פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע
במאמר זה
סיכום
תקציר
בריזוספירה יש קהילה מיקרוביאלית מורכבת ביותר שבה שורשי הצמח מאותגרים כל הזמן. שורשים נמצאים במגע הדוק עם מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, אך מחקרים על אינטראקציות הנישאות בקרקע עדיין נמצאים מאחורי אלה המבוצעות על איברים מעל פני הקרקע. אף על פי שכמה אסטרטגיות חיסון להדבקת צמחי מודל בפתוגנים שורשיים לדוגמה מתוארות בספרות, עדיין קשה לקבל סקירה מתודולוגית מקיפה. כדי להתמודד עם בעיה זו, מתוארות במדויק שלוש מערכות חיסון שורשים שונות שניתן ליישם כדי לקבל תובנות על הביולוגיה של אינטראקציות שורש-מיקרובים. לשם המחשה, מיני Verticillium (כלומר, V. longisporum ו - V. dahliae) שימשו כפתוגנים פולשי שורשים. עם זאת, ניתן להתאים את השיטות בקלות לחיידקים אחרים המתיישבים בשורשים - הן פתוגניים והן מועילים. על ידי התיישבות הצמח xylem, פטריות הנישאות בקרקע כלי דם כגון Verticillium spp. מציגות אורח חיים ייחודי. לאחר פלישת השורשים, הם מתפשטים דרך כלי הקסילם באופן אקרופטלי, מגיעים לירי ומעוררים תסמיני מחלה. שלושה מיני צמחים מייצגים נבחרו כמארחים לדוגמה: אראבידופסיס תליאנה, אונס זרעי שמן חשוב מבחינה כלכלית (Brassica napus) ועגבניות (Solanum lycopersicum). פרוטוקולים שלב אחר שלב ניתנים. מוצגות תוצאות מייצגות של מבחני פתוגניות, ניתוחי שעתוק של גנים של סמנים ואישורים בלתי תלויים על ידי מבנים מדווחים. יתר על כן, היתרונות והחסרונות של כל מערכת חיסונים נדונים ביסודיות. הפרוטוקולים המוכחים האלה יכולים לסייע במתן גישות לשאלות מחקר על יחסי גומלין בין שורש למיקרובים. הכרת האופן שבו צמחים מתמודדים עם מיקרובים בקרקע היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשיפור החקלאות.
מבוא
קרקעות טבעיות מאוכלסות על ידי מספר מדהים של מיקרובים שיכולים להיות ניטרליים, מזיקים או מועילים לצמחים1. פתוגנים צמחיים רבים נישאים באדמה, מקיפים את השורשים ותוקפים את האיבר התת-קרקעי. מיקרואורגניזמים אלה שייכים למגוון רחב של קלדות: פטריות, אומיצטים, חיידקים, נמטודות, חרקים וכמה וירוסים 1,2. ברגע שתנאי הסביבה מעדיפים זיהום, צמחים רגישים יחלו ותנובת היבולים תרד. ההשפעות של שינויי האקלים, כגון התחממות כדור הארץ וקיצוניות מזג האוויר, יגדילו את שיעור הפתוגנים הצמחיים הנישאים בקרקע3. לכן, יהיה חשוב יותר ויותר לחקור את המיקרובים ההרסניים האלה ואת השפעתם על ייצור מזון ומ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מדיה לתרבויות פטרייתיות ומערכות חיסון צמחים
- מרק דקסטרוז תפוחי אדמה נוזלי (PDB): מכינים 21 גרם/ליטר PDB במים אולטרה-אפורים בבקבוקון יציב בחום.
- מרק Czapek Dextrose נוזלי (CDB): מכינים 42 גרם/ל' CDB במים אולטרה-אפורים בבקבוקון יציב בחום.
- בינוני למערכת החיסון של צלחת פטרי: הכינו בקבוקון יציב בחום עם 1.5 גרם/ל' מוראשיגה ומדיום סקוג (MS) ו-8 גרם/ל' אגר במים אולטרה-אפורים.
הערה: הימנעו מסוכר במדיום זה מכיוון שהוא יוביל לצמיחה פטרייתית מוגזמת לאחר החיסון. - בינוני עבור מערכת החיסון על בסיס פלסטיק: הכינו בקבוקון יציב בחום עם 4.4 גרם/ליטר MS, 0.2 גרם/ל' MgSO4, 1 גרם/ל' KNO3, 0.5 גרם/ל' 2-(N-מורפו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול, הצמחים טופחו וחוסנו ב-V. longisporum (זן Vl4325) או V. dahliae (לבודד JR218). תרחישים שונים נועדו להוכיח את היעילות ולהדגיש כמה יכולות של הפרוטוקולים הנתונים. מוצגות תוצאות מייצגות.
