מאמר שיטה

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63493

⸱

17 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

תקציר

ריצוף הדור הבא זכה לחשיבות גוברת ביישום הקליני בקביעת וריאנטים גנטיים. בבדיקה הגנטית שלפני ההשתלה, לטכניקה זו יש יתרונות ייחודיים במדרגיות, בתפוקה ובעלות. עבור הבדיקה הגנטית טרום השרשה לניתוח אנאופלואידיה, מערכת ריצוף הדור הבא (NGS) המבוססת על מוליכים למחצה המוצגת כאן מספקת גישה מקיפה לקביעת וריאנטים גנטיים מבניים ברזולוציה מינימלית של 8 Mb. מרכישת המדגם ועד לדוח הסופי, תהליך העבודה דורש שלבים מרובים תוך הקפדה על פרוטוקולים. מכיוון שצעדים קריטיים שונים יכולים לקבוע את תוצאת ההגברה, איכות הספרייה, כיסוי הקריאות ופלט הנתונים, מידע תיאורי עם הדגמה חזותית שאינה מילים יכול להציע פרטים נוספים לפעולה ולמניפולציה, מה שעשוי להשפיע רבות על התוצאות של כל השלבים הקריטיים. השיטות המוצגות כאן יציגו את ההליכים המעורבים בהגברה גנומית שלמה (WGA) של תאי Trophectoderm (TE) בביופסיה, בניית ספרייה גנומית, ניהול רצפים, ולבסוף, הפקת דוחות של מספרי עותקים.

מבוא

Aneuploidy היא חריגה במספר הכרומוזומים על ידי נוכחות של כרומוזום אחד או יותר או היעדר כרומוזום אחד או יותר. עוברים הנושאים סוג כלשהו של אנאופלואידיה, כגון אובדן של כרומוזום X אחד (תסמונת טרנר), עותקים נוספים של אוטוזומים, כמו טריזומיות של אוטוזום 21 (תסמונת דאון), 13 (תסמונת פטאו) ו-18 (תסמונת אדוארדס), או כרומוזומי מין נוספים כגון 47, XXY (תסמונת קליינפלטר) ו-47, XXX (תסמונת טריפל X), יכולים לשרוד עד לתקופה עם מומים מולדים1. Aneuploidy הוא הגורם העיקרי להפלות בשליש הראשון ולכישלון הפריה חוץ גופית (IVF)2. הוא דיווח כי שיעור aneuploidy יכול לנוע בין 25.4%-84.5% דרך שכבות הגיל השונות של מחזור טבעי וקבוצת ביקורת תרופתית בפועלIVF 3.

טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא מיושמת בפראות בקביעת מידע גנטי מבחינה קלינית; הוא מספק גישה מעשית לרצף הגנום ביעילות ובתפוקה גבוהה. במיוחד, ריצוף הדור הבא גם חולל מהפכה באבחון הפרעות עם גורמים גנטיים ובדיקות לחריגות בגנום4. באמצעות טכנולוגיית ריצוף מוליכים למחצה להעברה ישירה של אותות כימיים בריצוף תגובה ביולוגית לנתונים דיגיטליים, מערכת הרצף מבוססת המוליכים למחצה מספקת זיהוי ישיר בזמן אמת לנתוני רצף תוך 3-7 שעות 5,6.

בהליך הפריה חוץ גופית, בדיקה גנטית טרום השרשה (PGT) בוחנת את הפרופיל הגנטי של העובר לפני שהוא מועבר לרחם כדי לשפר את תוצאת ההפריה החוץ גופית ולהפחית את הסיכון להפרעות גנטיות בתינוקות 1,7. ב-PGT בשילוב עם טכניקות NGS, חומר גנטי המופק מפחות מ-10 תאים מוגבר באמצעות ערכות הגברה של גנום שלם או ריאגנט להגברת גנום שלם שפותח באופן עצמאי. זה דורש רק שלב אחד בשלב ההגברה ואינו דורש קדם-הגברה, כדי לקבל תוצרי הגברה של גנום שלם. פריימרים או לוחות עבור וריאנט מספר עותק וריצוף מיוחד של לוקי גנים מתוכננים ומיושמים בספרייה שנבנתה.

תהליך עבודה טיפוסי של בדיקות גנטיות טרום השרשה-אנופלואידיה (PGT-A) ב- NGS כרוך בהליכים סדרתיים, ודורש עומס עבודה אינטנסיבי של אנשי מעבדה8. פעולה שגויה מסוימת הנגרמת להחזרת הליכים עלולה להוביל לאובדן לא רצוי של זמן ומשאבים של המעבדה. נוהל הפעלה סטנדרטי תמציתי וברור (SOP) עבור זרימת עבודה של PGS-NGS מועיל; עם זאת, פרוטוקולים בתבנית תמלילים אינם יכולים להציג מידע מפורט יותר על עיבוד לדוגמה, מניפולציה של מכשירים והגדרות מכשירים, שניתן להמחיש בפרוטוקול וידאו. במאמר זה, זרימת עבודה מאומתת בשילוב עם הדגמה חזותית של פרטי הפעלה יכולה להציע פרוטוקולי הפניה ישירים ואינטואיטיביים יותר בתרגול PGT בפלטפורמת רצף מוליכים למחצה.

הפרוטוקול כאן מתאר שיטה התומכת באצווה של עד 16 ביופסיות עוברים במקביל. עבור אצוות גדולות יותר, מומלץ להשתמש בפרוטוקול מסחרי מבוסס ערכה לריצוף מוליכים למחצה, כגון Reproes-PGS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים והביופסיה של trophectoderm (TE) (סעיף 1.1.1.1) שיושמו במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של בית החולים מס '924 ב -18 בספטמבר 2017 (NO: PLA924-2017-59). המטופלים/המשתתפים מסרו את הסכמתם מדעת בכתב להשתתף במחקר זה.

1. בידוד DNA מביופסיה של עובר אנושי והגברה גנומית שלמה

  1. פרוטוקול להגברת גנום שלם 9,10
    הערה: ערכת Pico PLEX WGA משמשת לביצוע הגברה של גנום שלם.
    1. איסוף ואחסון דגימות
      1. ביופסיית Trophectoderm: שאבו בממוצע שישה עד תשעה תאים מפריצות TE של עובר D5/6 לאחר סיוע בבקיעה כדי לקבל כמות מאושרת של דנ"א להגברה הבאה.
      2. העבר את תאי הדגימה לצינור PCR ב-5 μL של PBS.
      3. מיד להקפיא את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס אם הפרוטוקול אינו ממשיך ישירות למיצוי ה- DNA.
    2. תזה תאית
      הערה: קובץ משלים 1 מפרט ומשמש כהפניה לנפחים המומלצים של כל רכיב בעת הכנת תערובת האב במהלך תזה של תאים והגברה גנומית שלמה של אצוות של 1, 8, 16 ו-32 דגימות (עם עודף כדי להתאים לשגיאות פיפטינג). בעת גיבוש תערובות אב אחרות של פרוטוקול זה, הנפח של כל רכיב גדל בנוסף כדי להתאים לצריכת הרכיבים הנגרמת על ידי פיפטים חוזרים ונשנים. כל צנטריפוגה קצרה מבוצעת על מיני צנטריפוגה שולחנית עבור 2-10 שניות בטמפרטורת החדר (RT), עם סל"ד קבוע של 10,000 עם כוח צנטריפוגלי של 5,300 x גרם. הכוח הצנטריפוגלי חייב להיות בין 2,000 x g ל 12,000 x g.
      1. הכן את תערובת תזה התאית עם 4.8 μL של מאגר דילול אנזים המיצוי ו-0.2 μL של אנזים מיצוי התא לכל דגימה.
      2. פיפטה 5 μL של תזה התא המוכן טרי לערבב לתוך כל דגימת תאים 5 μL בצינורות PCR, וצנטריפוגה קצרה את הצינור ב RT במשך 5 שניות. אין מערבל את הצינור.
      3. לדגום את הדגימה במחזור תרמי כדלקמן: 75 מעלות צלזיוס, 10 דקות; 95 מעלות צלזיוס, 4 דקות; 25 מעלות צלזיוס, 14 דקות צנטריפוגה קצרה (5 שניות) הצינור לאחר הדגירה.
    3. הגברה מוקדמת של כל הדנ"א הגנומי
      1. הכינו את תערובת קדם-ההגברה עם 4.8 μL של חיץ קדם-מגבר ו-0.2 μL של אנזים קדם-אמפר לכל דגימה.
      2. פיפטה 5 μL של תערובת טרום הגברה לתוך צינורות הדגימה דרך קירות הצינור, וצנטריפוגה קצרה במשך 3 שניות. הימנע מהקצה להגיע לתחתית הצינור, ואל תערבל את הצינור.
      3. דגירה של הדגימה בהתאם לתוכנית המחזור התרמי המוזכרת בטבלה 1.
    4. הגברה של דנ"א גנום שלם
      1. צנטריפוגה קצרה של הדגימה במשך 5 שניות ומניחים את מוצר הדגירה שלפני המגבר על קרח.
      2. הכינו את כל תערובת ההגברה של הגנום עם 25 μL של מאגר ההגברה, 0.8 μL של אנזים ההגברה, ו-34.2 μL של מים ללא נוקלאז לכל דגימה.
      3. מערבבים 60 μL של תערובת ההגברה של הגנום השלם שזה עתה הוכנה עם 15 μL של מוצר הדגירה שלפני האמפר; הנפח הכולל צריך להיות 75 μL. בקצרה צנטריפוגה במשך 5 שניות. הימנע מהקצה להגיע לתחתית הצינור, ואל תערבל את הצינור.
      4. הנח את צינור ה- PCR על המחזור התרמי והפעל את תוכנית המחזור התרמי המוזכרת בטבלה 2.
      5. צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר במשך 5 שניות ולהעביר את המוצרים לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.
      6. לכמת את ריכוז המוצר WGA עם פלואורומטר11. ניתן לאחסן דגימות באופן זמני בטמפרטורה של -20°Cלמשך פחות מחודשיים אם לא ממשיכים לשלב הבא.
  2. פרוטוקול של ריאגנטים WGA שפותחו באופן עצמאי.
    1. איסוף ואחסון דגימות
      1. שאבו את התאים מהעובר D5/6 לאחר סיוע בבקיעה להגברה הבאה.
      2. העבר את תאי הדגימה עם 1.5 μL של PBS לתוך צינור PCR המכיל 2 μL של PBS.
        הערה: PBS אינו מכיל מ"ג 2+ ו-Ca2+.
      3. הקפיאו את הדגימות מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס אם לא המשיכו ישירות לפרוטוקול מיצוי הדנ"א.
    2. תזה תאית
      1. הממיסו את חיץ התזה של התא (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM נתרן פירופוספט, 2 mM β-גליצרופוספט, 0.1% SDS) ב-RT והניחו אותו על הקרח. הוסף 2 μL של מאגר תזה של תאים לכל דגימה, וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות).
        הערה: אין מערבל את הצינור, והימנע מקצה הפיפטה לגעת במשטח הנוזל בצינור כדי להימנע מהבאת תאים או דנ"א ממערכת התגובה.
      2. דגירה של הדגימה במחזור תרמי כדלקמן: 55 °C (75 °F), 20 דקות; 95 מעלות צלזיוס, 10 דקות; 4 °C, להחזיק. צנטריפוגה קצרה של הצינור ב- RT במשך 10 שניות לאחר הדגירה.
    3. הגברה של דנ"א גנום שלם
      1. צנטריפוגה קצרה של מוצר תזה התא במשך 5 שניות ומניחים אותו על קרח.
      2. הכינו את תערובת ההגברה של הגנום כולו לכל דגימה על ידי ערבוב עם 16 μL של תמיסה מעורבת מראש, 1 μL של אנזים הגברה ו-28 μL של מים נטולי נוקלאז. מערבבים בעדינות, צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות), ומניחים את התערובת על קרח. אין מערבל את הצינור.
      3. פיפטה 45 μL של תערובת ההגברה של הגנום השלם שהוכנה זה עתה לתוך מוצר התסיסה התאית שהוכנה בשלב 1.2.2.2; מערבבים בעדינות וצנטריפוגה לזמן קצר במשך 5 שניות.
        הערה: אין למערבל את הצינור ולהימנע ממגע קצה הפיפטה בנוזל בצינור.
      4. הנח את צינור ה- PCR על המחזור התרמי והפעל את התוכנית כמפורט בטבלה 3.
      5. צנטריפוגה את הצינורות תוך זמן קצר במשך 5 שניות ולהעביר את המוצרים לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.
      6. כמת את ריכוז המוצר של WGA באמצעות פלואורומטר11 ורשום את התוצאות בגיליון ה- QA (ניתוח איכות). מוצרים עם ריכוזים מוסמכים ניתן לאחסן באופן זמני ב -20 מעלות צלזיוס במשך פחות מחודשיים אם לא המשיך לשלב הבא.

2. בחירת שברי הגברה

הערה: החומרים המשמשים בסעיף זה זמינים בערכת הכנת הספרייה (טבלת חומרים).

  1. הכנה לפני התחלה
    1. שיווי משקל של החרוזים המגנטיים (n x 100 μL) לטיהור ב-RT למשך 30 דקות.
    2. שחזר את המוצר הקודם של WGA ל- RT. מערבולת את המוצר ב- RT למשך 30 שניות לפני צנטריפוגה שלו לזמן קצר.
    3. הכינו 70% אתנול טרי.
  2. הליך בחירת מקטע
    1. פיפטה 25 μL של מוצרי WGA ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 25 μL של מים ללא נוקלאז טעון מראש.
    2. מערבלים ומערבבים היטב את חרוזי טיהור הדנ"א. Aliquot 50 μL ממנו לתוך כל צינור דגימה (דגימה מקורית: חרוזים (נפח) = 1:1), מערבולת, וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). הגדר את הצינור למשך 5 דקות ב- RT לתהליך קשירת ה- DNA.
    3. הכנס את צינור הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל לתוך מתלה מגנטים, והמתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לדופן הצינור. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    4. על פי נפח הדגימה המקורי, פיפטה 30 μL (מדגם מקורי: חרוזים (נפח) = 1:0.6) של חרוזים מגנטיים, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). הגדר את הצינור למשך 5 דקות ב- RT לתהליך קשירת ה- DNA.
    5. הכנס את צינורות הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל למדף המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לדופן הצינור. הסר בזהירות והשלך את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    6. פיפטה 300 μL של 70% אתנול לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל, בעדינות לסובב את הצינור פעמיים עם זווית של 180 מעלות, ולהזיז את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    7. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת.
    8. הסר את צינור הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל ממדף המגנטים והצנטריפוגה תוך זמן קצר (5 שניות). הכנס את הצינורות בחזרה למדף המגנטים, והמתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לדופן הצינור.
    9. בזהירות pipette החוצה את הנוזל הנותר בתחתית. השאירו את הצינור פתוח לייבוש החרוזים ב-RT למשך 3-5 דקות. יש להרחיק את הלחות מהחרוזים.
      הערה: סגור את המכסה מיד אם נוצרים סדקים על כדור החרוזים.
    10. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי, פיפטה 25-30 μL של מאגר ה- DNA elution לתוך צינור, ולסגור את המכסה ואת המערבולת. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי להביא את הנוזל העכור לתחתית הצינור, ולכוון את הצינור ב- RT למשך 5 דקות.
    11. הכנס את הצינורות בחזרה למדפים המגנטיים, והמתן עד שכל החרוזים יימשכו לדופן הצינור והסופר-נטנט יהפוך לשקוף. העבר בזהירות את תמיסת ה- DNA לצינורות צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    12. לכמת את ריכוז הדנ"א לאחר בחירת מקטעים עם פלואורומטר11, לאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, הריכוז של מקטע הדנ"א שנבחר נע בין 1.5-2.4 ng/μL.

3. הכנת ספריית הדנ"א12

הערה: החומרים המשמשים בסעיף זה זמינים בערכת הכנת הספרייה (טבלת חומרים).

  1. תיקון קצה
    1. שיווי משקל החרוזים המגנטיים ב-RT למשך 30 דקות.
    2. איזון מכפלת הדנ"א של בחירת מקטעים בשלב 2.2.12 עד RT. בדוק ורשום את התג על כל בקבוקון המכיל את הדנ"א.
    3. הכן את מערכת תיקון הקצה של הדנ"א עם 30 μL של מוצרי DNA, 10 μL של מאגר תיקון קצה, 0.5 μL של אנזים תיקון קצה, ו 9.5 μL של מים ללא נוקלאז בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. מערבבים את הצינור במשך 30 שניות וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) ב- RT כדי להביא את כל הנוזלים לתחתית הצינור.
    4. לדגור ב 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, וצנטריפוגה קצרה (5 שניות) את הצינור לאחר הדגירה.
    5. מערבולות או מערבבים לאחור את החרוזים המגנטיים, ומעבירים 75 μL של החרוזים המגנטיים לתוך צינור המכיל דגימות DNA שתוקנו סופית (דגימה מקורית: חרוזים (נפח) = 1:1.5). פיפטה או מערבולת עדינה כדי לערבב היטב את החרוזים וצנטריפוגה קצרה (5 שניות) כדי לסובב את כל המתלים עד לתחתית הצינור. הגדר את הצינור למשך 5 דקות ב- RT לתהליך קשירת ה- DNA. הופכים את הצינורות בעדינות כדי לשמור על החרוזים מפוזרים.
    6. הכנס את צינורות הצנטריפוגה לתוך מתלה המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן והסופר-נטנט הופך לשקוף. הסר את supernatant, ולהימנע pipetting החרוזים החוצה, שמירה על הצינורות על המדף בעת pipetting.
    7. העבירו 300 מיקרוגרם של 70% אתנול שהוכנו לאחרונה לתוך הצינורות, סובבו בעדינות את הצינורות פעמיים בזווית של 180°, והזיזו את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    8. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת.
    9. הסר את צינורות הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל ממדף המגנטים, ואת הצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). הכנס את הצינורות בחזרה למדף המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן הצינור.
    10. בזהירות פיפטה החוצה את הנוזל הנותר בתחתית. פתח את המכסה של צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל וייבש את החרוזים ב- RT במשך 3-5 דקות. יש להרחיק את הלחות מהחרוזים.
      הערה: סגור את המכסה מיד אם נוצרים סדקים על כדור החרוזים.
    11. פיפטה 33 μL של מאגר אלוטיון DNA לתוך צינור, לסגור את הכובע, מערבולת. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי להביא את המתלה העכור לתחתית הצינור ולהגדיר את הצינור ב- RT למשך 5 דקות.
    12. הכנס את הצינורות בחזרה למדפים המגנטיים, והמתן עד שכל החרוזים יימשכו לדופן והתמיסה תהפוך לשקופה. העבירו בזהירות את תמיסת הדנ"א לצינורות צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל עם התג המתאים, תוך הימנעות מלהוציא את החרוזים החוצה.
  2. קשירת ברקוד
    1. הניחו את ריאגנטים לקשירת ברקוד בשלב 3.2.2 על קרח כדי להמיס את כל הריאגנטים הקפואים.
    2. הכן את מערכת הקשירה עם 32 μL של מוצרי DNA שתוקנו סופית, 10 μL של מים ללא נוקלאז, 5 μL של חיץ ליגאז, 1 μL של ליגאז, ו 1 μL של P1 להתאים בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. הוציאו 1 μL מכל מגיב ברקוד לתוך תערובת התמיסה בצינור עבור דגימה אחת, מערבולת עבור 5 שניות, וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי לקבל את כל הנוזלים בתחתית הצינור.
      הערה: בעת הוספת הברקודים, ודא שמספר הברקודים והדוגמאות תואמים; פתח רק בקבוקון ברקוד אחד בכל פעם כדי למנוע זיהום מעורב של ברקודים; החלף את הכפפות עבור כל חמישה או שישה ברקודים שנוספו.
    3. לדגור את הצינורות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    4. פיפטה 75 μL (דגימה מקורית: חרוזים (נפח) = 1:1.5) של החרוזים המגנטיים לתוך צינור, פיפטה או מערבולת עדינה כדי לערבב את החרוזים היטב. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי לסובב את כל המתלים לתחתית, תוך הימנעות מצבירת חרוזים. הגדר את הצינור למשך 5 דקות ב- RT לתהליך קשירת ה- DNA. הופכים בעדינות את הצינורות כדי לשמור על פיזור החרוזים.
    5. הכנס את צינורות הצנטריפוגה לתוך מתלה המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן והסופר-נטנט הופך לשקוף. הסר את supernatant ולהימנע pipetting החרוזים החוצה, שמירה על הצינורות על המדף בעת pipetting.
    6. העבירו 300 μL של 70% אתנול שזה עתה הוכן לצינורות, סובבו בעדינות את הצינורות פעמיים בזווית של 180°, והזיזו את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    7. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת.
    8. הסר את צינורות הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל ממדף המגנטים והצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). הכנס את הצינורות בחזרה למדף המגנטים והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן הצינור. בזהירות פיפטה החוצה את supernatant הנותרים בתחתית.
    9. השאירו את מכסה הצינור פתוח לייבוש החרוזים ב-RT למשך 3-5 דקות. יש להרחיק את הלחות מהחרוזים.
      הערה: סגור את המכסה מיד אם נוצרים סדקים על כדור החרוזים.
    10. פיפטה 15 μL של חיץ ה-DNA לתוך הצינור. שוטפים את כדור החרוזים עד לתחתית הצינור, אוטמים את הפקק ומערבבים. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי להביא את המתלה העכור לתחתית הצינור ולשמור על יציבות הצינור ב- RT למשך 5 דקות.
  3. הגברה של שברים
    1. הניחו את בניין הספרייה על קרח כאשר המגיב הקפוא מתמוסס.
    2. מעבירים 47.5 μL מתערובת האנזימים ו-2.5 μL מתערובת הפריימר לתוך הצינור המכיל דנ"א וחרוזים מלוטשים, מערבולת במשך 5 שניות, וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי להעביר את כל הנוזלים לתחתית הצינור.
    3. הגדר את הצינור ב- RT למשך 5 דקות. החזירו את הצינורות למדפים מגנטיים, והמתינו עד שכל החרוזים יימשכו לדופן הצדדית והסופר-נטנט יהפוך לשקוף. העבירו בזהירות את תמיסת הדנ"א לצינורות PCR של 0.2 מ"ל עם תגים המסומנים בבירור, והימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    4. דגירה של הדגימה במערך מחזורי תרמי עם התוכנית הבאה: 72°C, 20 דקות; 98 מעלות צלזיוס, 2 דקות; 98 מעלות צלזיוס, 15 שניות; 62 מעלות צלזיוס, 15 שניות; 70 מעלות צלזיוס, דקה אחת (6 מחזורים); 70 מעלות צלזיוס, 5 דקות בקצרה צנטריפוגה (5 שניות) את הצינור כאשר התגובה היא סיימה ולאחסן את המוצרים ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. העבר את מוצרי ה- PCR לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (חיבור נמוך). הוסף 97.5 μL (נפח הדגימה המקורי: חרוזים (נפח) = 1:1.5) של חרוזים מגנטיים לתוך הצינור כאשר התגובה מסתיימת, פיפטה או מערבולת עדינה כדי לערבב את החרוזים היטב, וצנטריפוגה קצרה (5 שניות) כדי לסובב את כל הנוזל למטה לתחתית. הימנעו מצבירת חרוזים. הגדר את הצינור ב- RT למשך 5 דקות. הופכים בעדינות את הצינורות כדי לשמור על פיזור החרוזים.
    6. הכנס את צינורות הצנטריפוגה לתוך מתלה המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן הצדדית והסופרנטנט הופך לשקוף. הסר את הסופרנטנט, הימנע מלהוציא את החרוזים החוצה, ושמור על הצינורות יציבים על המדף.
    7. העבירו 300 μL של 70% אתנול שזה עתה הוכן לצינורות, סובבו בעדינות את הצינורות פעמיים בזווית של 180°, והזיזו את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
    8. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת.
    9. הסר את צינור הצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל ממדף המגנטים והצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). הכנס את הצינור בחזרה למדף המגנטים, והמתן 5 דקות עד שכל החרוזים המגנטיים נמשכים לדופן הצינור. בזהירות פיפטה החוצה את הנוזל הנותר בתחתית.
    10. השאירו את מכסה הצינור פתוח לייבוש החרוזים ב-RT למשך 3-5 דקות. יש להרחיק את הלחות מהחרוזים.
      הערה: סגור את המכסה מיד אם נוצרים סדקים על כדור החרוזים.
    11. פיפטה 22 μL של מאגר ה-DNA לתוך הצינור, לשטוף את כדור החרוזים כלפי מטה, ולסגור את הפקק והמערבולת. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות) כדי להביא את הנוזל העכור לתחתית הצינור ולכוון את הצינור ב- RT למשך 5 דקות.
    12. לכמת את הריכוז של ספריית DNA בנויה עם פלואורומטר11 ולאחסן את ספריית הדנ"א הבנויה ב -20 מעלות צלזיוס; הריכוז של מקטע הדנ"א שנבחר נע בין 0.6-10 ng/μL. קודד מחדש את פרטי הספרייה במסד הנתונים של הספרייה ואחסן את הדגימות בהתאם.

4. הכנת תבנית רצף13,14

הערה: החומרים המשמשים בסעיף זה זמינים בערכת ערכות הכנת התבנית (ריאגנטים/פתרונות/חומרים) של הערכה האוניברסלית לתגובות רצף (טבלת חומרים).

  1. תמהיל ספריות
    1. מלא את הטופס של גיליון רשומות טרום-הפעלה במערכת השרת ותייג את צינור הדגימה עם ריכוז הספרייה ומספר הברקוד. הימנע משימוש באותם ברקודים בדוגמאות שונות בריצה אחת.
    2. מערבלים ומערבבים את דגימת הספרייה, וצנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות). לדלל את כל הדגימות ל-100 pM עם מים נטולי נוקלאזות, מערבולת במשך 30 שניות, ולבצע צנטריפוגה קצרה של הדגימה.
      הערה: בהתחשב בכך שלדנ"א יש אורך ממוצע של 260 bp, ו- 1 bp הוא 660 g/mol, חשב את ההמרה של ng/μL ל-pM באמצעות המשוואה הבאה: 1 ng/μL = 5,827.5 pM/L.
    3. פיפטה 10 μL של 100 pM מדולל ספרייה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 mL, מערבולת במשך 30 שניות, וצנטריפוגה קצרה עבור 2 שניות. שמור את הספרייה המעורבת על קרח.
  2. הכנת תבנית
    1. הפעל את מערכת ההגברה של התבנית ובחר את התוכנית הנקייה. הוסיפו את שמן התגובה ל-1/2 מהצינור, והוסיפו את תמיסת שבירת האמולסיפייר ל-1/3 מהצינור.
    2. ודא שצלחת ההגברה ומתאם הכביסה מוגדרים במצב ON . נקו את בקבוק הפסולת, והכניסו מחט לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל לאיסוף פסולת. אשר את השלבים המעובדים על המסך של מערכת ההגברה של התבנית. לחץ על הבא כדי להפעיל תוכנית נקייה, אשר ייקח בערך 15 דקות.
    3. החלף את צלחת ההגברה בחדשה לאחר התוכנית הנקייה, הכנס את צינורות האיסוף המכילים 150 μL שבירת תמיסה II לתוך הרוטור, והנח את הגשר על צינורות האיסוף. הוסיפו את שמן התגובה ל-1/2 מהצינור ואת תמיסת שבירת האמולסיפייר ל-1/3 מהצינור.
    4. הכנת מגיב PCR מתחלב: יש לאזן את מאגר ה-PCR המתחלב ב-RT עד שהוא מתמוסס, לזמן קצר צנטריפוגה (5 שניות) את כל הריאגנטים, ולהניח אותם על קרח לפני השימוש.
    5. פיפטה 120 μL של תערובת אנזימי PCR מתחלבת, 100 μL של תבנית Ion Sphere Particle (ISP) buffer, 170.5 μL של מים נטולי נוקלאז, ו-9.5 μL של הספרייה המעורבת (100 pM) לתוך צינור המכיל 2,000 μL של חיץ PCR מתחלב. מערבבים היטב את התמיסה עם פיפטינג חוזר ונשנה.
      הערה: יש לטעון את התמיסה המעורבת במערכת ההגברה של התבנית תוך 15 דקות; בצע את כל ההליכים ב- RT.
    6. מקם מסנן חדש להכנת תבנית יציב על מדף הצינורות עם פורטל הדוגמה כלפי מעלה. מערבבים את התמיסה במשך 5 שניות, צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות), ומעבירים את התמיסה לפורטל המדגם של המסנן לאחר צנרת חוזרת ונשנית 800 μL שלוש פעמים. צנטריפוגה את הצינור כדי להקטין בועות לפני ההזרקה האחרונה. הימנעו מהזרקת אוויר למסנן. להזריק 200 μL של שמן תגובה II בעקבות תמיסה מעורבת.
    7. סובבו את השער לדוגמה של המסנן כלפי מטה, והחליפו את התאמת הכביסה במסנן. הכנס את מחט הדגימה לחור המרכזי של מכסה הרוטור ולאחר מכן לחץ על המחט לתחתית.
    8. לחץ על לחצן RUN על המסך, בחר את התוכנית בהתאם לערכה המתאימה ולחץ על ASSISTED כדי לבדוק את כל השלבים. לחץ על NEXT עד לתחילת הריצה; זה לוקח בערך 4.5 שעות כדי לסיים.
    9. לחץ על הבא בסיום התוכנית; המערכת תתחיל צנטריפוגה של 10 דקות. כאשר הצנטריפוגה נפסקת, לחץ על לחצן פתח מכסה והזז את צינורות האיסוף למדפים. אם ההליך לא עובר לשלב הבא תוך 15 דקות, לחץ על ספין סופי כדי להפעיל מחדש צנטריפוגה.
    10. הסר את supernatant בצינור האיסוף, משאיר 100 μL של תמיסה בצינור. מערבבים את הדגימה הנותרת על ידי פיפטינג ומעבירים את הדגימה לצינורות הצנטריפוגה החדשים בגודל 1.5 מ"ל המסומנים OT (מערכת One touch 2).
      הערה: בעת צנרת הסופר-נטנט, הימנעו מלגעת בתחתית הצינור לאורך הצד.
    11. פיפטה 100 μL של מים ללא נוקלאז לתוך כל אחד מצינורות האיסוף, ולהעביר תמיסה לצינור OT שטף עם פיפטינג חוזר. הוסף 600 μL של מים ללא נוקלאז לצינור OT כדי להפוך את הנפח הכולל 1 מ"ל, מערבולת במשך 30 שניות, וצנטריפוגה ב 15,500 x גרם במשך 8 דקות.
    12. הסירו בעדינות את הסופר-נטנט בצינור ה-OT כשנותרו 100 μL והשתמשו בקצה כדי להשליך את שכבת השמן ביסודיות. הוסיפו 900 μL של מים נטולי נוקלאזות, מערבולות במשך 30 שניות וצנטריפוגות בגודל 15,500 x g למשך 8 דקות.
    13. הסר את הסופר-נאטנט עד שיישארו 20 μL, הוסף פתרון החייאת תבנית כדי להפוך את הנפח ל-100 μL, מערבולת למשך 30 שניות, וצנטריפוגה קצרה למשך 2 שניות.
      הערה: הפתרון המתקבל בשלב זה חייב להמשיך לשלב הבא תוך פחות מ- 12 שעות.
    14. הפעל את התוכנית הנקייה במערכת הגברת התבנית לפני כיבוי כוחה.
  3. העשרת תבניות
    1. הכינו את תערובת ההמסה עם 280 μL של טווין-80 ו-40 μL של 1 M NaOH.
    2. שטפו את חרוזי C1. וורטקס פתרון החרוזים C1 במשך 30 שניות. העבר 100 μL של חרוזים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הכנס את הצינור על מתלה מגנטי למשך 2 דקות והשלך את הסופרנטנט.
    3. מעבירים 1 מ"ל מתמיסת שטיפת חרוזי C1 לתוך הצינור והמערבולת במשך 30 שניות. צנטריפוגה לזמן קצר (5 שניות), הכנס את הצינור לתוך המדף המגנטי למשך 2 דקות, והשלך את הסופרנטנט. Pipette 130 μL של C1 חרוז resuspension פתרון לתוך הצינור, ומערבבים את החרוזים על ידי pipetting חוזר. הימנעו מיצירת בועות.
    4. טען 100 μL של הספרייה המדוללת, 130 μL של חרוזי C1, 300 μL x 3 תמיסת שטיפת תבניות, ו- 300 μL של תמיסה נמסה לשמונה רצועות הבאר, כפי שמוצג באיור 1.
    5. התקן את שמונה רצועות הקידוח על מודול ההעשרה, טען את קצה הפיפטינג וקבע את צינור הצנטריפוגה 200 μL במצב האיסוף. לחץ על START כדי להפעיל את התוכנית; זה לוקח בערך 35 דקות.
    6. הדגימה תיאסף באופן אוטומטי בצינור צנטריפוגה 200 μL; סוגרים את המכסה ומפעילים אותו ב-15,500 x גרם למשך 5 דקות. בדוק את תחתית הצינור כדי לוודא אם נותרו חרוזי C1 כלשהם.
    7. אם חרוזי C1 נשארים, שוב ושוב פיפטה את פתרון התבנית 10x ולהכניס את הצינור על המדף המגנטי במשך 4 דקות. העבר את כל הסופר-נטנט לצינור צנטריפוגה חדש של 0.2 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 15,500 x גרם למשך 5 דקות.
    8. אם לא נותרו חרוזי C1 נראים לעין, יש להשליך את הסופר-נאטנט עד שיישארו 10 μL, להוסיף 200 μL של מים נטולי נוקלאז ולערבב על ידי צינורית פי 10. צנטריפוגה ב 15,500 x גרם במשך 5 דקות.
    9. השליכו את הסופר-נאטנט עם 10 μL שנותרו, והוסיפו 90 μL של מים נטולי נוקלאז כדי להגיע לנפח כולל של 100 μL. פיפטה למעלה ולמטה פי 10 כדי לערבב את התמיסה, מערבולת במשך 5 שניות, וצנטריפוגה קצרה (5 שניות). הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס במשך פחות מ 3 ימים.

5. רצף הדור הבא 9,15

הערה: כל ההליכים בסעיף זה מבוצעים בפלטפורמת הריצוף DA8600. החומרים המשמשים בסעיף זה זמינים בערכת ערכות הריצוף (ריאגנטים/פתרונות/חומרים) של הערכה האוניברסלית לתגובות רצף (טבלת חומרים).

  1. בדוק את כל הריאגנטים והחומרים הנדרשים בפלטפורמת ריצוף רציפה.
    1. ריאגנט ריצוף: בדוק את הזמינות של תמיסת אנזימי ריצוף (6 μL), פריימרים לריצוף (20 μL), תבנית בקרת איכות (5 μL) ו-dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), המאוחסנים בין -30-10 °C.
    2. פתרון ריצוף: בדוק את הזמינות של תמיסת ריצוף II (100 מ"ל), פתרון ריצוף III (50 מ"ל), חיץ חישול (1,015 μL), מאגר טעינה (10 μL), חומר מקציף (2 μL), טבליית כלור (טבליה אחת) וחרוזי סטרפטווידין (100 μL), המאוחסנים בטמפרטורה של 4 °C.
    3. חומרים: בדוק את הזמינות של צינור ריאגנטים 250 מ"ל (8), 250 מכסה צינור ריאגנטים (8), sipper II (8), sipper (1), בקבוק ריאגנט 2 L (1) ושבב רצף (1), המאוחסן ב- RT.
  2. יש לשטוף את השבב לפני השימוש.
    1. הגדר שבב אחד יציב על צלחת עבודה, להזריק 100 μL של מים ללא nuclease לתוך חור הדגימה, להסיר את הפתרון בפורטל החוצה, ולחזור על ההליך.
    2. הזרימו 100 μL של תמיסת NaOH של 0.1 M לתוך השבב ודגרו במשך דקה אחת ב-RT.
    3. להזריק 100 μL של isopropanol לתוך חור הדגימה, להסיר תמיסה נוספת בפורטל החוצה, ולחזור על ההליך שוב.
    4. כסו את השער החוצה בנייר סינון, הזרימו את החנקן כדי לייבש את האיזופרופנול הנותר בתא הזרימה של השבב, ושמרו על השבב המוכן לשימוש ב-RT.
  3. התחלת רצף
    1. הפעל את שסתום החנקן וכוונן את הלחץ ל -30 psi. הפעל את הרצף, לחץ על CLEAN במסך הראשי ובחר מים או כלוריד כדי לשטוף את המכונה בהתאם.
      הערה: יש לשטוף במים לפני כל הפעלה, לשטוף בכלוריד כל שבוע או בזמן שהמכונה עומדת עם ריאגנטים מעל 48 שעות.
    2. שטיפת כלוריד: בחרו בקבוק מגיב אחד שצוין לשטיפת כלוריד, שטפו את הבקבוק פעמיים במים ב-18 MΩ ומלאו את הבקבוק ב-1 ליטר מים של 18 MΩ. מכניסים טבליה אחת של כלוריד לבקבוק, ממיסים את הטבליה למשך 10 דקות, מוסיפים 1 מ"ל של 1 M NaOH, ואז הופכים את הבקבוק כדי לערבב את התמיסה. יש להשתמש בתמיסת הכלוריד תוך 3 שעות לאחר ההכנה.
    3. לסנן 100 מ"ל של תמיסת כלוריד עם מסנן 0.45 מיקרומטר ולאסוף עם שני צינורות. התקן את שני צינורות הכלוריד למיקומים C1 ו- C2. לחצו על CLEAN במסך הראשי וציידו שבב לשטיפת כלוריד.
    4. לחץ על NEXT ובדוק את כל השלבים על המסך כדי להפעיל את תוכנית הכביסה; התוכנית תסתיים בעוד 30 דקות. התחילו לשטוף במים לאחר שטיפת הכלוריד.
    5. שטיפת מים: סמן שני צינורות ספציפיים למים עם C1 ו- C2, ושטוף את הצינורות במים של 18 MΩ פעמיים. הוסף 100 מ"ל של 18 מים MΩ לכל אחד מצינורות שטיפת המים, וקבע אותם במיקומים C1 ו- C2, בהתאמה.
    6. בחר בתוכנית CLEAN , התקן את השבב שהוכן לשטיפת מים, לחץ על NEXT ולאחר מכן בדוק את כל השלבים על המסך כדי להפעיל את תוכנית הכביסה.
  4. אתחול
    1. נקו את בקבוק הכביסה עם תמיסת הכביסה II, סמנו אותו כ-W2 ושטפו אותו שלוש פעמים עם 18 MΩ מים.
    2. נקו את צינור החנקן עם נייר מונחה באוויר, הכניסו אותו לתחתית הצינור וכוונו את זרימת האוויר ל-0.5 ליטר לדקה. לפרוק את החמצן בבקבוק ולמלא את הבקבוק עם 1,920 מ"ל של 18 MΩ מים. הוסף תמיסת רצף II ו- 10 μL של 1 M NaOH לבקבוק, סגור את הפקק והפוך את הבקבוק מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה.
    3. סמן שני צינורות חדשים כ- W1 ו- W3. הוסף 32 μL של 1 M NaOH ל- W1, הוסף 40-50 מ"ל של פתרון רצף 1x III ל- W3, וסגור את המכסות.
      הערה: תמיסת רצף III אחת חייבת להיות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בעת השימוש הראשון. פתרון רצף II חייב להיות מוגן מפני אור ומאוחסן ב- RT. יש להחליף את בקבוק הכביסה בחדש לאחר השימוש בו 20 פעמים.
    4. לחץ על INITIALIZE במסך הראשי, שנה את הלגימה במיקומים W1, W2 ו- W3, הגדר את הצינורות למקומם בהתאם ואטם אותם בחוזקה על ידי סיבוב. התקן שבב לאתחול ובדוק את פרמטרי המדינה של המכונה.
    5. הקש NEXT כדי להפעיל את תוכנית האתחול; זה לוקח 40 דקות בחלק הראשון.
      הערה: יש להחליף את הכפפות לפני החלפת הלגימה החדשה כדי למנוע זיהום בגוף הלגימה. לאחר השימוש במים ואתחול, ניתן להחיל את השבבים על אתחול, אך אין להשתמש בשבבים המשמשים לשטיפת כלוריד לצורך אתחול.
    6. ממיסים dGTP, dCTP, dATP ו-dTTP על קרח, ומערבולות לערבוב. סמן ארבעה צינורות חדשים כ- G, C, A ו- T, ופיפטה 70 μL של התמיסה בהתאם לתג הצינור.
  5. הכן את הספריה לפעולה.
    1. הנח את תבנית בקרת האיכות, הפריימרים ותמיסת האנזימים על קרח.
    2. הכן את ספריית ה- DNA כאשר תוכנית האתחול נותרה כ -20 דקות. וורטקס תבנית בקרת האיכות ל-30 שניות לערבוב, וצנטריפוגה קצרה למשך 2 שניות. העבר 5 μL מתבנית בקרת האיכות לפתרון התבנית, מערבולת במשך 5 שניות, וצנטריפוגה של הצינור עבור 15,500 x g למשך 5 דקות. הסר את הסופר-נאטנט על ידי פיפטציה זהירה, הימנע מלגעת בכדור, והשאר נפח של 10 μL בצינור.
    3. הוסף 15 μL של חיץ חישול לתוך הצינור; הנפח הכולל של הפתרון הוא 25 μL.
    4. מערבולת את פריימריס הרצף כאשר הוא מתמוסס במלואו על קרח וצנטריפוגה לזמן קצר במשך 2 שניות. מעבירים 20 μL של פריימרים של הרצף לתוך הצינור מהשלב הקודם, מערבולת במשך 5 שניות, צנטריפוגה קצרה במשך 2 שניות, ולאחר מכן לאחסן ב- RT לפני השימוש.
  6. טעינת הדגימה והרצף
    1. Pipette 55 μL של פתרון המדגם מוכן בשלב הקודם להזריק אותו לתוך חור הדגימה של השבב.
    2. הגדר את השבב על הצנטריפוגה; שמור את החריץ כלפי חוץ ואת פורטל הדגימה בפנים, לאזן אותו עם שבב משומש אחר, צנטריפוגה במשך 10 דקות.
    3. הכן את פתרון הטעינה.
      1. ערבבו 0.5 מ"ל של חיץ החישול ו-0.5 מ"ל של מים נטולי נוקלאז בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. סמן אותו כמאגר חישול של 50% והשתמש בו תוך 7 ימים.
      2. מערבבים 0.5 מ"ל של תמיסת איזופרופנול ו-0.5 מ"ל של חיץ חישול. סמן אותו כמאגר כביסה של 50% והשתמש תוך 24 שעות.
      3. יש לערבב 6 μL של אנזים רצף ו-60 μL של 50% חישול. סמנו אותו כמאגר תגובה של אנזים, והניחו את התמיסה על הקרח לאחר ההכנה.
      4. יש לערבב 49 μL של חישול בנפח 50% ו-1 μL של חומר מקציף, ולסמן אותו כתמיסת קצף.
    4. לנשוף 100 μL של אוויר לתוך תמיסת הקצף, שוב ושוב פיפטה את התמיסה עד שהבועות נמצאות במצב קצף צפוף, ולשמור על נפח הקצף סביב 250 μL.
    5. מניחים את השבב על הספסל לאחר צנטריפוגה, מזריקים 100 μL של קצף לתוך חור הדגימה, ולהסיר את הפתרון extruded בפורטל החוצה. החזירו את השבב לצנטריפוגה, והצנטריפוגה לזמן קצר למשך 30 שניות.
    6. חזור על שלבים 5.6.4-5.6.5.
    7. יש להזריק 100 מיקרוליטר של 50% חיץ שטיפה פעמיים, ולהסיר את התמיסה המובלטת בשער החוצה לאחר כל הזרקה.
    8. יש להזריק 100 μL של חישול 50% חישול שלוש פעמים, ולהסיר את התמיסה המובלטת בפורטל החוצה לאחר כל הזרקה.
    9. הזריקו 65 μL של מאגר תגובה אנזימי 50%, הימנעו מבועות והסירו את התמיסה המובלטת בפורטל החוצה.
    10. ייצב את השבב הטעון ב- RT למשך 5 דקות, והתקן את השבב בפורטל שבב הרצף. בחר את התוכנית המתוכנתת בשלב 6, בדוק את המידע והתחל את הריצה; זה לוקח בערך 1.5 שעות כדי לסיים.
    11. בצע את תוכנית שטיפת המים תוך 72 שעות לאחר סיום הריצה. בצע את שטיפת הכלוריד לפני שטיפת המים כאשר הזמן עולה על 72 שעות. כבה את הרצף, וסגור את שסתום החנקן.

6. תכנון הרצת רצף מודרכת במערכת שרת הכתבים16

הערה: כל ההליכים בסעיף זה מבוצעים ב- Ion Proton Sequencer עם מערכת שרת המדווח.

  1. היכנס למערכת השרתים, בחר בכרטיסייה תוכנית ולחץ על הפעלת תבנית תוכנית. בחר את הגנום כולו כסוג הפעלה, ובחר את התבנית המתאימה מרשימת תבניות הריצה המתוכננות.
  2. בכרטיסיה תוכנית , הזן או בצע את הבחירות הבאות:
    1. הזן שם חדש של תוכנית הפעלה בהתאם לקבוצת הדגימות, בחר hg19 (הומו ספיינס) מהרשימה הנפתחת ספריית הפניות ובחר ללא מהרשימות הנפתחות אזורי יעד ואזורים חמים.
    2. הזן את מספר הברקודים המשמשים בערכת הדוגמאות, בחר ברקוד מהרשימה הנפתחת עבור כל דוגמה והזן שם תיאורי ייחודי, שיכול להועיל לקיבוץ הדוגמה ולמעקב אחריה. הימנע מהשימוש בדוגמה 1 המוגדרת כברירת מחדל וכן הלאה.
    3. בחר ללא בכרטיסייה כתב יונים , לחץ על הבא ובחר DNA ביישום ובגנום שלם כטכניקת היעד.
    4. בכרטיסיה ערכות , אמת את הבחירות או בצע שינויים בזמן שהן מתאימות להפעלה.
      1. בחר יון פלוס ערכת ספריית שברים מהרשימה הנפתחת סוג ערכת ספרייה . בחר ערכת Ion PI HI-Q OT2 200 ברשימה הנפתחת ערכת תבניות ובחר OneTouch כברירת המחדל. בחר יון PI HI-Q Sequencing 200 ערכה מהרשימה הנפתחת ערכת רצף .
      2. הזן 300 זרימות, בחר שבב Ion PITM מהרשימה הנפתחת סוג שבב ובחר IonXpress מהרשימה הנפתחת ערכת ברקוד .
      3. בטל את הבחירה באפשרות סמן כקריאות כפולות ואת הבחירה באפשרות אפשר יישור מחדש.
    5. בחר את התוסף המתאים בכרטיסייה תוספים כדי לבצע ניתוח נתונים בשלב 7. השלם את הבחירות בשלב הפרוייקטים, לחץ על הבא ולחץ על תוכנית הפעלה בפינה השמאלית התחתונה כדי לפרט את הריצות המתוכננות.
    6. בכרטיסייה ריצות מתוכננות , בחר את הריצה החדשה שנוצרה ובדוק את כל ההגדרות בחלון הסקירה.

7. ניתוח נתונים

  1. נתח את גרסאות מספרי ההעתקה (CNVs) באמצעות זרימת עבודה של ביואינפורמטיקה.
    הערה: ה- CNVs נותחו בתהליך עבודה ביואינפורמטי עם יישום אלגוריתם המבוסס על מודל מרקוב מוסתר (HMM)17; המודל משתמש בכיסוי קריאה על פני הגנום כדי לחזות את מספר העותק או את מצב הפלואידיות של המספר השלם (כלומר, 0, 1, 2, 3 וכו'). צינור הביואינפורמטיקה הכולל נבנה בתוסף של מערכת שרתי רצף, כפי שמודגם באיור 2. שלב הניתוח הביואינפורמטי אורך בממוצע 4 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר תוכנית הרצפים מסתיימת לאחר תהליך הריצה במכונה, מערכת שרת הרצפים מדווחת על הסיכום עם מידע תיאורי של נתונים שנוצרו, מצב שבב, קצב טעינה של ספק שירותי אינטרנט ואיכות הספרייה, כפי שמוצג באיור 2. בהדגמת תוצאות זו התקבלו 17.6 G נתונים בבסיס הכולל, ושיעור הטעינה הכולל של ISP היה 88% בסך הבארות של השבב; מפת החום הראתה שהדגימה הועמסה באופן שווה על השטח הכולל של השבב (איור 2A). בריצה הייצוגית התקבלו 99,761,079 קריאות בסך הכל, שבהן 77% היו שמישות; בכל הבארות הטעונות בס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנופלואידיה כרומוזומלית של עוברים היא הגורם לחלק גדול מאובדן ההריון, בין אם הגה באופן טבעי או הפריה חוץ גופית (IVF). בפרקטיקה הקלינית של הפריה חוץ גופית, מוצע כי סינון האנאופלואידיה של העובר והחזרת העובר האופלואידי יכול לשפר את התוצאה של הפריה חוץ גופית. הכלאה פלואורסצנטית באתרה היא הטכניקה המוקדמת ביותר שאומצה לבחירת מין ו- PGT-A; עם זאת, טכניקה זו דורשת מומחיות טכנית רבה יותר מאנשי המעבדה והיא דורשת עבודה רבה יחסית. מחקרים הולכים וגדלים של PGT-A באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה לא מראים שיפור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר ג'אנגיונג מינג ולמר רונגג'י הו על עצתם בנוגע ליישום מורחב של LIMS. מחקר זה נתמך על ידי פרויקטי מחקר מיוחדים של PLA לתכנון המשפחה (17JS008, 20JSZ08), קרן מעבדת המפתח של גואנגשי לחקר מחלות מטבוליות (מס '20-065-76), ופרויקט מחקר המדע והטכנולוגיה של בריאות האזרחים בגואנגג'ואו (201803010034).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 μ m יחידת מסנן מזרקMerkmilliporeMillex-HV
1.5 מ"ל DNA LoBind צינורותEppendorf30108051
15 מ"לגריינר ביו-וואן188261
2.0 mLDNA צינורות LoBindEppendorf30108078
50 מ"ל צינורותGreiner Bio-227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON
  מגיב Anstart Tap DNA פולימראזFAPON
AMPure XP (חרוזים מגנטיים לקשירת DNA)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
מאגר ליזה של תאיםהאוניברסיטההמכיל 40 מ"מ טריס (pH 8), 100 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 1 מ"מ אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 1% (v/v) טריטון X-100, 5 מ"מ נתרן פירופוספט, 2 מ"מ &בטא;-גליצרופוספט, 0.1% SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
מאגר פליטת DNANEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 מגנטחיים טכנולוגיות12321D
אלכוהול אתיליגואנגג'ואו מגיב כימי מפעל תרמו פישר מדעיhttp://www.chemicalreagent.com/
ריאגנטים להגברת גנום שלם שפותחו באופן עצמאיהאוניברסיטההרפואית הדרומית הריאגנטים מורכבים מהרכיבים הבאים:
1. ליזיס תאים
2. הגברה תמיסה מעורבת מראש
      1) פריימר WGA-P2 (10 μ M)
      2) dNTP (10 מ"מ)
      3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. אנזים הגברה
      1) Anstart Tap DNA פולימראז (5 U/μ L)
ערכת Ion PI Hi-Q OT2 200 ערכתThermo Fisher ScientificA26434המוזכרת בשלב 4.2.8
ערכת רצף Ion PI Hi-Q 200   תרמו פישר מדעיA26433
יון פרוטוןמערכת חיים טכנולוגיותחיים 4476610
יון מדווח שרתמערכת טכנולוגיות חיים4487118
איזופרופנולגואנגג'ואו כימי ריאגנט מפעלhttp://www.chemicalreagent.com/
ספרייה הכנת ערכתדאן גן ושות', בע"מ114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
חיי מים ללא נוקלאזAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 SystemLife Technologies4474779  תבניות הגברה והעשרה מערכת
צינורות PCRAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara Bio ארה"בR300671
טיפים לפיפטהמוצרים מדעיים איכותיים https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
צנטריפוגה ניידת LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 פלואורומטרחיים טכנולוגיותQ33216פלואורומטר
קיוביט מבחן צינורותחייםטכנולוגיות Q32856
קיוביט dsDNA HS ערכתבדיקה חיים טכנולוגיותQ32851
מערכת שרת רצףתרמו פישר מדעיסיקור חבילת תוכנה
רצף תגובות אוניברסלי ערכהדאן גן ושות', בע"מ113https://www.daangene.com/pt/certificate.html<> ערכה זו מכילה את הרכיבים הבאים:
1. ערכת הכנת תבנית

1.1 ערכת הכנת תבנית:
מאגר PCR תחליב
תערובת אנזים PCR תחליב
תמיסת נושא תבנית

1.2 פתרונות הכנת תבנית:
שמן תגובת הכנת תבנית I
תמיסת שבירת מתחלב II
הכנת תבנית שמן תגובת II
מים ללא גרעין
טווין solution
פתרון דה-מולסיפציה I
תמיסת שטיפת תבניות
תמיסת שטיפת חרוזים C1
תמיסת השעיית חרוזים C1
פתרון השעיית תבנית

1.3 חומרי הכנת תבנית:
צינור ריאגנט I
מחבר
צינור איסוף
צינור ריאגנט פיפטה I
צלחת הגברה
8 בארות strip
טיפים ייעודיים
מתאם כביסה להכנת תבנית
מסנן הכנת תבנית

2. ערכת ריצוף

ערכת ריצוף 2.1:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
תמיסת אנזים ריצוף
פריימרים לריצוף
תבניות בקרת איכות

2.2  פתרונות ריצוף:
תמיסת ריצוף II
תמיסת ריצוף IIII
מאגר חישול
מאגר טעינה
חומר מקציף
טבליות כלור
C1 חרוז

2.3 חומרי ריצוף:
צינור ריאגנט II
מכסה צינור ריאגנט
לגימת צינור ריאגנט  II
בקבוק ריאגנט
בקבוקי ריאגנט

3.
תמיסת נתרן הידרוקסידSigma72068-100ML
Thermal CyclerLife Technologies4375786
One מאגר ליזה של תאים של הרפואית הדרומית טכנולוגיות מיני שבב

מקורות

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871(2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22(2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345(2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585(2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164(2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170(2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים