איור 1C) כדי להבטיח שלזרעים יהיה מספיק מרחק זה מזה. שמור אותם במשך 3 ימים בחושך ב 4 °C (75 °F) עבור ריבוד לסנכרון נביטה.
    הערה: טרום גידול עודף של צמחים, מה שמאפשר מבחר של צמחים בגודל דומה לניסויי החיסון ומפחית סטיות עקב הבדלים אינדיבידואליים.
  4. תנו לשתילים לגדול בתנאים של יום ארוך (16 שעות אור / 8 שעות חושך; טמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס; 60% לחות) עם השקיה קבועה.
  5. עקוב אחר הגיל המומלץ של צמחים לחיסון: 21 ימים עבור Arabidopsis, 7 ימים עבור אונס זרעי שמן, ו 10 ימים עבור עגבניות. לקטוף צמחים בגודל דומה כדי לבצע את "חיסון טבילת השורש"15,17,23,24. מוציאים את האדמה מהסירים וחופרים בזהירות את השורשים.
  6. יש לשטוף בעדינות רק את השורשים במיכל מים ולהרחיק את הרוזטות מהמים. דגירה של השורשים השטופים למשך 60 דקות בצלחת פטרי המכילה את תמיסת נבגי ה-Verticillium (ריכוז מומלץ: 2 x 106 נבגים /מ"ל). עבור קבוצת הביקורת שאינה נגועה, יש לדוגר את השורשים במשך 60 דקות בתמיסה המדומה ללא נבגים (מדיום 1/4 טרשת נפוצה ללא נבט).
  7. הכינו סירים חדשים עם אדמה לחה ומעוקרת באדים (80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) ללא חול. השתמשו בקצה פיפטה כדי ליצור חור אחד במרכז האדמה בכל עציץ.
  8. מכניסים את השורשים ישירות לתוך החור (מעבירים רק צמח אחד לכל עציץ). לאחר החדרת השורשים, הקפידו למלא את החורים בזהירות באדמה. הימנע מלחיצה על הקרקע, אחרת repotting יכול לגרום לתסמיני מתח כגון עלים סגולים.
  9. טפחו קבוצות נגועות ובקרה בתנאים של יום ארוך (16 שעות אור / 8 שעות חושך; טמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס; 60% לחות) עם השקיה קבועה.
  10. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון בהתאם לשאלת המחקר (עיין באגדות האיור עבור נקודות הזמן המדויקות המשמשות כאן). להלן כמה הצעות.
    1. צלמו את הצמחים עם מצלמה דיגיטלית מלמעלה, תוך שמירה על מרחק זהה עבור כל תמונה. לכמת את שטח העלה (לדוגמה, עם ImageJ22 או BlattFlaeche17,19; השתמש בקוטר הסירים כדי לקבוע את קנה המידה) ולהשוות בין קבוצות נגועות לקבוצות ביקורת. לסווג את התפתחות תסמיני המחלה (למשל, עלים קטנים יותר, צהבהבים יותר או נמקיים)13.
      הערה: הסרת גבעולים של Arabidopsis מקלה על צילום של הרוזטות.
    2. הסר את השורשים והגדר את הביומסה (משקל טרי) של יורה מדגימות נגועות ובקרה על ידי שקילה. קבע את המשקל הטרי היחסי19.
    3. לחלופין, מדוד את גובה הצמח או סווג צמיחה פטרייתית מקטעי גזע כדי להעריך את חומרת המחלה13.
    4. אסוף דגימות לניתוחים מולקולריים באופן הבא.
    5. ערבידופסיס: הסר את הגבעולים. חותכים את הרוזטות בכתר השורש. שלבו 4-5 רוזטות מצמחים שונים בדגימה אחת. הקפיאו את חומר העלה בחנקן נוזלי.
      הערה: במקרה של שורשים, קשה לנקות אותם מספיק מהאדמה מבלי לתכנת מחדש את ביטוי הגנים באמצעות שטיפה.
    6. אונס/עגבניה מזרעי שמן: חתכו מקטעי גזע מההיפוקוטיל (למשל, 1 ס"מ אורך; קחו תמיד את אותו אזור גבעול). שלבו חומר מ-4-5 צמחים בדגימה אחת והקפיאו אותו בחנקן נוזלי.
    7. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי. הוציאו דנ"א כולל מ-100 מ"ג עלים או חומר גזע כדי לקבוע באמצעות qPCR את כמות הדנ"א הפטרייתי ביחס לדנ"א הצמחי (ראו19).
    8. טוחנים את הדגימות בחנקן נוזלי, לוקחים 100 מ"ג של חומר צמחי ומוציאים סך הכל RNA. ביצוע qRT-PCR כדי לקבוע את הביטוי של גנים צמחיים (או גנים פטרייתיים) עם התפשטות (ראה19).

7. ניתוח הנתונים

  1. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן (± SD) בהתבסס על השכפולים הביולוגיים.
  2. חשב את הערכים היחסיים על ידי חלוקת כל התוצאות מהקבוצה הנגועה בתוצאה של הפקד. הצג את הממוצע כ, לדוגמה, "יחסית ללעג" או "יחסית לסוג פראי".
  3. קביעת מובהקות סטטיסטית בין קבוצות.

figure-protocol-1
איור 1: הידור של שלוש מערכות החיסון ושלבים בודדים בפרוטוקולים. נתונים אלה ממחישים את המערכות באמצעות מודל הצמח Arabidopsis thaliana. עבור מיני צמחים אחרים, יש להתאים את התזמון. תיבות כתומות מדגישות, שעבורן הניתוחים הבאים מומלצים ביותר עם המערכת המתאימה. (A) עבור מערכת החיסון בצלחות פטרי17, שפכו את המדיום ותנו לו להתמצק. שמור את הצלחות במקרר למשך הלילה. לאחר מכן, חותכים ומסירים את השליש העליון כמו גם את תעלת ההדבקה (IC) עם אזמל (אזורים לבנים באיור הוסרו מהאגר, בעוד אזורים כחלחלים מייצגים את האגר). מניחים את הזרעים על המשטח החתוך וסוגרים את כלי הפטרי. לאחר הריבוד, מניחים את הלוחות בצורה אנכית ונותנים לצמחים לצמוח. לאחר שרוב השורשים הגיעו לתעלת הזיהום, הוסיפו את תמיסת הנבגים עם פיפטה ישירות לתעלה. ודא שהפתרון מופץ באופן שווה. סגרו את צלחות הפטרי ודגרו אותן אנכית בתא צמיחה. גישות שעשויות לבוא בעקבותיהן הן ניתוח ביטוי עם PCR של שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR), מיקרוסקופיה עם קווי כתב, וכימות של דנ"א מיקרוביאלי. (ב) עבור מערכת החיסון בכוסות פלסטיק19, יוצקים את המדיום ומעבירים את שכבת הפלסטיק המפרידה עם החורים הטרומיים (ארבעה חורים קטנים בפינות להנחת הזרעים וחור אחד גדול במרכז לתעלת ההדבקה). תנו למדיום להתגבש. חותכים ומסירים את מדיום האגר בחור המרכזי עם אזמל כדי לקבל את תעלת הזיהום (IC). לגרד את המדיום בחורים הקטנים יותר ולהעביר את הזרעים. סגור את הכוס עם הפוכה ואטם עם סרט חדיר לאוויר (מסומן בצהוב). תנו לצמחים לגדול. לחיסון, הוסיפו את תמיסת הנבגים עם פיפטה ישירות לתעלת הזיהום. סגור את המערכת והמשך הטיפוח בתא הגידול. גישות שעשויות לבוא בעקבותיהן הן ניתוח ביטוי עם qRT-PCR, כימות של דנ"א מיקרוביאלי וקביעת משקל טרי, אזור עלה או מאפייני מחלה אחרים. (ג) "חיסון טבילת שורשים"15,17,23,24: עבור מערכת החיסון מבוססת הקרקע, מלאו את העציצים בתערובת אדמה:חול. העבירו את הזרעים ותנו לשתילים לצמוח. חפרו צמחים בגודל דומה ושטפו את השורשים במים. מניחים את השורשים השטופים בצלחת פטרי המחזיקה את התמיסה עם הנבגים. לאחר הדגירה, להכניס צמחים בודדים בעציצים עם אדמה. גישות שעשויות לבוא בעקבותיהן הן ניתוח ביטוי בעלים עם qRT-PCR, כימות של דנ"א מיקרוביאלי וקביעת משקל טרי, אזור עלים או מאפייני מחלה אחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, הצמחים טופחו וחוסנו ב-V. longisporum (זן Vl4325) או V. dahliae (לבודד JR218). תרחישים שונים נועדו להוכיח את היעילות ולהדגיש כמה יכולות של הפרוטוקולים הנתונים. מוצגות תוצאות מייצגות.

אינדוקציה אקספרסיבית של גנים המעורבים בביוסינתזה של אינדול-גלוקוזינולט אנטי-מיקרוביאלי (IG) היא אינדיקטור אמין להערכת זיהום Verticillium 17,19,26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל הפסדי היבול העצומים הנגרמים על ידי פיטופתוגנים הנישאים בקרקע1, נדרש שיפור של אסטרטגיות חקלאיות או זני יבולים. התובנה המוגבלת לגבי הפתוגנזה של מחלות המועברות בקרקע מעכבת את התפתחותם של צמחים עמידים יותר. יש לחקור את הפתומכניזמים הבסיסיים, שעבורם נדרשת פלטפורמה מתודולוגית איתנה. נהלי חיסון מדווחים הראו כי אירועים מולטי-פקטוריאליים באינטראקציות בין שורשים לחיידקים יכולים להיות מנותחים היטב על ידי שילוב של מערכות שונות19. הפרוטוקולים שתוארו לעיל נועדו לספק זרימת עבודה שגרתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לטים איבן וז'קלין קומורק על עבודה קודמת על שיטות אלה, לקבוצה של וולפגנג דרוגה-לייזר (המחלקה לביולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת וירצבורג, גרמניה) על שסיפקו את הציוד והמשאבים הדרושים לעבודה זו, ואת וולפגנג דרוגה-לייזר וכן את פיליפ קרייש (שניהם מאוניברסיטת וירצבורג) על הגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגר (גלרייט)קארל רות'מס' 0039כל המערכות המתוארות דורשות תוכנת Gelrite
Arabidopsis thalianaמלאי NASCCol-0 (N1092)
AutoclaveSystecVE-100
BlattFlaecheDatinf GmbHBlattFlaecheכדי לקבוע שטחי עלים
Brassica napus סוג פראראה Floerl et al., 2008אונס מהיר מחזורACaacc
Cefotaxime נתרןDuchefaC0111
בקבוק שיקנות 500 מ"לDuran Group / neoLabE-1090בקבוק Erlenmeyer עם ארבעה בלבול
צינורות איסוף 50 מ"לSarstedt62.547.254114 x 28 מ"מ
מרק דקסטרוז צ'אפק מצלמהבינונית DuchefaC1714
NikonD3100 18-55 VR
Exsiccator (מייבש )Duran Group200 DN, 5.8 ליטראטם עם מכסה להחזקת גז כלור
מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaLeica TCS SP5 II
HClCarlRoth P074.3
KNO3Carl RothP021.1≥ 99 %
KOHCarl Roth6751
LeukoporBSN medical GmbH2454-00 APסרט לא ארוג 2.5 ס"מ x 9.2 מ'
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)Carl Roth4256.2Pufferan ≥ 99 %
MgSO4Carl RothT888.1מגנזיום סולפט-הפטאהידראט
מוראשיג'ה & Skoog בינוני (MS)DuchefaM0222MS כולל ויטמינים
NaClOCarl Roth9062.1
תאי גידול PercivalCLF Plant Climatics GmbHAR-66L2
Petri-dishesSarstedt82.1473.001גודל Ø xH: 92 ופעמים; כוסות פלסטיק 16 מ"מ
(500 מ"ל, שקופות)Pro-pac, קופסת סלט5070גודל: 108 ופעמים; 81 ופעמים; 102 מ"מ
מסנן תאית קפליםHartensteinFF12רמת שימור חלקיקים 8– 12 μ m
תא גידול פוליקלימה פולי קלימה GmbHPK 520 WLED
תפוחי אדמה מרק דקסטרוז בינוניSIGMA AldrichP6685למיקרוביולוגיה
סיריםPö ppelmann GmbHTO 7 D או TO 9,5 DØ 7 cm resp. Ø 9.5 ס"מ
PromMYB51::YFPsee Poncini et al., 2017MYB51 reporter lineYFP (כלומר 3xmVenus עם NLS)
צינורות תגובה 2 מ"לSarstedt72.695.400PCR ביצועים נבדקו
שייקר סיבובי (מסלולי)Edmund Bü hlerSM 30 C בקרת
חול (חול ציפורים)ביסטרו לחיות מחמד, Mü ller Holding786157
SoilEinheitserde spezialSP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum סוג ברראה Chavarro-Carrero et al., 2021סוג: תא
ThomaMarienfeld642710עומק 0.020 מ"מ; 0.0025 מ"מ2
מים טהורים במיוחד (Milli-Q מים מטוהרים) מים מטוהריםMERKIQ 7003/7005המתקבלים לאחר טיהור
Verticillium dahliaeראה Reusche et al., 2014isolate JR2
Verticillium longisporumZeise and von Tiedemann, 2002זן Vl43
מסוג פרא גנום דיגיטלית ספירת תאים Moneymaker

מקורות

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97(2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156(2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988(2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129(2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876(2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57(2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

החדרת נבגים לשורשיםהדבקת שורשי צמחיםאינטראקציות בין מיקרובים לשורשיםמיני Verticilliumבדיקות פתוגניותביטוי גנים מסמניםArabidopsis thalianaמערכת מבוססת קרקעהדברה בשיטת טבילת שורשים
אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.