אינדוקציה אקספרסיבית של גנים המעורבים בביוסינתזה של אינדול-גלוקוזינולט אנטי-מיקרוביאלי (IG) היא אינדיקטור אמין להערכת זיהום Verticillium 17,19,26.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בשל הפסדי היבול העצומים הנגרמים על ידי פיטופתוגנים הנישאים בקרקע1, נדרש שיפור של אסטרטגיות חקלאיות או זני יבולים. התובנה המוגבלת לגבי הפתוגנזה של מחלות המועברות בקרקע מעכבת את התפתחותם של צמחים עמידים יותר. יש לחקור את הפתומכניזמים הבסיסיים, שעבורם נדרשת פלטפורמה מתודולוגית איתנה. נהלי חיסון מדווחים הראו כי אירועים מולטי-פקטוריאליים באינטראקציות בין שורשים לחיידקים יכולים להיות מנותחים היטב על ידי שילוב של מערכות שונות19. הפרוטוקולים שתוארו לעיל נועדו לספק זרימת עבודה שגרתי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים לטים איבן וז'קלין קומורק על עבודה קודמת על שיטות אלה, לקבוצה של וולפגנג דרוגה-לייזר (המחלקה לביולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת וירצבורג, גרמניה) על שסיפקו את הציוד והמשאבים הדרושים לעבודה זו, ואת וולפגנג דרוגה-לייזר וכן את פיליפ קרייש (שניהם מאוניברסיטת וירצבורג) על הגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגר (גלרייט) | קארל רות' | מס' 0039 | כל המערכות המתוארות דורשות תוכנת Gelrite |
| Arabidopsis thaliana | מלאי NASC | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | כדי לקבוע שטחי עלים |
| Brassica napus סוג פרא | ראה Floerl et al., 2008 | אונס מהיר מחזור | ACaacc |
| Cefotaxime נתרן | Duchefa | C0111 | |
| בקבוק שיקנות 500 מ"ל | Duran Group / neoLab | E-1090 | בקבוק Erlenmeyer עם ארבעה בלבול |
| צינורות איסוף 50 מ"ל | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 מ"מ |
| מרק דקסטרוז צ'אפק מצלמה | בינונית Duchefa | C1714 | |
| Nikon | D3100 18-55 VR | ||
| Exsiccator (מייבש ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 ליטר | אטם עם מכסה להחזקת גז כלור |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl | Roth P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | סרט לא ארוג 2.5 ס"מ x 9.2 מ' |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | מגנזיום סולפט-הפטאהידראט |
| מוראשיג'ה & Skoog בינוני (MS) | Duchefa | M0222 | MS כולל ויטמינים |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| תאי גידול Percival | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | גודל Ø xH: 92 ופעמים; כוסות פלסטיק 16 מ"מ |
| (500 מ"ל, שקופות) | Pro-pac, קופסת סלט | 5070 | גודל: 108 ופעמים; 81 ופעמים; 102 מ"מ |
| מסנן תאית קפלים | Hartenstein | FF12 | רמת שימור חלקיקים 8– 12 μ m |
| תא גידול פולי | קלימה פולי קלימה GmbH | PK 520 WLED | |
| תפוחי אדמה מרק דקסטרוז בינוני | SIGMA Aldrich | P6685 | למיקרוביולוגיה |
| סירים | Pö ppelmann GmbH | TO 7 D או TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 ס"מ |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (כלומר 3xmVenus עם NLS) |
| צינורות תגובה 2 מ"ל | Sarstedt | 72.695.400 | PCR ביצועים נבדקו |
| שייקר סיבובי (מסלולי) | Edmund Bü hler | SM 30 C בקרת | |
| חול (חול ציפורים) | ביסטרו לחיות מחמד, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum סוג בר | ראה Chavarro-Carrero et al., 2021 | סוג: תא | |
| Thoma | Marienfeld | 642710 | עומק 0.020 מ"מ; 0.0025 מ"מ2 |
| מים טהורים במיוחד (Milli-Q מים מטוהרים) מים מטוהרים | MERK | IQ 7003/7005 | המתקבלים לאחר טיהור |
| Verticillium dahliae | ראה Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | זן Vl43 |
מקורות
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
