מאמר שיטה

טכניקת שרוול שונה למודל השתלת לב הטרוטופי של עכבר צוואר הרחם

DOI:

10.3791/63504

⸱

7 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, מודל השתלת לב עכבר משמש לחקירת מנגנון דחיית אלוגרפט לבבי. במודל השתלת לב הטרוטופי זה, יעילות הניתוח משופרת, והישרדותם של שתלי לב מובטחת על ידי אנסטומוזה מקצה לקצה של צוואר הרחם של השתלת לב באמצעות טכניקת שרוול שונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דחיית השתלת לב מגבילה את הישרדותם לטווח ארוך של חולים לאחר השתלת לב. מודל השתלת לב עכבר אידיאלי לחקר המנגנון של דחיית אלוגרפט לבבי במחקרים פרה-קליניים בגלל ההומולוגיה הגבוהה שלהם עם גנים אנושיים. הבנה זו תסייע לפתח גישות ייחודיות לשיפור הישרדותם ארוכת הטווח של החולים המטופלים באלושתלי לב. במודל עכברי, השתלת לב תורם בטן מבוצעת בדרך כלל עם אנסטומוזה מקצה לקצה לאבי העורקים של המקבל ונבוב ורידי נחות באמצעות תפרים. במודל זה, ליבו של התורם מושתל באנסטומוזה מקצה לקצה לעורק התרדמה ולווריד הצוואר של המקבל בטכניקת השרוול השונה. ניתוח ההשתלה מבוצע ללא תפירה ובכך עשוי להגדיל את הישרדותו של המושתל שכן אין הפרעה באספקת הדם וריפלוקס ורידי פלג הגוף התחתון. מודל עכברי זה יסייע לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס הדחייה האימונולוגית והפתולוגית (חריפה/כרונית) של אלוגרפטים לבביים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת לב הפכה לטיפול הסטנדרטי באי ספיקת לב סופנית. יותר מ-5,500 השתלות לב בשנה מבוצעות בארגונים הרשומים תחת האגודה הבינלאומית להשתלות לב וריאות. בקרב מושתלי הלב האלוגניים, שיעור הדחייה לשנה הוא עדיין >10%, בעוד ששיעור הדחייה ל-3 שנים עלה ל-36%1,2. עם זאת, טיפולים מניעתיים יעילים לחולים עם דחיית אלוגרפט לבבית חסרים. לכן, מחקרי מודלים בבעלי חיים מוצדקים המבהירים את המנגנונים הפיזיולוגיים העומדים בבסיס הדחייה החיסונית והפתולוגית של אלוגרפטים לבביים. מחקרים כאלה יתרמו לחקר מטרות חדשות הנדרשות לפיתוח תרופות יעילות, אשר יסייעו במניעת דחיית אלוגרפט לבבי וישפרו את שיעורי ההישרדות באוכלוסיות חולים אלה.

כמה מנגנונים אימונולוגיים ופתופיזיולוגיים פוטנציאליים של דחיית אלוגרפט לבבי הוצעו לאחרונה במחקרי מודל עכברים של השתלת לב הטרוטופית 3,4,5. כתוצאה מכך, השתלת לב הטרוטופית בעכבר הפכה למודל פרה-קליני אידיאלי לחקר מנגנוני הדחייה החיסונית והפגיעה הפתולוגית המתרחשים בהשתלות לב לאחר השתלת לב בגלל ההומולוגיה הגבוהה שלהם עם גנים אנושיים. הרעיון הרווח הוא לבצע השתלה הטרוטופית במודל עכברי על ידי אנסטומוזה בטנית מקצה לקצה באבי העורקים המושתל ונבוב ורידי נחות באמצעות תפרים, בדומה לאנטומיה האנושית הרגילה. עם זאת, הליך זה עלול להפריע לאספקת הדם של המקבל וריפלוקס ורידי של פלג הגוף התחתון6. לכן, הליך השתלת לב הטרוטופי שונה במודל עכבר מוצע כאן.

ליבו של התורם מושתל בעורק התרדמה ובווריד הצוואר של המקבל על ידי אנסטומוזה צווארית מקצה לקצה בטכניקת שרוול שונה. הליך שונה זה הקל על ההיתכנות הניתוחית והבטיח את הישרדות השתל הלבבי מבלי להפריע לאספקת הדם ולריפלוקס ורידי של פלג הגוף התחתון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה שמינית, המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב) 2011. נהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים לסרטן של אוניברסיטת צ'ונגצ'ינג, צ'ונגצ'ינג, סין. עכברי BALB/c ו-C57BL/6 זכרים במשקל 20-30 גרם, שהתקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים), שימשו למחקר השתלת לב אלוגנית. עכברי C57BL/6 שימשו כתורמים ומושתלים סינגניים, ואילו עכברי BALB/c שימשו כמושתלים אלוגניים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
הערה: כל החומרים המשמשים במהלך הניתוח, כולל מכשירים ופתרונות ניתוחיים, הם סטריליים. ההליך הכירורגי שומר על עקרון טכניקת הפעולה האספטית.

1. הליך הנמען

  1. יש להשרות הרדמה כללית באמצעות שאיפה של איזופלורן 5% דרך תא אינדוקציה בגודל 15 x 10 x 10 ס"מ המחובר למכסה מנוע (ראה טבלת חומרים).
  2. תקן את העכבר הנמען על שולחן הניתוחים באמצעות כרית חימום. יש לשמור על הרדמה עם שאיפה מתמשכת של 2% איזופלורן דרך מסכת פנים מעל האף והפה.
    הערה: קצב וקצב נשימה איטיים, היעלמות רפלקס הקרנית והיעדר רפלקס הדוושה באצבעות הרגליים מצביעים על יעילות ההרדמה.
  3. לאחר גילוח השיער, יש לחטא את אזור הניתוח בשלושה סבבים לסירוגין של קרצוף פובידון-יוד ואחריו אלכוהול. לאחר מכן, חותכים את העור 1.5-2 ס"מ במקביל לקו האמצע הצווארי מהזווית המנדיבולרית הימנית ועד קצה הזנב.
  4. לנתח ~ 1 ס"מ של וריד הצוואר החיצוני הימני באמצעות אלקטרו-קרישה ומיקרו-מלקחיים. חותכים את הווריד בקצה הפרוקסימלי עם מהדק כלי דם א-טראומטי ומחברים אותו בקצה הדיסטלי.
  5. מעבירים את הקצה הדיסטלי של הווריד דרך שרוול דוקרני פוליאוריתן 22 גרם (ראו טבלת חומרים) עם קצה משופע וחריצים שטחיים. תקן את הווריד עם ידית השרוול באמצעות מהדק כלי דם.
  6. הסר את ה-8-0 תפר קשירה בקצה הדיסטלי, להפוך את לומן מעל השרוול מחובר על ידי barb שטחי מבפנים החוצה ולתקן עם תפר כירורגי 10-0 חריצים של פני השטח.
  7. יש לכרות את הבלוטה התת-לשונית הימנית כדי ליצור פוסה להשתלת השתלת הלב, ולשמור את האונה הימנית של הבלוטה התת-מקסילרית ואת הסטרנוקלידומסטואיד הימני.
  8. נתחו את עורק התרדמה המשותף הימני במשך ~1 ס"מ באמצעות מיקרו-מלקחיים, וחתכו את העורק עם מהדק מיקרו-וסקולרי א-טראומטי בקצה הפרוקסימלי. בקצה הדיסטלי, לקשור ולחתוך את העורק.
  9. מעבירים את הקצה הדיסטלי של העורק דרך שרוול דוקרני פוליאוריתן 26 גרם (ראו טבלת חומרים) עם קצה משופע וחריצים על פני השטח. תקן את העורק עם ידית השרוול באמצעות מהדק כלי דם.
  10. מוציאים את תפר הקשירה בקצה הדיסטלי, הופכים את הלומן מבפנים החוצה מעל השרוול, ומקבעים עם מוט שטחי וחריצים בתפר כירורגי 10-0.
  11. לאחר הכנת כלי הדם של הנמען, יש לטפטף 100 IU/mL של מי מלח הפרין על כלי הדם כדי למנוע פקקת. מכסים את חתך צוואר הרחם בגזה מלח רטובה סטרילית להשתלה לאחר מכן.

2. הליך התורם

  1. השתמש באותו הליך הרדמה (שלב 1.1) עבור העכבר התורם.
  2. יש לגלח את שיער הבטן באמצעות סכין גילוח חשמלי, ולחטא את אזור הניתוח בשלושה סבבים לסירוגין של קרצוף פובידון-יוד ואחריו אלכוהול.
  3. חותכים את הבטן (2-3 ס"מ) עם מספריים לאורך קו האמצע מהסימפיזיס פאביס לסובקסיפואיד, ומרחיבים את האזור החתוך עם מחזיר.
  4. יש לנתח 1 ס"מ של אבי העורקים הבטני והווריד הנבוב התחתון באמצעות אלקטרו-קרישה ומיקרו-מלקחיים, ולבצע הפריניזציה על ידי הזרקת 1 מ"ל של מי מלח פיזיולוגיים בתוספת 250 IU/מ"ל של הפרין דרך הווריד הנבוב התחתון. לאחר מכן, הבלו את אבי העורקים הבטן ואת נבוב הווריד הנחות.
  5. מוציאים את בית החזה לאורך קו בית השחי הקדמי משני הצדדים באמצעות מספריים כירורגיים להפרדת דופן בית החזה. ניצחון 0:8 על הווריד קאווה המעולה תפר כירורגי.
  6. הכנס מחט קרקפת אל הווריד הנבוב התחתון suprahepatic. לאחר מכן, הזריקו מלח פיזיולוגי קר כקרח בתוספת 100 IU/mL של הפרין דרך מחט הקרקפת מווריד נבוב נחות בכבד כדי לחורר את הלב התורם עד שצבע הדם דוהה.
  7. לנקב מחדש את לב התורם עם 2-3 מ"ל של תמיסת היסטידין-טריפטופן-קטוגלוטרט (HTK) קרה כקרח (ראו טבלת חומרים) באמצעות מחט קרקפת מקשת אבי העורקים כדי להגן על שריר הלב של התורם. זמן האיסכמיה החם הממוצע הוא 5 דקות.
  8. קשרו את הווריד הנבוב העליון והנחות ואת וריד הריאתי בתפר ניתוחי 5-0. לנתח ולחתוך את אבי העורקים התורם ואת עורק הריאה לפני הסתעפותם. לאחר מכן, לחלק את הווריד הנבוב העליון והנחות ואת הווריד הריאתי כדי להסיר את הלב של התורם.

3. השתלה

  1. השתיל את הלב התורם בכיס הצוואר של העכבר המקבל במצב הפוך.
  2. משוך את השרוול עם וריד ג'וגולרי מושתל קטוע לתוך לומן של עורק הריאה התורם כדי לבצע אנסטומוזה מקצה לקצה של עורק הריאה התורם לווריד הצוואר החיצוני של הנמען. קשרו את השרוול באמצעות החריצים על פני השטח דרך תפר כירורגי 10-0 כדי לתקן את האנסטומוזה.
  3. להפעיל הליך דומה עבור אנסטומוזה מקצה לקצה של אבי העורקים התורם לעורק התרדמה המקבל.
  4. שחררו את המהדק המיקרו-וסקולרי הא-טראומטי של הווריד הצווארי ואחריו את עורק התרדמה כדי לחורר מחדש את לב התורם. זמן האיסכמיה הקר הממוצע הוא 15 דקות.
  5. תקן את השתל הלבבי ותפר אותו כראוי כדי למנוע פיתול של השתל.
  6. סגור את החתך הצווארי עם תפרים רציפים באמצעות תפר מונופילמנט פוליאמיד 5-0 (ראה טבלת חומרים).
    הערה: הסר את התפר לאחר שהפצע נרפא לחלוטין.
  7. שמור את העכבר המושתל בתוך כלוב חם, יבש ונקי עד שהוא מתאושש מההרדמה.
    הערה: לוקח 5-10 דקות להתאושש.
  8. הזריקו buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) תת עורית לתוך העכבר המקבל כל 6 שעות במשך 48 שעות עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח.
    הערה: מינון שיכוך הכאבים הותאם למחקר זה. עם זאת, ניתן להאריך / לשנות את משטר שיכוך הכאבים אם יש סימן כלשהו לכאב בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במודל השתלת לב הטרוטופי זה של עכבר צוואר הרחם, שיעור ההישרדות של עכברים מושתלים היה כ -95.2% (20 מתוך 21 עכברים שרדו). סיבת המוות העיקרית הייתה דימום לאחר הניתוח. פעימות הלב המהירות עם קצב קבוע משמשות אינדיקטור להישרדות הלב התורם המושתל.

עכברי C57BL/6 ו-BALB/c היו מסוג MHC (H-2b) ו-MHC (H-2d) בדגם זה, בהתאמה 7,8. שני זנים אלה נבדלים זה מזה ב-H-2, הגורם לדחייה חריפה בתיווך תאי T9. מתוך כל השתלות הלב, 62.5% אבדו ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל השתלת הלב בעכבר תורם לחקר מנגנוני הדחייה לאחר השתלת לב, ותורם לפיתוח גישות ייחודיות לשיפור הישרדותם ארוכת הטווח של מושתלי השתלת לב. עם זאת, השתלת לב בעכברים היא משימה מורכבת ומאתגרת, הדורשת רמה גבוהה של טכניקות מיקרוכירורגיה, במיוחד באנסטומוזה וסקולרית11,12,13. מודל השתלת לב הטרוטופי בטני בעכבר מבוצע באמצעות תפרים על ידי אנסטומוזה של אבי העורקים התורם ועורק הריאה לאבי העורקים המקבל ולווריד הנבוב התחתון. אבי העורקים של הנמען...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81870304) לג'ון לי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  5-0 תפר מונופילמנט פוליאמידB.Braun Medical Inc.C3090954
  8-0 תפר מונופילמנט פוליאמידB.Braun Medical Inc.
C2090880 10-0 תפר מונופילמנט פוליאמידB.Braun Medical Inc.
שרוול פוליאוריטן 22 גרםB.Braun Medical Inc.4251628-02
26 G שרוול פוליאוריטןSuzhou Linhua Medical Instrument Co., LTDREF383713
תא אינדוקציה הרדמהRWD מדעי החיים ושות', בע"מV100
מהדק מיקרו-וסקולרי אסטראומטיBeyotimeFS500
BALB/c ו-C57BL/6 עכברים (20– 30 גרם)המרכז לבעלי חיים ניסיוניים (האוניברסיטה הרפואית הצבאית, צ'ונגצ'ינג, סין)
בופרנורפיןארה"ב מדעי החיים הביולוגיים352004
Electrocoagulatorגואנגג'ואו Runman מכשיר רפואי ושות', בע"מZJ1099
GauzeHenan piaoan Group Co., LTD10210402
כרית חימוםגואנגג'ואו Dewei ביולוגית טכנולוגיה ושות', בע"מDK0032
הפריןצפון סין פרמצבטיקה ושות', בע"מ2101131-2
פתרון HTKשנזן Changyi פרמצבטיקה ושות', בע"מYZB / Min8263-2013
מזרק הזרקה (10 מ"ל)שאנדונג weigao קבוצה פולימר רפואי ושות', בע"מ20211001
IsofluraneRWD מדעי החיים ושות', בע"מ21070201
מלח פיזיולוגיSouthwest pharmaceutical Co., LTDH50021610
מחט קרקפתHongyu Medical Group20183150210
מכונת גילוחBeyotimeFS600
מכונת הרדמה לבעלי חיים קטניםRWD מדעי החיים ושות', בע"מR500
מיקרוסקופ פעולה כירורגיתTiannuoxiang Scientific Instrument Co., Ltd, בייג'ינג, סיןSZX-6745
ספוגיתYubei חומרים רפואיים ושות', בע"מ21080274
G0090781

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
  3. Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
  4. Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
  5. Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
  6. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. 6, 238(2007).
  7. Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
  8. Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
  9. Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
  10. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  11. Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264(2018).
  12. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
  13. Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
  14. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  15. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  16. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים