הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של מודל קוליטיס דמוי קרוהן במכרסמים. דלקת טרנסמולרית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS, והגדלה מכנית נצפתה במגזר הפרוקסימלי להיצרות. שינויים אלה מאפשרים ללמוד מתח מכני בקוליטיס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן
* These authors contributed equally
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
מחלות מעי דלקתיות (IBD) כגון מחלת קרוהן (CD) הן הפרעות דלקתיות כרוניות במערכת העיכול המשפיעות על כ -20 לכל 1,000,000 באירופה ובארה"ב. התקליטור מאופיין בדלקת טרנסמורלית, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת. למרות טיפולים אנטי דלקתיים עשויים לעזור לשלוט בדלקת, אין להם יעילות על פיברוזיס והיצרות בתקליטור. הפתוגנזה של התקליטור אינה מובנת היטב. המחקרים הנוכחיים מתמקדים בעיקר בתיחום מנגנוני התגובה החיסונית של המעיים. בעוד שדלקת טרנסמולרית הקשורה לתקליטור, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת מייצגים כולם מתח מכני על דופן המעיים, תפקיד הלחץ המכני בתקליטור אינו מוגדר היטב. כדי לקבוע אם מתח מכני ממלא תפקיד פתוגניים עצמאי בתקליטור, פותח פרוטוקול של מודל קוליטיס דמוי תקליטור המושרה TNBS במכרסמים. מודל זה של דלקת טרנסמורלית ופיברוזיס המושרה על ידי TNBS דומה לסימני היכר פתולוגיים של תקליטור במעי הגס. זה מושרה על ידי החדרה intracolonic של TNBS לתוך המעי הגס הדיסטלי של חולדות ספראג-דולי בוגרות. במודל זה, דלקת טרנסמורלית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS (אתר I). התנערות מכנית נצפתה בחלק הקרוב לאתר ההחדרה (אתר P), המייצג מתח מכני אך לא דלקת גלויה. חלק המעי הגס דיסטלי לדלקת (אתר D) אינו מציג דלקת ולא מתח מכני. שינויים ייחודיים של ביטוי גנים, תגובה חיסונית, פיברוזיס, וצמיחת שרירים חלקה באתרים שונים (P, I, ו- D) נצפו, המדגישים השפעה עמוקה של מתח מכני. לכן, מודל זה של קוליטיס דמוי תקליטור יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים הפתוגניים של התקליטור, במיוחד את התפקיד של מתח מכני וביטוי גנים מכני המושרה בלחץ מכני בדיסרגציה חיסונית, פיברוזיס מעיים, ושיפוץ רקמות בתקליטור.
מבוא
מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD), מאופיינת בדלקת כרונית במערכת העיכול (GI). זה משפיע על ~ 1-2 מיליון אמריקאים1. העלויות השנתיות המשוערות לטיפול במחלת המעי הרגיז בארה"ב הן 11.8 מיליארד דולר. שלא כמו UC, התקליטור מאופיין על ידי דלקת transmural ו היווצרות קפדנית 2,3. היווצרות קפדנית (היצרות) מתרחשת בעד 70% מחולי CD3 ועשויה להיגרם על ידי דלקת טרנסמורלית (היצרות דלקתית) או פיברוזיס מעיים (היצרות פיברוטית)4,5. פיברוזיס מעיים מאופיין בתצהיר קולגן מוגזם ומטריצות חוץ-תאיות אחרות (E....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של המחלקה הרפואית של אוניברסיטת טקסס (#0907051C). חולדות ספראג-דולי זכר או נקבה, ~ 8-9 שבועות, שימשו למחקר.
1. הכנת בעלי חיים
- חולדות מהירות במשך 24 שעות ולטפל בהם עם משלשל (ניקוי מעיים, ראה טבלת חומרים) לילה.
- למחרת, להרדים חולדות באמצעות מערכת הרדמה (ראה טבלת חומרים) על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין יחד עם 1 ליטר / דקה של חמצן במהלך ניהול TNBS. בדוק אם קיימים רפלקסים או צבוט בהונות כדי לאשר הרדמה.
- הכן פתרון TNBS טרי על פי משקולות הגוף.
הערה: TNBS - 65 מ"ג /ק"ג של משקל הגוף ב 250 μL של 40%....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מבט מקרוסקופי על קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הטמעה תוך-קולונית של TNBS
כפי שניתן לראות באיור 1, הטמעה תוך-קולונית של TNBS בחולדות גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (באורך של כ-2 ס"מ) עם דופן מעי מעובה ולומן מצומצם (היצרות) באתר ההחדרה במעי הגס הדיסטלי (איור 1A). האתר של הטמעת TNBS מכונה אתר I. כתוצאה מדלקת טרנסמורלית והיצרות, הן דלקת והן מתח מכני נמצאים באתר I. היצרות באתר אני הובילה להתנפחות לומן מסומנת בקטע הקרוב לאתר של הטמעת TNBS (אתר P) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קוליטיס הנגרמת על ידי TNBS הוצגה בשנת 1989, שימשה כמודל ניסיוני של מחלת קרוהן מאז 19,20,23. מאפיינים משמעותיים של מודל זה במכרסמים כוללים התפתחות של דלקת טרנסמולרית הדומה מאוד לנגעים ההיסטופתולוגיים שפותחו במחלת קרוהן אנושית19,20. מחקרים קודמים על המודל התמקדו בעיקר בתגובה חיסונית חריגה בשכבת הרירית באתר של דלקת גלויה (האתר I)19,20,23
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מדווחים על ניגוד אינטרסים ואין להם מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענקים מ- NIH (R01 DK124611 ל- XZS) וממשרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-20-1-0681 ל- XZS). עבודת ההיסטולוגיה נעשתה בעזרת המעבדה לפתולוגיה כירורגית UTMB.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ACT-1 בקרה תוכנה Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 מגע תרמי Cycler עם 96 בארות מודול תגובה מהירה | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 מודול תגובה אופטית למערכות PCR בזמן אמת | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro מכתים מיוחדים | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's ערכת טריכרום ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 מצלמת HR צבעונית דיגיטלית | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA בקרה אנדוגנית | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z הרדמה | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| לוחות PCR עם מעטפת קשיחה 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, לבן/שקוף | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של קורנינג האנק, 1x ללא סידן ומגנזיום) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey מערכת הדמיה דיגיטלית | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler עם לוח בקרה 5340 Thermal | Cycler Eppendorf | 5341 | |
| קטטר פוליאוריטן פתוח בדרגה רפואית | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 מיקרוסקופ זקוף | Nikon | E800 | |
| ניטרוצלולוז / כריכי נייר פילטר חבילה של 50, 0.45 μ מ', 7 x 8.5 ס"מ | BIO-RAD | 1620215 | |
| פוליאתילן גליקול 3350, משלשל אוסמוטי | Miralax | C8175 | מינון: 17 גרם ב-226 מ"ל מים |
| ערכת מיני RNeasy (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, צינורות איסוף (1.5 מ"ל ו-2 מ"ל), ריאגנטים ומאגרים ללא RNase | QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III מערכת סינתזה ראשונה | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| מבחני ביטוי גנים של TaqMan Rn00573960_g1 בדיקת CTGF ThermoFisher | Scientific | 4331182 | |
| מבחני ביטוי גנים של TaqMan Rn99999011_m1 בדיקת IL6 | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H& ערכת כתמים E #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus מכתש שקופיות אוטומטי | Sakura | 6171 | |
| TNBS (תמיסת חומצה פיקרילסולפונית) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
מקורות
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
