זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

פלישת תאים היא תהליך חשוב המאפשר לתאים לחצות מחסומים של קרום מרתף בתגובה לרמזים סביבתיים המסופקים על ידי תאים סטרומליים. זהו שלב מכריע במהלך מספר שלבים של התפתחות לתגובות חיסוניות, ריפוי פצעים, תיקון רקמות וממאירויות שיכולות להתקדם מנגעים מקומיים לסרטן פולשני וגרורות¹. מבחנים שפותחו בשלב מוקדם כדי למדוד את הפוטנציאל הפולשני של אוכלוסיות תאים מייצרים בדרך כלל מדידה של נקודת קצה אחת או דורשים תיוג מראש של תאים פולשים². השילוב של מיקרו-אלקטרוניקה וטכניקות של מיקרופלואידיקה פותח כעת כדי לזהות היבטים שונים של הביולוגיה של התא, כגון כדאיות, תנועה והתקשרות באמצעות העכבה החשמלית של תאים חיים על מיקרו-אלקטרוניקה ^3,4. מדידת עכבה מאפשרת הערכה נטולת תוויות, לא פולשנית וכמותית של מצב התא³. כאן אנו מתארים מערך בעל שלושה תאים המבוסס על תכנון מערכת האנליזה התאית בזמן אמת (RTCA) שפותחה על ידי Abassi et ^al.5. המערך בעל שלושת התאים מאפשר הערכה של תאים בתרבית משותפת על פלישה תאית והתאוששות של תאים פולשים לצורך ניתוחים או התפשטות נוספים.

במערכת מנתחי התאים, תאים פולשים דרך מטריצה חוץ-תאית המצופה על ממברנה נקבובית ומגיעים למערך אלקטרודות משולב הממוקם בצד הנגדי של המחסום. כאשר התאים הפולשים ממשיכים להתחבר ולתפוס את מערך האלקטרודות הזה לאורך זמן, העכבה החשמלית משתנה במקביל. המערכת הנוכחית כוללת צלחת 16 בארות פלישה והגירה של תאים (CIM) עם שני תאים. מכשיר RTCA-DP (דו-תכליתי) (הנקרא מנתח תאים דו-תכליתי) מכיל חיישנים למדידת עכבה ותוכנה משולבת לניתוח ועיבוד נתוני העכבה. ערכי העכבה בנקודת ההתחלה תלויים בחוזק היוני של המדיה בבארות ומשתנים כאשר התאים נצמדים לאלקטרודות. שינויי העכבה תלויים במספר התאים, במורפולוגיה שלהם ובמידה שבה התאים מתחברים לאלקטרודות. מדידה של הבארות עם המדיה לפני הוספת התאים נחשבת לאות הרקע. הרקע מופחת ממדידות עכבה לאחר שהגיע לשיווי משקל כאשר תאים מתחברים ומתפשטים על האלקטרודות. פרמטר ללא יחידה של מצב התאים על אלקטרודה המכונה אינדקס תאים (CI) מחושב כדלקמן: CI = (עכבה לאחר שיווי משקל - עכבה בהיעדר תאים) / ערך עכבה^{נומינלית 6}. כאשר משווים את שיעורי ההעברה של קווי תאים שונים, ניתן להשתמש ב- Delta CI כדי להשוות את מצב התא ללא קשר להבדל בהיצמדות המיוצג במדידות הראשונות.

המערך התלת-תאי החדש שתוכנן מתבסס על העיצוב הקיים ומשתמש בתא העליון ממערכת מנתח התאים הדו-תכליתית המכילה את האלקטרודות. התאים האמצעיים והתחתונים שהשתנו מותאמים כדי להתאים את ההרכבה למנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה וניתוח באמצעות התוכנה המשולבת. שתי ההתפתחויות העיקריות שהתכנון החדש מספק על פני לוחית ה-CIM הדו-תאית הקיימת (הנקראת מעתה צלחת מנתחת תאים) הן: 1) היכולת להתאושש, ולאחר מכן לנתח תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים הנמצאים בתערובות תאים הטרוגניות, ו-ב) האפשרות להעריך את ההשפעה של גורמים מופרשים מתאים סטרומליים או חיסוניים בתרבית משותפת על פלישת תאים (איור 1).

טכנולוגיה זו יכולה להיות שימושית בחקר תת-האוכלוסיות של תאים בעלי יכולות פולשניות שונות. זה כולל (א) תאים סרטניים פולשים הפולשים לרקמות הסובבות או לדם ולכלי הלימפה או מתרבים באתרי זריעה גרורתיים באיברים מרוחקים, (ב) תאים ממערכת החיסון הפולשים לרקמות כדי להתמודד עם פתוגנים או תאים חולים, (ג) תאי אנדותל הפולשים לרקמות ויוצרים כלי דם חדשים במהלך ארגון מחדש של רקמות או ריפוי פצעים, כמו גם (ד) תאים סטרומליים מהמיקרו-סביבה של הגידול התומכים ופולשים יחד עם תאים סרטניים. הגישה מאפשרת הכללה של דיבורים צולבים סטרומליים שיכולים לווסת את תנועתיות התא ואת הפלישה. מחקרי ההיתכנות המוצגים כאן משתמשים במערך שונה זה המתמקד בפלישה לתאים סרטניים ובאינטראקציה עם הסטרומה כמערכת מודל, כולל פלישת אנדותל בתגובה לאותות דיפרנציאליים מתאי הסרטן. ניתן לבצע אקסטרפולציה של הגישה כדי לבודד תאים סרטניים וסוגי תאים אחרים כגון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים או תאי אנדותל. בדקנו קווי תאי סרטן שד פולשניים ולא פולשניים מבוססים כהוכחה עקרונית. השתמשנו גם בתאים מפלישה של קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה בתגובה לתאי מערכת החיסון ממח העצם האנושי כדי להראות היתכנות לשימוש עתידי גם במסגרות אבחון קליניות. PDX הן רקמות גידול של מטופלים המושתלות במודל עכברים מדוכאי חיסון או הומניזציה כדי לאפשר לימוד של אפשרויות גדילה, התקדמות וטיפול בחולה המקורי ^7,8.

המחקר נסקר ונחשב "פטור" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ג'ורג'טאון (IRB # 2002-022). רקמות מח עצם שנקטפו זה עתה נאספו ממסנני איסוף מח עצם אנושיים בריאים שהושלכו וזוהו.

1. עיצוב תא חדש (איור 2)

1. פתח לוחית מנתח תאים דו-תאית חדשה. הניחו בצד את התא העליון עם אלקטרודות.
2. באמצעות מכונת כרסום, גילחו 2 מ"מ מהבארות התחתונות בצורת U של לוחית מנתח התאים.
3. חברו ממברנת פוליאתרסולפון (PES) בגודל 2 ס"מ על 7 ס"מ עם גודל נקבובית של 0.2 מיקרומטר לתחתית הבארות המגולחות באמצעות דבק שאוצר UV. אפשרו זמן אוצר של 30 דקות כדי לוודא שהדבק נרפא לחלוטין ואינרטי.
4. באמצעות מכונת כרסום, חותכים שני חריצים אורכיים (1.5 מ"מ x 5.6 מ"מ) לאורך הצדדים כדי להיצמד לרכסים של החדר השלישי החדש שיוצר.
5. באמצעות מכונת כרסום, צור תא פוליקרבונט שלישי המשכפל את הממדים הכוללים של לוח מנתח התאים; 72 מ"מ x 18 מ"מ (טבלת חומרים).
6. צור בארות בעומק 4.8 מ"מ ובקוטר של 4.75 מ"מ כדי לשכפל את העיצוב בן 16 הבארות של לוח מנתח התאים. זה מאפשר 90 μL של נפח לכל באר.
7. בצדדים, צור שני רכסים משולשים כך שהתא יינעל לתוך החריצים המקוריים שנוצרו בשלב 1.4. החלק האופקי של המשולש הוא 1.5 מ"מ, האנכי הוא 1.4 מ"מ, ואת hypotenuse הוא 2.052 מ"מ.
8. צור ידית בצד הקצר שקוטרה 50.8 מ"מ וגובהה 1.397 מ"מ כדי להתאים לחריץ הלוח המקורי (איור 2, אמצע).
9. השתמש במכונת כביסה מגומי בעובי 0.9 מ"מ עבור כל באר כדי לספק התאמה אטומה.

2. תרבית תאים (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-פיברובלסטים)

1. שטפו תרביות תאים דביקות (כ-70% מפגש) עם פי 1x מלוחים עם מאגר פוספט (PBS).
2. הוסף תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA כדי להרים את התאים.
3. נטרלו את תמיסת הטריפסין בעזרת מדיה של תרביות תאים המכילה סרום וספרו את התאים באמצעות אליקווט של תרחיף התא.
   הערה: ניתן למצוא את המדיה הספציפית של תרביות תאים בטבלה 1.

3. דיסוציאציה של קסנוגרפט שמקורה בחולה

1. קוצצים חתיכת גידול טרייה (1 ס"מ²) לעיסה עדינה באמצעות אזמל סטרילי.
2. מניחים בצינור חרוטי 50 מ"ל עם 20 מ"ל של מדיית DMEM F12 בתוספת 3 מ"ג/מ"ל טריפסין ו-2 מ"ג/מ"ל קולגן.
3. דגירה בשייקר תרמי (150 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. סובב את הצינור ב 500 x g במשך 5 דקות; להסיר את supernatant.
5. הוסף 20 μL של DMEM F12 + 2% FBS כדי לשטוף את התאים; סובב ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש לחזור על שטיפה פעמיים נוספות.
6. בצעו שימוש חוזר ב-1 מ"ל של מדיית PDX (טבלה 1) כדי לספור את התאים.

4. מיצוי תאי מח עצם

1. שטפו את מסנן איסוף מח העצם (BM) עם 25 מ"ל של 1x PBS.
   הערה: במחקר זה, PBS נוסף למסנן איסוף BM משומש מבית החולים כדי לאסוף את ה- BM הנותרים במסנן.
2. הוסיפו את ה-BM הסמוק באיטיות לצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 25 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות, תוך הקפדה על הפרדה בין השכבות ככל האפשר.
3. סובב ב 800 x גרם במשך 20 דקות ב 18 °C (74 °F)
4. סיפון את השכבות העליונות לאחר צנטריפוגה (שומן/פלזמה) והעביר 5 מ"ל של השכבה הלבנה מעל לתווך גרדיאנט הצפיפות שיש לו את תאי ה-BM לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
   הערה: לחלופין, יש לטבול פיפטה של 5 מ"ל בשכבה העליונה עד שהיא נוגעת בשכבה האמצעית (BM) ולפטפט את השכבה האמצעית באיטיות רבה מבלי להזיז את הפיפטה.
5. מלאו את הצינור החרוטי 15 מ"ל ב-1x PBS (כ-10 מ"ל) וסובבו ב-300 x גרם למשך 15 דקות.
6. הסר את הסופרנטנט; הכדור הלבן הנותר הוא ה- BM.
7. אם תאי דם אדומים נצפים בכדור, הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת RBC lysis (טבלת חומרים) ותנו לה לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). סובבו ב-300 x גרם למשך 5 דקות והסירו את ה-supernatant.
8. הוסף 10 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים, לסובב ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. חזרו על תזת RBC (שלב 4.7) עד שהכדור יהיה לבן.

5. זריעה והרכבה של תאים

1. הניחו את כל שלושת התאים הסטריליים במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
2. אתר את הידית בצד הקצר של החדר התחתון. כוון את החדר התחתון כך שהידית תפנה אל הנסיין.
3. הוסף 30,000-50,000 תאים במדיה של 90 μL לכל באר של החדר התחתון. הימנעו מיצירת בועות. אלה הם התאים הסטרומליים שיספקו גורמים מופרשים אך לא יזוהו על ידי האלקטרודות של החדר העליון.
4. השתמשו ב-5% מדיה המועברת על ידי תוסף סרום בקר עוברי בשתי בארות של תאים תחתונים כבקרה חיובית לתנועתיות התאים. השתמשו ב-0% מדיה עם תוסף סרום כבקרה שלילית.
5. תן לתא התחתון עם התאים לשבת במשך 10-15 דקות במכסה המנוע כדי להתיישב.
   הערה: שלב זה מומלץ אם התאים דבקים או גדלים בהשעיה.
6. סובבו את התא התחתון ב-90° והניחו את החדר האמצעי למעלה כך שהידית בתא התחתון תחליק לתוך החריץ בתא האמצעי.
   הערה: הידית בתא התחתון והנקודה הכחולה בתא האמצעי נמצאים בקצוות מנוגדים של ההרכבה.
7. דחפו אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
8. הוסיפו 160 μL של מדיה ללא סרום לכל הבארות של החדר האמצעי.
9. ודא שמניסקוס בצורת כיפה נראה לאחר מילוי בארות; אחרת, התאם את עוצמת הקול הסופית בהתבסס על כיול הפיפטה. הימנעו מיצירת בועות.
10. מקם את התא העליון עם אלקטרודות הפונות כלפי מטה אל החדר האמצעי תוך הקפדה ליישר את הנקודות הכחולות בתאים האמצעיים והעליון.
11. דחפו אנכית כלפי מטה עד שנשמע צליל לחיצה מכל אחד מהצדדים הארוכים של ההרכבה.
12. הוסיפו 25-50 μL של מדיה ללא סרום לתא העליון.
13. הרכיבו את ההרכבה על מנתח התאים הדו-תכליתי באינקובטור תרביות הרקמה והמתינו 30 דקות לפני מדידת הרקע.
    הערה: זמן זה נחוץ כדי לאזן את המערך וניתן להשתמש בו כדי להכין את קווי התאים שיתווספו לתא העליון.
14. מדוד את הרקע (ראה סעיף 6) והחזיר את ההרכבה למכסה המנוע של תרבית הרקמה.
15. הוסף 30,000-50,000 תאים ב-100 μL של מדיה ללא סרום לכל באר של החדר העליון. אלה הם התאים שהאלקטרודה תזהה ברגע שהם יעברו בהצלחה דרך הממברנה.
    הערה: כדי להשיג תגובה מקסימלית, מומלץ לגדל תאים במדיה נטולת סרום או נמוכה בסרום למשך 6-18 שעות לפני ביצוע הבדיקה.
16. תנו להרכבה לעמוד במכסה המנוע במשך 30 דקות לפני שתרכיבו על מנתח התאים הדו-תכליתי למדידת עכבה.

6. מדידת רקע ועכבה

1. מקם את המערך לתוך העריסה במכשיר מנתח התאים הדו-תכליתי.
2. פתח את תוכנת מנתח התאים ובחר את העריסה לשימוש.
3. לחץ על הכרטיסיה הודעה וודא שכתוב בה חיבורים בסדר כדי לוודא שהמערך ממוקם היטב בעריסה והאלקטרודות מיושרות היטב עם החיישנים.
4. לחץ על הכרטיסיה הערות ניסוי ומלא מידע רב ככל האפשר על הניסוי.
5. לחץ על הכרטיסיה פריסה ומלא את התיאור של פריסת המערך.
6. לחץ על הכרטיסיה תזמון והוסף שני שלבים מתפריט השלבים ; שלב רקע (טאטוא אחד) ושלב בדיקה עם 100 מטאטאים - מטאטא כל 15 דקות, בסך הכל 25 שעות.
7. לאחר שהמערך נמצא באינקובטור מנתח התאים הדו-תכליתי במשך 30 דקות, לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל במדידת הרקע. חלון המבקש לבחור את התיקיה לשמירת הנתונים יופיע.
8. לאחר סיום מדידת הרקע, הסר את המערך מהעריסה והנח אותו בחזרה במכסה המנוע של תרבית התאים.
9. הוסיפו תאים לתא העליון כמתואר בשלב 5.13, ושמרו על ההרכבה במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך 30 דקות כדי שהתאים יתיישבו.
10. מקם את המערך בחזרה למנתח התאים הדו-תכליתי ובדוק את הכרטיסיה הודעה עבור ההודעה 'חיבורים אישור '.
11. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל במדידת עכבה.
12. לחץ על הכרטיסיה תרשים כדי לעקוב אחר התקדמות האות.
13. אם נקודת הקצה מגיעה לפני 25 שעות, לחץ על השלב ביטול מהתפריט הנפתח הפעל .
14. כדי לייצא נתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחר העתק בתבנית הרשימה ולאחר מכן הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני.
    הערה: ניתן לייצא את הנתונים כאינדקס תאים או אינדקס תאי דלתא. ניתן גם לבחור פרטי גרף ו/או פריסה לייצוא.

7. ניתוק ואיסוף תאים

1. עקוב אחר קצב ההעברה בזמן אמת על מנתח התאים הדו-תכליתי כדי לקבוע את נקודת העצירה של העניין (6-18 שעות).
   הערה: נקודת העצירה תלויה בקצב הפלישה של התא וכאשר מושג אות פלישה מובחן מהשליטה השלילית.
2. לאחר שהושגה, שחררו את ההרכבה ממנתח התאים הדו-תכליתי והניחו אותו במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
3. הכן מספר מתאים של 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge כדי לאסוף את התאים מבארות העניין.
4. מניחים את ההרכבה בצלחת של 10 ס"מ כדי להכיל נוזלים כאשר התאים מתנתקים.
5. דחפו את קצוות ההצמדה הגמישים בצד הארוך של החדר האמצעי פנימה עד שנשמע צליל לחיצה.
6. פרקו את החדר העליון והפכו אותו למנה חדשה של 10 ס"מ.
7. השתמשו במרים תא עם להב של 13 מ"מ כדי לאסוף את התאים מכל הבארות הנושאות את אותו מצב ניסיוני (כלומר, סוג תא, טיפול תרופתי וכו').
   הערה: תכנן את ההגדרה כך שיהיו לפחות שתי בארות עבור כל מצב ניסיוני כדי להשיג שינוי מובהק סטטיסטית מפקדים שליליים.
8. יש לשטוף או לטבול את הלהב בתמיסת מלח 1x 1x דחוסה בפוספט כדי לאסוף את התאים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
9. סובבו את התאים ב-500 x גרם למשך 5 דקות.
10. להפיץ את התאים שנאספו (ראה סעיף 8) או לבצע ניתוח נקודות קצה כגון RNA-seq חד-תאי.
    הערה: עבור RNA-seq בתפזורת, השתמש בערכת מיצוי RNA של מספר תאים נמוך.

8.3D ריבוי ואחזור תאים

הערה: בשל המספר הקטן של תאים שנאספו, זרעו את התאים בתלת-ממד באמצעות מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי לשפר את הכדאיות. עם זאת, תרבית דו-ממדית היא גם אופציה בשלב זה, במיוחד אם התאים שבהם נעשה שימוש הם מקווי תאים מבוססים.

1. להפשיר אליקוט של מטריצת קרום המרתף ב 4 מעלות צלזיוס בלילה. שמור את מטריצת קרום המרתף על קרח עד שיהיה מוכן לשימוש.
2. מוסיפים 25 μL של מטריצת קרום מרתף קר לכדור של תאים חיים שנאספו ומקטרים בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. הימנעו מיצירת בועות.
3. הוסיפו את תערובת המטריצה של קרום מרתף התאים לתחתית של באר תרבית רקמה קטנה (כלומר, בצלחת של 96 בארות), ויצרו כיפה. נסו לא לגעת בקירות הבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני שתוסיפו בעדינות 100 μL של מדיה טיפה.
4. כדי לאחזר תאים, שאפו למדיה והוסיפו 100 μL של dispase לכל באר.
5. דגירה ב- RT במשך 10 דקות, מקטרת למעלה ולמטה מדי פעם.
6. העבירו את התאים ואת מטריצת קרום המרתף המומסת לצינור מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS, סובב ב 300 x g במשך 5 דקות והסר את supernatant. חזור על הכביסה פעם אחת.
7. לשאוף את הסופרנאטנט. לפצל את התאים בכדור או לבצע ניתוח נקודות קצה.

באמצעות מערך שלושת התאים שתוכנן לאחרונה, פלישה של התאים נבדקה בנוכחות או בהיעדר תאים סטרומליים כגון פיברובלסטים. פלישת תאי MDA-MB-231 שופרה כאשר פיברובלסטים שוויצריים מוקרנים 3T3 (זן J2) נזרעו בתא התחתון, מה שאפשר חילופי גורמים בין שני קווי התאים. באופן מעניין, הפלישה ל-MDA-MB-231 גדלה כאשר מספרם של תאי 3T3-J2 הוכפל (איור 3A). מצד שני, נראה שקצב הפלישה של שיבוט פולשני של תאי MCFDCIS (DCIS-Δ4)9 מעוכב על-ידי השיחה הצולבת עם תאי 3T3-J2 (איור 3B). נתונים אלה מראים את היישום השימושי של המערך בעל שלושת התאים למדידת השפעות משתנות של הסטרומה, במקרה זה, פיברובלסטים, על פלישת התאים.

לאחר מכן, כדי לעקוב אחר השינוי בתנועתיות תאי האנדותל ובפלישה בתגובה לאותות של תאים סרטניים פולשניים (MDA-MB-231)10,11 או לא פולשניים (DCIS)12, נעשה שימוש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) המייצגים תאי אנדותל המצפים את דפנות כלי הדם. HUVECs היו פולשניים יותר בתגובה לגורמים שהופרשו על-ידי תאי MDA-MB-231, בניגוד לאלה שהופשרו על-ידי תאי DCIS (איור 4). זה עולה בקנה אחד עם היכולת של גידולים פולשניים לגייס תאי אנדותל להיווצרות כלי דם והתפשטות מאוחרת יותר למחזור הדם.

הנתונים לעיל מדגימים את יכולתה של מערכת מנתחי התאים לנטר שיעורי פלישה שונים של קווי תאים; כאשר הפלישה מתחילה, מתקדמת ומתגברת. זה מאפשר למשתמש לבחור את נקודת הזמן המעניינת, למשל, לאחר 2-3 השעות הראשונות של הפלישה, כדי ללכוד את תאי החלוץ היוזמים פלישה והם נבדלים מהתאים הבאים שפולשים לאחר מכן על ידי פלישה קולקטיבית.

בעוד שהנתונים לעיל מדגימים הוכחה עקרונית מוצקה לשימוש במערך בעל שלושת התאים כדי לצפות בפלישה בסביבה של תרבות משותפת, רצינו לבחון את השימושיות הפוטנציאלית של מערך זה במסגרות קליניות ואבחון. לשם כך, הפלישה של השעיית תאים מ-xenografts שמקורם בחולה (PDX)8 בתרבית משותפת עם תאי חיסון מדגימות מח עצם אנושיות הייתה במעקב. סך כל תאי החיסון של מח העצם האנושי (BM) נזרעו על החדר התחתון עם או בלי סרום. פלישת תאי PDX מהתא העליון עלתה בתגובה לתאי מערכת החיסון BM בתרבית משותפת (איור 5). באופן מעניין, נוכחות של 2% סרום בתא התחתון עם תאי ה-BM הייתה חיונית לפלישה ל-PDX.

איור 1: זרימת עבודה של מערכת הניטור ואיסוף התאים של פלישת התאים. (A) תאי סטרומה מתווספים לתא התחתון המורכב על תא אמצעי, המשמש כמחסום תאי חדיר לגורמים מסיסים בלבד. (B) התא העליון עם ביוסנסורים של עכבה מקבל את קו התא לניטור. פלישה בזמן אמת נרשמת עד שמגיעים לנקודת זמן המוגדרת על-ידי המשתמש לאיסוף תאים. (C) התא העליון המפורק הפוך, והתאים נקטפים באמצעות מרים תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תמונות של תאי המערך והשינויים. לא נעשה כל שינוי בתא העליון שבו נמצאות האלקטרודות. (ב) מבארות החדר האמצעי התגלח גובה של 2 מ"מ וקרום מחובר לקרקעית הפתוחה; חריצי אורך (1.5 מ"מ x 5.6 מ"מ) נוספו לכל צד. (C) תא תחתון (72 מ"מ x 18 מ"מ) שיוצר כדי לשכפל את העיצוב של 16 בארות; בארות הן בעומק 4.8 מ"מ, וקוטר 4.75 מ"מ, רכסי משולשים (1.5 מ"מ אופקי x 1.4 מ"מ אנכי) מתווספים לאורך הצדדים כדי ללחוץ על חריצי התא האמצעי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ההשפעה של פיברובלסטים בתרבית משותפת על פלישת תאים סרטניים. (A) ניתוח תאי בזמן אמת של פלישת תאי MDA-MB-231, לבד או בתרבית משותפת עם פיברובלסטים 3T3-J2 (תא תחתון). 3T3-J2 פיברובלסטים נזרעו ב-30,000 או 60,000 תאים לכל באר. (B) ניתוח תאי בזמן אמת של פלישת תאי DCIS-Δ4, לבד או בתרבית משותפת עם פיברובלסטים 3T3-J2 (תא תחתון). העיגולים המוצקים מייצגים את הממוצע; הקווים המנוקדים הדקים מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ההשפעה של תאים סרטניים על פלישת תאי האנדותל. ניתוח תאי בזמן אמת של פלישת HUVEC, לבדו, בתרבית משותפת עם תאי MDA-MB-231 פולשים (תא תחתון) או תאי DCIS לא פולשניים (תא תחתון). העיגולים המוצקים מייצגים את הממוצע; הקווים המנוקדים הדקים מייצגים את סטיית התקן. אינדקס תאי דלתא מנורמל לעכבה בזמן = 1 שעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: פלישת תאים של קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) בתרבית משותפת עם תאי חיסון של מח עצם. תאים בודדים שהתפוררו מ-PDX (החדר העליון) עברו תרבית משותפת עם תאי מח עצם אנושיים (תא תחתון), והפלישה שלהם הייתה מנוטרת לאורך זמן בנוכחות או בהיעדר סרום. העיגולים המוצקים מייצגים את הממוצע; הקווים המנוקדים הדקים מייצגים את סטיית התקן. אינדקס תאי דלתא מנורמל לעכבה בזמן = שעה אחת ו-36 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: הרכב המדיה של תרביות תאים. הטבלה מפרטת את ההרכבים של מדיה MDA-MD-231, מדיה J2 Fibroblasts, מדיה DCIS ומדיה PDX.

אוניברסיטת ג'ורג'טאון הגישה פטנט הקשור לכמה מהגישות המתוארות בכתב יד זה. G.M.S, A.W, L.D ו- M.P נקראים כממציאים ביישום זה ומצהירים כי כניגוד עניינים פוטנציאלי.