איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

סיכום

מפות cryo-EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות יכולות להיות מושגות גם על ידי שימוש במיקרוסקופי TEM של 200 קילו-וולט. פרוטוקול זה מציג את שיטות העבודה המומלצות לקביעת יישור אופטיקה מדויק, סכימות איסוף נתונים ובחירת אזורי הדמיה החיוניים כולם לאיסוף מוצלח של מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה באמצעות TEM של 200 kV.

תקציר

מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הוקמה כשיטה שגרתית לקביעת מבנה חלבונים במהלך העשור האחרון, תוך לקיחת נתח הולך וגדל של נתונים מבניים שפורסמו. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית TEM ובאוטומציה הגבירה הן את מהירות איסוף הנתונים והן את איכות התמונות שנרכשו, ובמקביל הפחיתה את רמת המומחיות הנדרשת להשגת מפות cryo-EM ברזולוציות תת-3 Å. בעוד שרוב המבנים ברזולוציה גבוהה כאלה הושגו באמצעות מערכות cryo-TEM חדישות של 300 kV, ניתן להשיג מבנים ברזולוציה גבוהה גם עם מערכות cryo-TEM של 200 קילו-וולט, במיוחד כאשר הם מצוידים במסנן אנרגיה. בנוסף, אוטומציה של יישור מיקרוסקופים ואיסוף נתונים עם הערכת איכות תמונה בזמן אמת מפחיתה את מורכבות המערכת ומבטיחה הגדרות מיקרוסקופ אופטימליות, וכתוצאה מכך תפוקה מוגברת של תמונות באיכות גבוהה ותפוקה כוללת של איסוף נתונים. פרוטוקול זה מדגים את היישום של ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה ותכונות האוטומציה על מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 kV קריו-שידור ומראה כיצד לאסוף נתונים לשחזור מפות תלת-ממדיות המספיקות לבניית מודל אטומי דה נובו . אנו מתמקדים בשיטות עבודה מומלצות, משתנים קריטיים ובעיות נפוצות שיש לקחת בחשבון כדי לאפשר איסוף שגרתי של מערכי נתונים קריו-EM ברזולוציה גבוהה כאלה. במיוחד הנושאים החיוניים הבאים נסקרים בפירוט: א) אוטומציה של יישור מיקרוסקופים, ב) בחירת אזורים מתאימים לרכישת נתונים, iii) פרמטרים אופטיים אופטימליים לאיסוף נתונים באיכות גבוהה ובתפוקה גבוהה, iv) כוונון מסנן אנרגיה להדמיה ללא הפסד, ו- v) ניהול נתונים והערכת איכות. יישום שיטות העבודה המומלצות ושיפור הרזולוציה הניתנת להשגה באמצעות מסנן אנרגיה יודגמו בדוגמה של אפו-פריטין ששוחזר ל-1.6 Å, ותרמופלסמה אצידופילום 20S פרוטאזום ששוחזר לרזולוציה של 2.1-Å באמצעות TEM של 200 קילו-וולט המצויד במסנן אנרגיה ובגלאי אלקטרונים ישיר.

מבוא

קביעת מבנה החלבון היא קריטית להבנת הארכיטקטורה המולקולרית, התפקוד והוויסות של קומפלקסים של חלבונים המעורבים בתהליכים תאיים מרכזיים, כגון חילוף חומרים של תאים, התמרת אותות או אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) התגלתה כטכניקה רבת עוצמה המסוגלת לפתור את המבנה התלת-ממדי של חלבונים רבים ואת הקומפלקסים שלהם שהיו מאתגרים מדי עבור הטכניקות המבניות המסורתיות, כגון עקיפת קרני רנטגן וספקטרוסקופיה של NMR. במיוחד, cryo-EM הוכחה כשיטת הבחירה עבור חלבוני ממברנה, אשר לא ניתן לגבש בקלות או להכין בכמויות מספיקות עבור הטכניקות המבניות המסורתיות, וסיפקה תובנות חדשות על המבנה והתפקוד של קולטנים תאיים חשובים ותעלות יונים ^1,2,3,4,5 . לאחרונה, cryo-EM מילא תפקיד חשוב במאבק במגפת Covid-19 על ידי קביעת המנגנון של זיהום SARS-CoV-2 ברמה המולקולרית, אשר הבהיר את מקורות מחלת Covid-19 וסיפק את הבסיס לפיתוח מהיר של חיסונים וטיפולים יעילים ^6,7,8,9,10.

בדרך כלל, מיקרוסקופי אלקטרונים מתקדמים של 300 קילו-וולט (TEM) משמשים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של ביו-מולקולות על-ידי ניתוח חלקיקים יחידים של cryo-EM (SPA) כדי לחשוף את הקונפורמציה והאינטראקציות שלהם. לאחרונה, טכניקת ה-SPA הגיעה לגבול חדש כאשר דגימת ה-cryo-EM הנפוצה של אמת המידה אפו-פריטין שוחזרה ברזולוציה אטומית (1.2 Å)^11,12 באמצעות TEM של 300 קילו-וולט המצויד באקדח פליטת השדה הקר (E-CFEG), גלאי אלקטרונים ישיר ומסנן אנרגיה. בהחלטה זו, ניתן היה לפתור באופן חד משמעי עמדות של אטומים בודדים במבנה, קונפורמציה של שרשראות צד של חומצות אמינו בודדות, כמו גם קשרי מימן ואינטראקציות אחרות, הפותחות אפשרויות חדשות לגילוי תרופות מבוססות מבנה של מטרות חדשות ואופטימיזציה של מועמדים קיימים לתרופות.

מיקרוסקופי TEM לטווח בינוני של 200 קילו-וולט משמשים לעתים קרובות לסינון דגימות ואופטימיזציה של דגימות לפני איסוף נתונים סופי ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופי TEM מתקדמים, במיוחד במתקני cryo-EM גדולים יותר. בדרך כלל, ניתן לפתור דגימות בתמונה בטווח הרזולוציה של 3-4 Å שמספיק למעבר ל-TEM מתקדם של 300-kV לאיסוף נתונים סופי. כתוצאה מכך, איסוף נתונים באמצעות 200-kV TEM הוא לעתים קרובות לא ממוטב עוד יותר עבור התוצאות ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. יתר על כן, ניתן כבר לענות על שאלות ביולוגיות מעניינות רבות ולפרסם אותן ברזולוציות אלה, שכן כל שרשראות הצד של חומצות האמינו כבר נפתרו, וניתן לקבוע באופן מהימן גם את תפוסת אתרי קשירת^{הליגנד 13}. כבר הוכח כי TEMs של 200-kV יכולים להגיע לרזולוציות מעבר ל-3 Å עבור דגימות רבות 14,15,16,17,18. תמונות שצולמו ב-200 קילו-וולט מציגות ניגודיות גבוהה יותר מטבעה של חלקיקים שהוצפו, מה שעשוי אפילו לאפשר יישור ראשוני מדויק יותר של החלקיקים למרות אות מוחלש יותר ברזולוציה גבוהה בהשוואה לתמונות TEM של 300 קילו-וולט. חשוב לציין כי הרזולוציה שהושגה של מפות cryo-EM משוחזרות מוגבלת גם על ידי גמישות מבנית והטרוגניות קונפורמית של דגימות מדומות, המשפיעה הן על שחזורים של 200 kV והן על שחזורים של 300-kV. למעשה, הרבה יותר שחזורי cryo-EM שהושגו באמצעות מערכות 300-kV נפתרו בטווח הרזולוציה של 3-4 Å מאשר ברזולוציות גבוהות יותר¹⁹. מכיוון שמיקרוסקופים של 200 kV TEM הם פחות מורכבים ומתאימים לחדרים קטנים יותר, מיקרוסקופים אלה מייצגים אפשרות טובה ובעלות נמוכה יותר לקביעת מבנה של מקרומולקולות ביולוגיות על ידי cryo-EM תוך שמירה על אוטומציה של אוספי נתונים ארוכים מדגימות מרובות המאוחסנות במערכת המיקרוסקופ Autoloader.

איסוף מערכי נתונים של cryo-EM לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה דורש יישור מדויק של האופטיקה של המיקרוסקופ. יישור העמודים מתקדם באופן שיטתי ממקור האלקטרונים עד למערכת עדשות המעבה, העדשה האובייקטיבית ומסנן האנרגיה עם גלאי אלקטרונים. רצף היישורים המלא אינו נדרש בדרך כלל. בעת הצורך, המשתמש מונחה באמצעות הליכים אוטומטיים למחצה עם תיאור נכון של כל שלב בחלון עזרה מודע להקשר לאורך כל הליך היישור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ (לוח הבקרה של יישור ישיר). ברגע שהמיקרוסקופ מיושר במלואו, אופטיקת האלקטרונים נשארת יציבה, ואין צורך לשנות את היישורים במשך כמה חודשים לפחות. רק את היישורים הרגישים ביותר, כגון תאורה מקבילה של מישור הדגימה, אסטיגמציה אובייקטיבית ויישור ללא תרדמת, יש לחדד רגע לפני שמתחילים באיסוף של כל מערך נתונים. לאחר מכן ניתן לנטר את איכות הנתונים שנאספו במהלך איסוף הנתונים באמצעות חבילות תוכנה שונות, כגון EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live²⁰, Relion²¹, Scipion²², WARP²³ או Appion²⁴.

מלבד יישורים מדויקים של המיקרוסקופ, האיכות הגבוהה של דגימות מטוהרות היטב עם הטרוגניות קונפורמיות והרכבית מינימלית היא גם תנאי מוקדם לאיסוף מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה ופתרון מבנים ברזולוציה גבוהה. פרטים נוספים על פרוטוקולים טיפוסיים, אתגרים תכופים ותרופות אפשריות ניתן למצוא בסקירות אחרות המוקדשות לנושא זה 25,26,27. בעיקרו של דבר, זה קריטי למצוא אזורים ברשת cryo-EM נתונה שיש להם קרח דק מספיק כדי לשמר מידע ברזולוציה גבוהה, וחלקיקים בודדים מפוזרים בצפיפות בכיוונים אקראיים ללא חפיפה. עם זאת, לרשתות cryo-EM טיפוסיות יש עובי קרח לא אחיד, ולכן חשוב למצוא ולבחור את האזורים האופטימליים להדמיה. אמצעים שונים להערכת עובי הקרח ברשת זמינים בחבילות תוכנה המוקדשות לאיסוף אוטומטי של מערכי נתונים של cryo-EM, כגון EPU 2, Leginon²⁸ או SerialEM²⁹.

הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים מהירים ורגישים אפשרה איסוף של תמונות בשברים רבים כסרטים שאפשרו פיצוי של תנועות המושרות על ידי אלומות והביאו לעלייה משמעותית באיכות ובכמות הנתונים המשמשים בעיבוד תמונה ובשחזור תלת-ממדי סופי³⁰. במקביל, אוטומציה ואיסוף נתונים בתפוקה גבוהה מספקים מערכי נתונים ענקיים עם אלפי תמונות/סרטים המייצגים אתגרים לאחסון נתונים וגישה אליהם. המודל שאומץ עם מתקני cryo-EM גדולים המשרתים עשרות עד מאות משתמשים במיוחד קורא לניהול נתונים מאורגן עם מעקב נכון ושיתוף נתונים בצינורות cryo-EM מבוססים^31,32.

מחקר זה מתאר פרוטוקול לאיסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ TEM Glacios 200 kV. היישורים הדרושים של האופטיקה של המיקרוסקופ מתוארים יחד עם נהלים להערכת דגימות cryo-EM ובחירת אזורים מתאימים לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. ארגון הנתונים שנאספו ומטא-נתונים קשורים עם מידע לדוגמה מודגם ב- Athena - פלטפורמת ניהול נתונים המאפשרת סקירה של מידע לדוגמה ונתונים שנאספו. באמצעות דגימת אפו-פריטין של העכבר, ניתן היה להשיג שחזור תלת-ממדי ברזולוציה 1.6 Ź³. באמצעות הפרוטוקול המתואר, שחזרנו גם את מפת הצפיפות התלת-ממדית של הפרוטאזום 20S מתרמופלזמה אצידופילום ברזולוציה של 2.1 Å.

פרוטוקול

כל שלבי הפרוטוקול מתוארים עבור מערכת 200 kV Glacios TEM (המכונה להלן 200 kV TEM) המצוידת במסנן האנרגיה Selectris-X (המכונה להלן מסנן האנרגיה) וגלאי Falcon 4 (המכונה להלן גלאי אלקטרונים ישיר). שלבי הפרוטוקול הם ספציפיים עבור יישום EPU, שהיא תוכנת איסוף נתוני SPA המוגדרת כברירת מחדל המותקנת מראש בכל מערכת Glacios. שלבי הפרוטוקול שלהלן תואמים לגרסת EPU 2.14 וצפויים שינויים קטנים בעת שימוש בגרסת EPU אחרת. הדרישות המוקדמות לפרוטוקול זה הן: i) יישורי האקדח והעמודות מיושרים היטב, ii) כיול ה- EM נכון ו- iii) הפונקציות האוטומטיות של EPU מכויילות כראוי.

1. טעינת רשתות למיקרוסקופ

הערה: 200 kV TEM המשמש בניסוי זה יכול להכיל עד 12 autogrids (כלומר, רשתות TEM קונבנציונליות שנחתכו לתוך מחסנית מיוחדת) בתוך קלטת שנטענת בתוך Autoloader של המיקרוסקופ ונשמרת כל הזמן בטמפרטורות מתחת ל -170 מעלות צלזיוס כדי למנוע דה-ויטמיריזציה של דגימה.

1. הכנס autogrids לתוך קלטת Autoloader בתנאי חנקן נוזלי.
2. הכנס את הקלטת עם autogrids לתוך קפסולת העברה מקורר חנקן נוזלי.
3. הכנס את הקפסולה למיקרוסקופ ולחץ על כפתור Dock בממשק המשתמש של המיקרוסקופ כדי לטעון את הקלטת מהקפסולה לתוך Autoloader של המיקרוסקופ.
4. לחץ על הלחצן מלאי כדי לבדוק את נוכחותם של autogrids בקלטת הטעונה.
5. לחץ על הלחצנים טען ופרק כדי להוסיף רשתות אוטומטיות לעמודה להדמיית TEM לצורך הדמיית TEM.

2. הגדרת פרוייקט בפלטפורמת ניהול נתונים (אופציונלי)

הערה: ניתן לארגן מידע לדוגמה ונתונים שנאספו בפלטפורמת ניהול הנתונים המסופקת המאפשרת אחסון של נתונים מובנים עבור כל המכשירים המחוברים. ניתן ליצור פרוייקט שעבורו ניתן להגדיר את כל שלבי זרימת העבודה כדי ללכוד את התמונות והמטא-נתונים באופן מאורגן לסקירה וייצוא.

1. הפעל את יישום פורטל ניהול הנתונים והתחבר באמצעות שם משתמש וסיסמה.
2. בחלונית הימנית של ממשק המשתמש של הפורטל, לחץ על לחצן הוסף פרוייקט כדי ליצור פרוייקט חדש או לחץ על לחצן של פרוייקט קיים ברשימה שלהלן כדי לפתוח פרוייקט.
3. לחץ על לחצן הוסף ניסוי כדי ליצור ניסוי חדש בתוך הפרויקט שנפתח.
4. מלאו את התיאור בחלונית המטא-נתונים של הניסוי החדש ולחצו על הלחצן 'הוסף זרימת עבודה' כדי ליצור זרימת עבודה חדשה בתוך הניסוי (לדוגמה, ניתוח חלקיקים בודדים).
5. לחלופין, לחץ על לחצן הוסף שלב בחלונית האמצעית כדי ליצור זרימת עבודה מותאמת אישית או הוסף שלבים נוספים לזרימת העבודה המוגדרת מראש של SPA (איור 1 ואיור 2).
   הערה: השלבים עשויים לייצג הכנת דגימה, אפיון דגימה על ידי טכניקות ביוכימיה, ויטריפיקציה של דגימה, סינון רשתות cryo-EM, מפגשי איסוף נתונים וניתוח נתונים.
6. לחלופין, מלאו תיאורים בהערות של כל שלב, שעשויות לכלול תמונות ותמונות.
7. צור שלב ערכת נתונים בזרימת העבודה ובחר את סוג ערכת הנתונים כ - EPU.
   הערה: פעולה זו תאפשר לתוכנת הניתוח למקם את כל נתוני התוצאות/מטה-נתונים במקום הנכון בפורטל ניהול הנתונים באופן אוטומטי במהלך רכישת הנתונים ולייצא את הנתונים באופן אוטומטי ליעד המועדף תוך שמירה על תיעוד מלא של כל השלבים והעברת הנתונים.
8. מלא תבניות על רשתות הדגימה וה-EM בשלב הביוכימיה וקשר כל רשת לדגימה (שים לב שניתן לשייך דגימה אחת לרשתות מרובות).
9. שיוך שילובים של רשתות לדוגמה במקטע מטה-נתונים של שלב ערכת הנתונים .

3. הגדרת הגדרות קבועות מראש של הדמיה וכיולים של הזזת תמונה בתוכנת הניתוח

1. הגדר פרמטרי הדמיה למצבי הדמיה בודדים כפי שמוצג בטבלה 1. שיקולים לבחירת הגדרות ספציפיות מתוארים בפירוט בסעיף דיון.
2. הגדרת תאורה מקבילית עבור ההגדלה שנבחרה בקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים של תוכנת הניתוח
   הערה: יש רק הגדרה אחת של עדשת C2 להארה מקבילית של הדגימה בגודל SPOT הנתון (כלומר, עוצמות מוגדרות מראש של עדשת C1) במערכות TEM של 2 מעבים, כגון 200 kV TEM ששימש במחקר זה. לפיכך, ניתן לכוונן את קצב מינון האלקטרונים ליחידת שטח (e^-/Ų/s) רק על ידי שינוי הגדרות גודל ה-SPOT והתאמת חוזק ה-C2 (עוצמת הקרן) בהתאם לשלבים שלהלן.
   1. עברו לאזור עם רדיד פחמן תומך וקרח דק או ללא קרח כלל.
   2. בחר את מפתח הצמצם האובייקטיבי של 100 מיקרומטר או 70 מיקרומטר בתפריט Aperture של ממשק המשתמש של TEM.
   3. לחץ על לחצן עקיפה בלוחות הבקרה כדי לעבור למצב עקיפה.
   4. הכנס את מסך הפלורסנט ושנה את מצב FluCam לרזולוציה גבוהה.
   5. הזז את נקודת עקיפה מרכזית לקצה הצמצם. אם קצה הצמצם אינו נראה לעין, הגדל את אורך המצלמה (באמצעות ידית ההגדלה).
   6. סובבו בזהירות את ידית ה-Focus בלוח הבקרה כדי למקד את מישור המוקד האחורי. מישור המוקד האחורי ממוקד כאשר קצה הצמצם חד בעליל.
   7. הפחיתו את הרגישות של ה-FluCam לרמה הנמוכה ביותר והזיזו את נקודת עקיפה מרכזית למרכז ה-FluCam.
   8. צמצם את גודל הנקודה המרכזית באמצעות כפתור העוצמה בלוח הבקרה.
   9. חזור למצב הצמצם האובייקטיבי בממשק המשתמש של TEM וחזור למצב ההדמיה.
   10. לחץ על לחצן קבל בתוכנת ניתוח כדי לשמור את ההגדרות בקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים.
3. התאם את קצב מינון האלקטרונים בקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים שהיא אופטימלית לגלאי משומש:
   1. מעבר לאזור ריק ברשת (למשל ריבוע רשת עם רדיד פחמן שבור)
   2. לחץ על כפתור מדידת מינון בתוכנת ניתוח כדי למדוד את קצב מינון האלקטרונים.
   3. שנה את גודל ה-SPOT כדי להשיג את שיעור המינון האופטימלי. במקרה של גלאי האלקטרונים הישירים המשמש בפרוטוקול זה, קצב מינון של 4-5 e^-/pixel/s משמש בדרך כלל לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. זה בדרך כלל מתאים לגודל SPOT 4-6.
   4. בדוק והתאם את התאורה המקבילית בהגדרת גודל SPOT החדשה כמתואר לעיל.
   5. בחר באפשרות EER תחת שברים כדי להשתמש במצב EER בגלאי האלקטרונים הישיר³³.
   6. לחץ על לחצן קבל בתוכנת הניתוח כדי לשמור את ההגדרות בקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים.
   7. עבור לקביעה המוגדרת מראש של מיקוד אוטומטי ולחץ על לחצן קבל כדי לשמור את הגדרות התאורה למיקוד. שנה באופן ידני את זמן החשיפה ל- 1 שניות ואת מצב חיבור 2.
   8. עבור להגדרה מראש של Thon Rings ולחץ על לחצן קבל כדי לשמור את הגדרות התאורה עבור הגדרה מוגדרת מראש זו. שנה באופן ידני את זמן החשיפה ל- 1-2 שניות ואת מצב ה- binning 2.
   9. עבור לקביעה המוגדרת מראש של אפס אובדן ולחץ על לחצן קבל כדי לשמור את הגדרות התאורה עבור קביעה מוגדרת מראש זו. שנה באופן ידני את זמן החשיפה ל- 0.5 שניות ואת מצב החיבור 4.
4. כיול מעברי תמונה בין ההגדרות האופטיות המוגדרות כמתואר במדריך תוכנת הניתוח באמצעות המשימה כיול משמרת תמונה בכרטיסיה הכנה (איור משלים 1).

טבלה 1: הגדרות הדמיה אופייניות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-TEM של 200 קילו-וולט המצויד במסנן אנרגיה ובגלאי אלקטרונים ישיר. ההגדרות מוצגות עבור כל הגדרה אופטית מוגדרת מראש המשמשת להגדרת איסוף נתונים אוטומטי (סעיף 3 של הפרוטוקול). הגדרות אלה ספציפיות למיקרוסקופ TEM של 200 קילו-וולט ולגלאי אלקטרונים ישירים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

4. מיפוי רשת ובחירה של רשתות cryo-EM הטובות ביותר לאיסוף נתונים

1. בחר בכרטיסייה אטלס ולחץ על לחצן הפעלה חדשה כדי לפתוח הפעלה חדשה.
2. מלא פרטים כגון שם הפעלה ומיקום אחסון נתונים ולחץ על הלחצן החל כדי לפתוח חלון משימת סינון חדש, המציג רשימה של כל הרשתות במלאי Autoloader. לחלופין, ערוך את שמות הרשתות.
3. בחר את הרשתות המעניינות על-ידי בחירת תיבת סימון לצד מספר הרשת המתאים.
4. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל אוסף אוטומטי לחלוטין של אטלסים של כל הרשתות שנבחרו.
5. לאחר השלמת האוסף, לחץ על תוויות רשת כדי לסקור את האטלסים שנרכשו.
   הערה: ריבועי רשת בודדים מסווגים לפי עובי הקרח היחסי שלהם, המבוסס על הערכת ערך גווני אפור יחסית בכל אטלס. ריבועי הרשת המסווגים מתוארים בערכות צבעים שונות שניתן להשתמש בהן להנחיית בחירת אזורי רכישת הנתונים. רשת המיוצרת עם Vitrobot Mk IV תציג בדרך כלל שיפוע עובי קרח על פני הרשת כולה, מה שעשוי לסייע בזיהוי עובי הקרח האידיאלי לאיסוף נתונים. רשת אופטימלית צריכה להכיל כמה שפחות זיהום קרח העברה ולהציג מספיק ריבועי רשת רצופים ונטולי סדקים (איור 3). ניתן לחקור עוד יותר רשתות עם התפלגות קרח מתאימה כדי להעריך את התפלגות החלקיקים בקרח בהגדלה גבוהה (כלומר, צפיפות וכיוונים של חלקיקים בודדים).
6. לחץ על לחצן טען לדוגמה בתפריט העליון כדי להוסיף רשת נבחרת עם התפלגות קרח מתאימה לעמודת המיקרוסקופ.
7. בחר את הכרטיסיה אטלס , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ריבוע רשת מתאים בתמונת האטלס ובחר באפשרות העבר שלב לכאן מהתפריט הנפתח כדי להעביר את הבמה לריבוע הרשת.
8. בחר בכרטיסיה פונקציות אוטומטיות כדי להגדיר את ריבוע הרשת לגובה Eucentric. עבור לקביעה המוגדרת מראש של גובה Eucentric , לחץ על הפונקציה האוטומטית Auto-Eucentric by Beam Tilt באמצע ריבוע הרשת שנבחר ולחץ על לחצן התחל .
9. עבור להגדרה מראש של ריבוע הרשת ורכוש תמונה. הזז את הבמה לחור עם קרח וללא זיהום או זיהום מינימלי על ידי לחיצה ימנית ואפשרות הזזת שלב כאן .
10. עבור לקביעה המוגדרת מראש של Hole/Eucentric Height ורכוש תמונה. הזז את הבמה לאזור פחמן ליד חור העניין בלחיצה ימנית ובאפשרות הזז שלב כאן .
11. לחץ על הפונקציה האוטומטית של מיקוד אוטומטי והגדר ערכים עבור ה- defocus הרצוי ל- 0 μm ו- Iterate ל- -2 μm. עבור אל ההגדרה המוגדרת מראש של מיקוד אוטומטי ולחץ על לחצן התחל .
12. בחר שוב בכרטיסייה הכנה ועבור לקביעה המוגדרת מראש של חור/גובה יוצנטרי . בתמונת החור שנרכשה בעבר, בחר אזור עניין בתוך החור והזיז את הבמה למיקום זה על-ידי לחיצה ימנית ובחירה באפשרות הזזת שלב כאן .
13. עבור לקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים והגדר את זמן ההמתנה לאחר הזזת הקרן ל- 0.5 שניות ואת זמן ההמתנה לאחר מעבר השלב ל- 20 שניות. רכוש תמונה באמצעות defocus בין -3 מיקרומטר ל -5 מיקרומטר כדי להגביר את הניגודיות ברזולוציה נמוכה להדמיה טובה יותר של חלקיקים בודדים.
14. לחלופין, חזור על שלבים 4.7-4.13 כדי לצלם חלקיקים בחורים שונים וריבועי רשת שונים עם עובי קרח שונה לפי הצורך.
15. לאחר זיהוי ובחירה של הרשת המתאימה ביותר לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה, לחץ על לחצן טען לדוגמה בתפריט העליון כדי לטעון את הרשת שנבחרה לתוך ה- TEM.
    הערה: לחלופין, אם יש צורך במידע נוסף ו/או באוטומציה של תהליך סינון זה, בצע את סעיף 5.

5. הגדרת סשן איסוף נתונים בתוכנת ניתוח חלקיקים בודדים

הערה: אם משתמשים ברשתות רדיד הזהב, ייתכן שעידון של אסטיגמציה אובייקטיבית ויישור תרדמת (סעיף 6) לא יעבוד באופן אמין. מומלץ לטעון רשת רדיד פחמן או רשת EM חוצת סורגים ולבצע את היישורים הסופיים הללו לפני הגדרת איסוף הנתונים.

1. בחר בכרטיסייה EPU ולחץ על לחצן יצירת הפעלה כדי ליצור הפעלה חדשה בחלונית הימנית. בחר באפשרות הפעלה חדשה כדי להשתמש בקביעות אופטיות מוגדרות מראש נוכחיות או באפשרות חדש מהעדפות כדי לטעון הגדרת הפעלה שיוצאה בעבר.
2. מלא את שם ההפעלה ואת מיקום אחסון הנתונים.
   הערה: מיקום זה ישמש לשמירת תמונות ומטא-נתונים משולבים מהפעלת איסוף הנתונים בתיקיית משנה עם שם ההפעלה. למרות שנתונים אלה לא יתפסו כמות משמעותית של שטח אחסון, מומלץ לשמור נתונים אלה באחסון הנתונים של Falcon offload של שרת ה- DMP מכיוון שמסגרות המצלמה של EER מאוחסנות תמיד בספריית הבסיס של אחסון נתונים זה בספריה עם שם ההפעלה.
3. בחר את הסוג הידני של ההפעלה כדי לקבל שליטה על בחירת חורים בודדים בריבועי רשת שנבחרו לאיסוף נתונים בהמשך הפרוטוקול.
4. בחר במצב רכישה מהיר יותר כדי להשתמש בהזזת תמונה ללא סטייה (AFIS) לאיסוף נתונים כדי להפחית את תנועות הבמה בין חורים בודדים, להפחית את הסחף הכולל של דגימה ולהגדיל את התפוקה של איסוף הנתונים ללא הידרדרות באיכות התמונה.
5. בחר את תבנית mrc המוגדרת כברירת מחדל של תמונות משולבות שנשמרו.
6. ציין את הרשת המשומשת ואת סוגה. פרוטוקול זה השתמש ב-R-1.2/1.3 UltraAufoil עבור אפו-פריטין וברשת R-2/1 Quantifoil עבור פרוטאזום 20S. בחר Quantifoil תחת נושא דגימה ו - R1.2/1.3 או 2/1 תחת סוג Quantifoil.
7. אופציונלי: לחץ על כפתור הכניסה של אתנה בפינה השמאלית התחתונה כדי להשתמש בצג האיכות של EPU (EQM).
   1. הזן פרטי התחברות בחלון המוקפץ של הדפדפן כדי להפעיל את המקטע הגדרות בסקירה הכללית של הגדרת הפעלה .
   2. לחץ על לחצן בחר במקטע הגדרות ועיין בערכת הנתונים שנוצרה בעבר (פרוטוקול סעיף 2) כדי לשייך אותה לאיסוף הנתונים הנוכחי. הפעל את תיבת הסימון הפעל את צג האיכות .
8. לחץ על הלחצן החל כדי ליצור הפעלה חדשה.
   הערה: פעולה זו תפתח משימות חדשות בתפריט העמודה הימנית. בכל שלב במהלך ההפעלה, אם פרטים מסוימים שגויים, ניתן לחזור למשימה הגדרת הפעלה , לשנות/לעדכן את הפרטים וללחוץ על החל שוב כדי לעדכן את ההפעלה.
9. בחר את המשימה בחירת ריבועים בחלונית השמאלית כדי להציג את האטלס שנאסף של הרשת.
10. לחלופין, לחץ פעמיים על כל אריח של האטלס כדי לראות תמונה באיכות גבוהה יותר כדי לשפוט טוב יותר את איכות הקרח בריבועי הרשת. לחץ שוב על התמונה פעמיים כדי לחזור לאטלס הרשת.
11. זהה ריבועי רשת עם המאפיינים הבאים (איור 4): (i) רדיד התמיכה בריבוע הרשת שלם ללא נזק, (ii) קרח דק זגוגי בחורי רדיד אלומיניום (החורים נראים בהירים יותר מרדיד הפחמן התומך), (iii) כמה שפחות זיהום קרח גבישי (כתמים שחורים) בריבוע הרשת, (iv) שיפוע בהירות מינימלי על פני ריבוע הרשת ובתוך חורי רדיד אלומיניום בודדים.
    הערה: עם ההגדרות המוגדרות מראש שנבחרו ועם רשת טובה, 200 kV cryo TEM המשמש במחקר זה יכול לצלם בקצב של ~ 200-300 סרטים / שעה. מתוך מחשבה על כך, בחר כמה ריבועים לפי הצורך, או הוסף עוד מאוחר יותר על ידי חזרה למשימת בחירת הריבועים בהתאם לכמות הזמן הזמינה במיקרוסקופ. לשם השוואה, 3000 סרטים נאספו להשגת רזולוציה של 1.6 Å של אפו-פריטין.
12. בחר ריבועי רשת לאיסוף נתונים באטלס המלא או בתמונות אריחים באיכות גבוהה
    1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ריבוע רשת מעניין ובחר באפשרות בחר בתפריט ההקשר
    2. לחלופין, החזק את מקש Ctrl במקלדת ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ריבועי הרשת הרצויים
    3. לעומת זאת, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובטל את הבחירה או החזק את מקש Shift ולחץ לחיצה שמאלית כדי להסיר ריבועים
    הערה: השלבים הבאים הם קריטיים כדי להבטיח שאיסוף הנתונים יביא לשחזור ברזולוציה גבוהה. התחל בבחירת חורים בריבוע הרשת בשכבת קרח דקה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ריבוע רשת זה ובחר באפשרות בחר חורים כדי להתחיל במשימה בחירת חורים .
13. בחר את המשימה בחירת חורים בחלונית השמאלית כדי לבחור חורים בריבועי הרשת שנבחרו.
14. לחץ על הלחצן Auto-Eucentric כדי לעבור באופן אוטומטי לריבוע הרשת הראשון שנבחר, להתאים את הגובה האוצנטרי ולרכוש תמונה ריבועית של רשת למציאת חורי רדיד אלומיניום.
15. לחצו על הלחצן 'מצא חורים ' כדי למצוא חורי רדיד בתמונה.
    הערה: אם מציאת חורים לא עבדה היטב (כלומר, ישנם חורים שדילגו עליהם או חורים בגודל שגוי בתמונה), בדקו שהערכים הנכונים הוזנו בערך Quantifoil Type של משימת הגדרת ההפעלה ומצאו שוב חורים. אם חורים עדיין לא נמצאו כראוי, לחץ על כפתור מדידת גודל החור כדי להגדיר את קוטר החור ואת המרחק באופן ידני ולמצוא שוב חורים.
16. לחץ על לחצן הסר חורים קרוב ללחצן סרגל הרשת כדי לבטל את הבחירה בחורים ליד פסי רשת.
17. התאם את הגבולות בהיסטוגרמה של הבהירות של מסנן הקרח (בפינה הימנית התחתונה של חלון התוכנה) כדי להסיר את כל החורים עם קרח סמיך מדי (באמצעות קו הגבול השמאלי) וכן את כל החורים הריקים (באמצעות קו הגבול הימני) כפי שמוצג באיור 4.
    הערה: לצורך עידון, ניתן להזין ערכי עוצמה ספציפיים גם בתיבות הטקסט המתאימות לצד לחצן החל .
18. לחלופין, השתמש במברשת הבחירה כדי לחדד את בחירת החורים באופן ידני: לחץ לחיצה שמאלית וגרירת המברשת כדי לבטל את הבחירה של חורים לא רצויים. החזק את מקש Ctrl ולחץ לחיצה שמאלית כדי לבחור מחדש חורי נייר כסף. החזק את מקש Shift וגלול עם גלגל העכבר כדי להתאים את גודל המברשת.
19. בחר חור להגדרה ובדיקה של תבנית רכישת נתונים שתשמש שוב ושוב לאורך איסוף הנתונים: לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חור בתמונה המרובעת של הרשת ובחר באפשרות הזז שלב למיקום.
20. בחר את המשימה הגדרת תבנית בחלונית השמאלית.
21. בחר את ההגדרה המוגדרת מראש של Hole/Eucentric ולחץ על כפתור רכישה כדי להשיג תמונה.
22. לחץ על הלחצן חיפוש וחור מרכזי כדי למרכז חור בתמונה.
23. הגדר ערכים עבור השהיה לאחר העברת תמונה ל- 0.5 שניות (ברירת מחדל) ועיכוב לאחר העברת שלב ל- 20 שניות.
    הערה: מכיוון שקוטר הקרן המקבילה קבוע במערכת cryo-TEM של 200 kV ששימשה במחקר זה ובדרך כלל מתאים ל-1.6-1.7 מיקרומטר עם מפתח צמצם של 50 מיקרומטר, ניתן לרכוש רק תמונה אחת לכל חור באמצעות רשתות R-1.2/1.3 ו-2 תמונות לכל חור (בקצוות מנוגדים) באמצעות רשתות R-2/1 או R-2/2. שים לב שגודל אזורי הרכישה המוגדרים על המסך אינו תואם את קוטר הקרן בפועל. ניתן להשתמש בסרגל קנה המידה של התמונה כדי להעריך מרחק מיקום מתאים.
24. בחר בלחצן הוסף אזור רכישה ולחץ על התמונה כדי לבחור את המיקום בחור הממורכז שממנו תילקח רכישת תמונה בהגדלה גבוהה.
25. בחר בלחצן הוסף אזור מיקוד אוטומטי ולחץ על התמונה כדי לבחור את המיקום בנייר הכסף של התמיכה לצד החור הממורכז שבו יבוצע המיקוד האוטומטי של התמונה.
    הערה: גודל הקרן למיקוד הוא 1.6-1.7 מיקרומטר ויש למקם אותו באופן שווה מחורים שכנים על פחמן.
26. לחץ על אזור הרכישה הירוק כדי להגדיר רצף של ערכי defocus ברשימת Defocus בחלק העליון של חלון התוכנה. הזן את ה-defocus הגבוה ביותר כראשון כדי לשפר את ההדמיה של חלקיקים בהרצת בדיקה של משימת ביצוע התבנית הבאה.
27. לחץ על אזור המיקוד האוטומטי הכחול כדי להגדיר את ההגדרות הספציפיות למיקוד אוטומטי באותו אזור:
    1. בחר באפשרות לאחר מרכוז למימוש אוטומטי בתחילת כל אשכול AFIS.
    2. בחר באפשרות עדשה אובייקטיבית למיקוד אוטומטי מהיר יותר ולהפחתת סחף שלבים.
28. בחר את המשימה ביצוע תבנית ולחץ על הלחצן בצע.
    1. שימו לב לשלבים בודדים של הליך איסוף הנתונים (מרכז החור, מיקוד אוטומטי באזור שנבחר ורכישת תמונה באזורים שנקבעו) ובדקו את איכות החלקיקים המצולמים בתמונה הסופית בהגדלה גבוהה.
    2. לחץ על לחצן FFT בפינה השמאלית התחתונה של חלון התמונה בהגדלה גבוהה כדי לבדוק את תמונת ה- FFT ולהעריך באופן חזותי אם טבעות Thon מציגות תנודות מרובות ומתרחבות לרזולוציה גבוהה בתמונת ה- FFT.
29. אם ביצוע התבנית הושלם בהצלחה, לחץ על לחצן הכן את כל הריבועים במשימה בחירת חורים כדי שאיסוף הנתונים יוגדר באופן אוטומטי בכל ריבועי הרשת האחרים שנבחרו בהתאם להגדרות המשמשות בריבוע רשת ראשון זה.

6. יישור מיקרוסקופים סופיים לפני תחילת איסוף הנתונים

הערה: כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר ברזולוציה גבוהה, היישורים הרגישים ביותר צריכים להיעשות בדיוק באותן הגדרות כמו מצב רכישת הנתונים בתוכנת איסוף הנתונים ורגע לפני תחילת רכישת הנתונים בפועל. יישורים אלה צריכים להיעשות במיקום עם פחמן תומך דק של הרשת, רחוק מספיק מכל פסי רשת, ומיושר בגובה האוצנטרי.

1. בחר את המשימה ביצוע תבנית , קבל תמונה חדשה ועבור עם הבמה לאזור נקי בנייר כסף פחמן בלחיצה ימנית ובחר באפשרות התפריט הזז שלב כאן.
2. בחר בכרטיסייה פונקציות אוטומטיות והגדר את ה - defocus הרצוי ל- 0 μm ו - Iterate ל- -2 μm. עבור אל ההגדרה המוגדרת מראש של מיקוד אוטומטי ולחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את פונקציית המיקוד האוטומטי.
3. הניחו את מסך הפלורסנט למטה ופתחו את התפריט של יישור ישיר בממשק המשתמש של TEM.
4. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, משתמשים מנוסים עשויים לאמת יישור נקודות ציר: בחר במשימה nP Beam Tilt pp X בתפריט יישור ישיר וחופף באופן מרבי את הקורות המקפצות באמצעות הידיות הרב-תכליתיות בלוחות הבקרה. חזור על הפעולה עבור המשימה np Beam Tilt pp Y .
5. לחץ על לחצן EF בתפריט מצלמת המסך הפלואורסצנטי כדי להציג עיגול ירוק המציין את מפתח הצמצם של הכניסה למסנן האנרגיה ומרכז את הקרן מעל העיגול הירוק.
   הערה: ודא שמשאבת הטורבו נעצרת לפני שתמשיך; תנודות ממנו מפחיתות את מספר טבעות התון הנראות לעין ולעתים קרובות גורמות לפונקציות האוטומטיות להיכשל.
6. חזור לחלון התוכנה ובחר את הכרטיסיה פונקציות אוטומטיות בשורת התפריטים.
7. בחר את המשימה Autostigmate , עבור להגדרה מראש של Thon Ring ולחץ על לחצן התחל . שימו לב לתהליך כדי לוודא ש-(i) התמונות שצולמו הן על פחמן, (ii) טבעות התון נראות בבירור, ו-(iii) התאמת ה-CTF המחושבת (קווים מנוקדים) ממוקמת היטב במינימה של טבעת תון (איור משלים 2).
8. בחר את המשימה Autocoma ולחץ על לחצן התחל . שימו לב לתהליך כדי לוודא שהתמונות שצולמו הן על פחמן ושטבעות התון נראות בבירור ושהתאימים המחושבים (קווים מנוקדים) ממוקמים היטב במינימה של טבעת תון. הגדל לתוך כל תמונה של טבעת Thon באמצעות גלגל הגלילה של העכבר (איור משלים 3).
   הערה: אם המיקרוסקופ מצויד במסנן אנרגיה, יש לבצע כוונון מסנן אנרגיה כחלק מרצף היישור כדי למרכז את חריץ המסנן לשיא אפס האובדן ולתקן עיוותים במנסרה של מסנן האנרגיה (שלבים 6.9-6.14). יישורים אלה צריכים להיעשות באזור ריק של הרשת, כגון בתוך ריבוע רשת שבור.
9. פתחו את ממשק המשתמש של Sherpa ובחרו את היישום 'מסנן אנרגיה' (איור משלים 4).
10. הגדר את המצלמה ל - EF-Falcon, סל 4x, זמן חשיפה 0.2 שניות בחלון הגדרות .
11. לחץ על לחצן מרכז באפשרות אפס אובדן כדי למרכז את חריץ מסנן האנרגיה ללא אובדן.
12. לחץ על הלחצן 'כוונן ' באפשרות איזוכרומטיות (איור משלים 4).
13. לחץ על הגדלה של המנגינה ועיוותי המנגינה באפשרות של עיוותים גיאומטריים וכרומטיים (איור משלים 5, איור משלים 6)
14. אם התוצאות אינן נמצאות במפרטים שצוינו ומוצגות בצבע אדום בדוח הפלט, התאם שוב את היישורים משלב 6.11.
    הערה: למרות שהתייחסות לרווח גלאי האלקטרונים הישיר יכולה להיות יציבה במשך חודשים, יש לקחת הפניה חדשה לרווח באמצעות מנהל התמונות של Falcon 4 Reference אם תמונות של אזורים ריקים אינן מראות עוצמה אחידה אלא מציגות פסים או תכונות שונות אחרות. לחלופין, חשב התמרת פורייה מהירה (FFT) של תמונה כזו וודא שאין קווים גלויים.
15. בחלון התוכנה, בחר בכרטיסייה הכנה ועבור לקביעה המוגדרת מראש של רכישת נתונים .
16. הגדר את הגדרת המינון ל- 40 e^-/Ų ולחץ על הלחצן מדוד את שיעור המינון .
17. עבור אל הכרטיסיה EPU , בחר את משימת הרכישה האוטומטית ובדוק באופן אופציונלי את הפונקציה אפס אובדן אוטומטי ; לחץ על לחצן התחל הפעלה כדי להתחיל באיסוף נתונים אוטומטי לחלוטין.

7. ניטור ואופטימיזציה של איכות הנתונים במהלך איסוף הנתונים

הערה: בעוד איסוף הנתונים נמשך, ניתן לנטר נתונים שנאספו באמצעות EQM באמצעות פורטל ניהול הנתונים. EQM מבצע תיקון תנועה וקביעת CTF תוך כדי תנועה ומציג את התוצאות בפורטל. לאחר מכן המשתמש יכול לשפוט את איכות הרכישות הבודדות, לראות גרפים על מדדי איכות שונים, לסנן רכישות לא רצויות ולייצא את הנתונים לאחסון הסופי שלהם תוך כדי תנועה או כעבודת אצווה.

1. נווט אל מערך הנתונים שתוכנת הניתוח ממקמת את הנתונים לשימוש בדפדפן אינטרנט.
2. בסקירה הכללית של ערכת הנתונים, כרטיסי רכישה מציגים את המידע אודות תיקון תנועה וקביעת CTF בתבנית גרפית. לחץ על כרטיסים בודדים כדי לקבל מידע נוסף.
3. אפשר ללוח DataViz להציג גרפים מצטברים מתוך מערך הנתונים המלא המציגים את טווח ההפחתה, האסטיגמציה וביטחון ה-CTF לרכישה (איור משלים 7).
4. השתמש במסננים שבראש החלונית כדי לבחור רק את הנתונים שנמצאים בטווח ההפחתה המבוקש, יש להם אסטיגמציה קרובה לאפס, וניתן לקבוע את ה- CTF עד לרזולוציה שצוינה (היעד). לאחר הגדרת המסננים, לחץ על הלחצן החל כדי להציג רק את הנתונים שנבחרו בחלון הסקירה הכללית של ערכת הנתונים.
5. כאשר רוב התמונות שנרכשו נמצאות בתוך הקריטריונים שהוגדרו, תן להפעלה של איסוף הנתונים להמשיך ולהשלים. אם רק חלק קטן מאוד מהתמונות שנרכשו עומדות בקריטריונים שנקבעו, הגדר מחדש את הגדרות תוכנת הניתוח, עבור לאזור אחר במדגם (לחץ על לחצן ריבוע הרשת הבא בתוכנת הניתוח), או הפסק את איסוף הנתונים.

תוצאות

פורטל ניהול הנתונים מספק אחסון יעיל ומובנה של תמונות, נתונים ומטא-נתונים שנאספו מזרימות עבודה ניסיוניות מרובות בפלטפורמת תוכנה אחת. כל ניסוי מוגדר בפרויקט שנוצר מורכב מזרימת עבודה עם שלבים המוגדרים על-ידי הלקוח כדי ללכוד מידע לדוגמה, נתונים שנאספו ומטא-נתונים קשורים ללא כל אילוצים כדי לספק גמישות ושימושיות מרביות עבור כל הניסויים האפשריים וכל מקרי השימוש (איור 1, איור 2). לפורטל ניהול הנתונים יש גם פונקציונליות של הערות מעבדה כדי להמחיש את שלבי זרימת העבודה, כולל עיבוד תמונה עם תוצאות ביניים, שניתן לשייך את כולם יחד לפרויקט ולספק רשומה מלאה ככל האפשר לניתוח ויצירת דוחות ופרסומים.

איור 1: דוגמה לארגון אפשרי של נתונים ומטא-נתונים בפלטפורמת ניהול הנתונים. כל פרויקט יכול לכלול מספר ניסויים, כגון cryo-EM או ספקטרוסקופיית מסה (viz. פרוטוקול שלב 2.3). כל ניסוי יכול לכלול זרימות עבודה מרובות המוגדרות על-ידי המשתמש (viz. פרוטוקול שלב 2.5), שכל אחת מהן מורכבת ממספר שלבים הניתנים להגדרה (viz. שלב פרוטוקול 2.7). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תצוגה בזרימת עבודה של פרוייקט שנפתחה בפלטפורמת ניהול הנתונים. האיור מציג מטה-נתונים והערות משויכים לשלב שנפתח בזרימת העבודה. הסרגל השמאלי עם הסמלים מספק גישה מהירה לאפשרויות ולתפריטים שונים של פלטפורמת ניהול הנתונים. החלונית השמאלית כוללת רשימה של זרימות עבודה שמורות (מוצגות רק זרימת עבודה שמורה אחת "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") וכפתור כחול להוספת זרימת עבודה חדשה. החלונית המרכזית מציגה שלבים בודדים בזרימת העבודה שנפתחה, כפי שמוצג עבור זרימת העבודה של SPA כאן. הלחצן הכחול בפינה השמאלית העליונה יכול להוסיף שלב נוסף לזרימת העבודה שנפתחה. החלונית הימנית כוללת מקום עבור מטה-נתונים מוקלטים או הערות קלט-משתמש של זרימת העבודה, שעשויות לכלול טקסט, טבלאות ותמונות. אפשרויות עיצוב שונות עבור הטקסט זמינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

רשתות Cryo-EM המיוצרות עם התקנים מסורתיים להקפאת צלילה, כגון Vitrobot, יציגו בדרך כלל שיפוע של עובי הקרח על פני הרשת. רשתות מסוימות עלולות גם להינזק (כפופות) לאחר טיפול ידני ו/או חיתוך במנשא טבעת אוטוגריד. איור 3 מציג דוגמאות של רשתות שונות כפי שמוצגות בסקירה הכללית של Atlas. הרשתות עם קרח עבה או נזק צריכות להיות מודרות מחקירה נוספת.

איור 3: גלריה של רשתות שונות כפי שניתן לראות בסקירה הכללית של האטלס. (A) רשת גרועה עם קרח עבה, (B) רשת מכופפת עם זיהום קרח וקרח רע, (C) רשת מקובלת עם שיפוע קרח טוב, (D) רשת טיפוסית עם קרח דק טוב ושיפוע קרח קטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הבחירה בריבועי רשת ללא נזק ועובי קרח אופטימלי היא קריטית לאיסוף מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה. עובי הקרח עשוי להשתנות אפילו ברמה של ריבועי רשת בודדים, ולכן חשוב לבחור רק חורים עם קרח דק באופן אופטימלי מכל ריבוע רשת שנבחר. איור 4 מראה ריבוע רשת מתאים עם רדיד שלם וקרח דק במרכז. ריבוע הרשת המוצג טוב להגדרת מסנן לבחירה אוטומטית של חורים עם קרח דק בכל ריבועי הרשת שנבחרו מכיוון שהוא מכיל טווח של עובי קרח שונה כמו גם חורים ריקים ללא קרח, וזה מאוד שימושי לקביעת טווח עוצמה מתאים במסנן הקרח במשימת בחירת החור.

איור 4: ריבוע רשת לדוגמה עם שיפוע של עובי קרח, מריבועי רשת ריקים במרכז וקרח עבה ליד פסי הרשת. ניתן להשתמש במסנן של איכות הקרח כדי לבחור את טווח העוצמות בתוך חורים עם עובי הקרח האידיאלי שנבחר בהתאם בריבוע הרשת (החורים עם כיסוי ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות אמת המידה באמצעות הפרוטוקול המתואר התקבלו באמצעות דגימה של אפו-פריטין עכבר (apoF) מקבוצת Kikkawa¹¹. ApoF הוא חלבון α-סלילי מאוד שיוצר כלוב אוקטהדרלי יציב מאוד. היציבות הגבוהה והסימטריה הגבוהה הופכות את apoF לדגימה אופטימלית להדמיית cryo-EM ברזולוציה גבוהה ועיבוד תמונה. לפיכך, ApoF הפך לדוגמה סטנדרטית להערכת הביצועים של מכשירי cryo-EM 11,12,13. אליקווט קפוא המכיל דגימת apoF מטוהרת של 15 מ"ג/מ"ל הופשר על קרח והובהר על ידי צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות. הסופרנטנט מדולל ל-5 מ"ג/מ"ל עם 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl. 3 μL של הדגימה המדוללת הוחלה על R-1.2/1.3 עם פריקה זוהרת, 300 רשתות זהב רשת עבור 30 שניות. לאחר מכן הרשתות הוכתמו במשך 5 שניות לפני שצנחו לתוך אתאן נוזלי מקורר על ידי חנקן נוזלי. הקפאת צלילה בוצעה באמצעות מערכת ויטריפיקציה אוטומטית לחלוטין ב-100% לחות ו-4 מעלות צלזיוס. כל הרשתות נחתכו באוטוגרידים וטענו לתוך Cryo-TEM של 200 קילו-וולט. כ-3,000 סרטים נאספו בתפוקה של 300 סרטים בשעה. הנתונים עובדו באמצעות השיטות כמתואר¹¹ עם השינויים הבאים: i) גרסת Relion 4-beta שימשה במקום Relion 3.1, ii) איסוף חלקיקים אוטומטי נעשה באמצעות ממוצעים דו-ממדיים של שחזורי apoF קודמים כהפניות, ו-iii) המודל התלת-ממדי הראשוני נוצר משחזור ה-apoF הקודם שעבר ברזולוציה נמוכה לרזולוציה של 15-Å. קיבוץ אופטיקה לא נעשה עבור מערך נתונים זה מכיוון שהליך AFIS³⁴ המשומש הוכח כממזער ביעילות ובאמינות את שינויי הפאזה המושרים בהטיית קרן שאינם מגבילים את איכות הנתונים לשחזור מפות תלת-ממדיות ברזולוציות המדווחות. עידון תלת-ממדי לאחר ליטוש בייסיאני ועידון CTF הובילו למפת רזולוציה של 1.68 Å. הרזולוציה שופרה עוד יותר עם תיקון כדור Ewald וכתוצאה מכך נוצרה מפת רזולוציה של 1.63 Å. הסקירה הכללית של פרמטרי איסוף ועיבוד הנתונים מוצגת בטבלה 2, ומפת הצפיפות המשוחזרת הסופית מוצגת באיור 5, כאשר עקומת המתאם של מעטפת פורייה (FSC) מוצגת באיור משלים 8.

טבלה 2: פרמטרים של איסוף נתונים ועיבוד תמונה המשמשים לשחזור תלת-ממדי של אפו-פריטין. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור 5: שחזור Cryo-EM של apo-ferritin. (לוח שמאלי) עיבוד תלת-ממדי של מפת apoF cryo-EM המשוחזרת ברזולוציה של 1.6 Å. (לוח ימני) מבט מפורט על המפה המשוחזרת ברמה של שרשראות צד בודדות של חומצות אמינו. הצפיפות של חומצות אמינו נפתרת היטב, ואת המודל האטומי ניתן לבנות באופן חד משמעי בתוך מפה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ההשפעות והיתרונות של שימוש במסנן אנרגיה בשחזורי SPA הוערכו באמצעות הפרוטאזום הפרוקריוטי 20S שבודד מ - T. acidophilum. הפרוטאזום הפרוקריוטי 20S שימש גם כמדגם cryo-EM סטנדרטי מכיוון שהוא מייצג את הליבה הקטליטית היציבה של קומפלקס הפרוטאזומים עם הסימטריה D7. הרשתות הוכנו על ידי הוספת 4.5 μL של דגימת הפרוטאזום T. acidophilum 20S המטוהרת לרשת נחושת R 2/1 המשוחררת בזוהר. הדגימות הוטבעו בתערובת אתאן/פרופאן נוזלית באמצעות מערכת ויטריפיקציה אוטומטית לחלוטין שנקבעה ל-4 מעלות צלזיוס ו-100% לחות עם כוח כתם של 20 וזמן כתם של 4.5 שניות.

שלושה מערכי נתונים שונים נאספו מאותה רשת cryo-EM עם ריבועי רשת דומים באמצעות רוחב חריץ שונה של מסנן האנרגיה בסדר: i) חריץ פתוח לחלוטין (לא הוכנס חריץ), ii) 20 חריץ eV ו- iii) 10 eV חריץ. ריבועי הרשת נבחרו באמצעות מסנן איכות קרח בתוך תוכנת הניתוח. כל שאר הפרמטרים לאיסוף נתונים ועיבוד נתונים נשמרו זהים. מערכי הנתונים נאספו במשך 15 שעות עם סך של 4000 סרטים ועובדו בשיטות המתוארות¹¹ באמצעות Relion 3.1 עם השינוי שאלגוריתם בחירת החלקיקים של Laplacian-of-Gaussian שימש להפקת ממוצעים ראשוניים של מחלקה דו-ממדית עבור בחירת חלקיקים מבוססי ייחוס מתוך מערכי הנתונים המלאים. אותו מספר (102,200) של חלקיקים שנבחרו באקראי נבחר ושימש לאיטרציה הסופית ולשחזור התלת-ממדי של כל מערך נתונים. משתני עיבוד נתונים מתוארים בטבלה (טבלה 3) שלהלן כדי להשיג את מפת צפיפות EM המשוחזרת הסופית המוצגת באיור 6 עם עקומת FSC המוצגת באיור 9 המשלים. גם קיבוץ אופטיקה ותיקון כדור אוואלד לא נעשו עבור מערכי נתונים אלה.

טבלה 3: איסוף נתונים ופרמטרים של עיבוד תמונה המשמשים לשחזור תלת-ממדי של פרוטאזום T. acidophilum 20S. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: סיכום של רזולוציה שהושגה ופקטור B לשחזורי cryo-EM של פרוטאזום T. acidophilum 20S באמצעות מערכי נתונים עם רוחב חריץ אנרגיה שונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור 6: השפעת סינון אנרגיה על תמונות cryo-EM. (A) תמונות Cryo-EM בערכי defocus שונים שנאספו עם או בלי חריץ eV 10. (B) סקירה כללית של מפת ה-cryo-EM הפרוטאזומית של 20S עם יחידות משנה מפולחות. (C) תצוגת זום במפת הפרוטאזום 20S עם מודל אטומי מותאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: כיול משימת הזזת תמונה (אליפסה צהובה) כדי ליישר את מעברי התמונה בין הגדרות אופטיות מוגדרות מראש שונות (אליפסות אדומות) בתוכנת האנליזה, באמצעות גביש של קרח משושה הנראה בטווח ההגדלה המלא בין פי 100 ל-165,000x. (למעלה) כיול בין ההגדרות הקבועות מראש של רכישת נתונים ו-Hole/Eucentric Height, כיול (באמצע) בין ההגדרות הקבועות מראש של הגובה החור/יוצנטרי וריבוע הרשת, כיול (התחתון) בין הגדרות הקבועות מראש של ריבוע הרשת והאטלס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: פונקציית סטיגמה אוטומטית בתוכנת אנליזה (אליפסה צהובה). (תמונה שמאלית) תמונה נרכשת. (תמונה ימנית) העברת פורייה של התמונה הנרכשת המציגה טבעות תון קונצנטריות והתאמת ה- CTF שלהן המוצגת בקורות רדיאליות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ממשק משתמש של פונקציית Autocoma בתוכנת ניתוח (אליפסה צהובה) ליישור תרדמת. לוח התמונות מציג תמונות העברת פורייה שנרכשו בהטיית קרן שונות ואת התאמות ה- CTF שלהן המשמשות לחישוב התרדמת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: ממשק משתמש של כוונון מסנן אנרגיה. דוגמה לדוח כוונון טוב של איזוכרומטיות מסנן האנרגיה עם כל הפרמטרים (המוצגים בטקסט ירוק) בתוך מפרטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: ממשק משתמש של כוונון מסנן אנרגיה. דוגמה לדוח כוונון טוב של עיוותי ההגדלה של מסנן האנרגיה עם כל הפרמטרים (המוצגים בטקסט ירוק) בתוך מפרטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6: ממשק משתמש של כוונון מסנן אנרגיה. דוגמה לכוונון טוב של עיוותים כרומטיים של מסנן האנרגיה עם כל הפרמטרים (המוצגים בטקסט ירוק) בתוך מפרטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 7: פאנל DataViz של צג האיכות EPU עם סקירה כללית של איכות הנתונים במערך נתונים של cryo-EM שנאסף. הגרפים עם הנתונים המצטברים מכל התמונות/סרטים שנאספו מראים ערכים (עלילות נקודות) והתפלגות (עלילות עמודות) של מדדי איכות קריטיים נבחרים, כגון ביטחון ההתאמה של CTF (כחול), defocus (כתום) ואסטיגמציה (ירוק). ניתן לבחור קבוצת משנה של התמונות/סרטים שנאספו על-ידי הגדרת מסנני פרמטרים בחלק העליון של החלונית DataViz. לאחר החלת המסננים, ניתן לייצא תמונות/סרטים נבחרים לעיבוד נוסף בחבילת עיבוד תמונה אחרת, כגון Relion או CryoSpark. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 8: עקומת FSC של השחזור הסופי של רזולוציית apoF לרזולוציה של 1.6 Å, כפי שדווח על ידי Relion 4-beta. העקומה הכחולה מציגה את ה-FSC של מפות תלת-ממדיות מוסוות משני שחזורים תלת-ממדיים מעודנים באופן עצמאי משני מערכי נתונים למחצה בלעדיים זה לזה. על פי תקן הזהב FSC ב-0.143, הרזולוציה של המפה התלת-ממדית הסופית ששוחזרה ממערך הנתונים המלא מתאימה ל-1.6 Å. העקומה הכתומה מציגה את ה- FSC של השחזורים התלת-ממדיים במסכה עם שלבים אקראיים. הירידה המהירה של עקומת FSC מצביעה על כך שהמסכה המשומשת לא תרמה ל-FSC הנצפה של המפות המשוחזרות המקוריות (עקומה כחולה) מעבר לרזולוציה של ~2 Å. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 9: עקומות FSC של השחזור הסופי של פרוטאזום T. acidophilum 20S באמצעות רוחבי חריץ שונים של מסנן האנרגיה, כפי שדווח על ידי Relion 3.1. העקומות הכחולות מציגות את ה- FSC של מפות תלת-ממדיות מוסוות משני שחזורים מעודנים באופן עצמאי משני מערכי נתונים למחצה של כל מערך נתונים, בהתאמה. תקן הזהב FSC ב- 0.143 מציין את הרזולוציות שהושגו של המפות התלת-ממדיות הסופיות ששוחזרו ממערכי הנתונים המלאים המתאימים (רזולוציה של 2.3 Å, 2.2 Å ו- 2.1 Å, בהתאמה). העקומות האדומות מציגות את ה- FSC של מפות מוסוות עם פאזות אקראיות. הירידה המהירה של עקומות ה-FSC האדומות מצביעה על כך שהמסכה המשומשת לא תרמה ל-FSC של המפות המשוחזרות המקוריות מעבר לרזולוציה של ~3 Å. העקומות הירוקות מציגות את ה-FSC של מפות תלת-ממדיות ללא מסיכה, המושפעות מרעש בכל נפח התלת-ממד המשוחזר ולכן יורדות מוקדם יותר מה-FSC של מפות התלת-ממד המוסוכות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

זמינות הנתונים: מפות צפיפות cryo-EM הופקדו בבנק הנתונים EM תחת מספרי גישה: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. פרוטאזום 20S: EMD 14467, EMPIAR-10976.

דיון

הפרוטוקול המתואר מניח שהאופטיקה של מיקרוסקופ ה-TEM המשומש נמצאת במצב מיושר היטב. עבור 200 kV TEM המשמש בפרוטוקול זה, יישור עמודות כזה נעשה, מאומת ונשמר על ידי מהנדס שירות מנוסה לאחר התקנת מיקרוסקופ או כל התערבות משמעותית בשירות. ניתן להחזיר הגדרות יישור אלה בכל עת בממשק המשתמש של המיקרוסקופ. משתמשים יכולים להשתמש בהליכי היישור הישיר בממשק המשתמש של המיקרוסקופ כדי לשנות מחדש פרמטרים קריטיים. יישורים מסוימים, כגון הטיית אקדח והסטת אקדח, יציבים ואינם צריכים להיות מותאמים על ידי המשתמשים על בסיס יומי. בדיקות ויישורים מחדש (במידת הצורך) של הטיית האקדח והסטתו על ידי מפקח המיקרוסקופ מומלצים פעמיים בשנה. מצד שני, יישורים מסוימים הם קריטיים ויש ליישר אותם לפני כל איסוף נתונים כמתואר בפרוטוקול לעיל (כגון אסטיגמציה אובייקטיבית ויישור ללא תרדמת). אם פונקציית Autocoma בתוכנת הניתוח אינה מצליחה להתכנס, יש לאמת ולהתאים את היישור של נקודות ציר הטיית הקרן ו/או מרכז הסיבוב, ולאשר את המרכוז הנכון של מפתח הצמצם C2. לאחר מכן, יש להפעיל את פונקציית Autostigmate מכיוון שסטיגמטורים אובייקטיביים משמשים גם לתיקון תרדמת. יש ליישר את היישורים האלה עד שגם Autostigmate וגם Autocomafunctions יצליחו באיטרציה הראשונה שלהם. במידת הצורך, ניתן לבחור אזור אחר (לדוגמה, תמיכה ברדיד פחמן ללא קרח), התאמת דפוקוס בתמונה או הגדלת זמן רכישת התמונה כדי לייעל את יחס האות לרעש בתמונות שנרכשו, ואת הנראות של טבעות Thon מרובות בהמרת פורייה של התמונות שנרכשו.

מיקרוסקופים מודרניים של cryo-EM מייצרים כמויות עצומות של נתונים שלעתים קרובות עולות על 1 TB לכל ערכת נתונים כדי להשיג שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה, במיוחד עבור חלבונים עם סימטריה נמוכה. נתוני Cryo-EM ותוצאותיהם משלימים בדרך כלל גם נתונים ותוצאות משיטות אורתוגונליות כדי להבין באופן מלא את יחסי המבנה-פונקציה בכל פרויקט מדעי. ארגון הנתונים שנאספו, העברתם לצינור עיבוד תמונה ושיתוף שחזור cryo-EM שנוצר כתוצאה מכך בין משתפי פעולה מציבים דרישות נוספות על מאמצים חדשים של מתודולוגיית cryo-EM כדי להקים את תשתית ה- IT המקומית שלהם. תוכנות לניהול נתונים, כגון Athena, מאפשרות אחסון מרכזי של נתונים הנרכשים על-ידי כל מכשיר או תוכנה מחוברים המופעלים על-ידי משתמש רשום. נתונים ומטא-נתונים מאוחסנים נגישים באמצעות ממשק דפדפן אינטרנט פשוט על-ידי משתמשים מרובים, שיכולים להיות בעלי תפקידים שונים בפרויקט עם זכויות גישה שונות (כבעלים, כמשתף פעולה או כצופה) בהתבסס על אישורי הכניסה שלהם והגדרת שיתוף הנתונים שלהם בהגדרת הניסוי. דיגיטציה זו של זרימות עבודה ניסיוניות מספקת אמצעים לשיתוף נתונים ומטא-נתונים בין משתפי פעולה ללא כפילויות מיותרות ומגבירה את הפרודוקטיביות ואת יכולת העקיבות של זרימות עבודה משומשות. יישום מבנה כללי וניתן להתאמה אישית של פרויקטים, ניסויים וזרימות עבודה בתוכנת ניהול נתונים הוא אוניברסלי ומאפשר התאמה אישית ושילוב של ניסויים אורתוגונליים בשיטות משלימות למסד נתונים של פרויקט יחיד.

בחירת האזורים לאיסוף הנתונים ברשת cryo-EM היא קריטית לרכישה מוצלחת של מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה. רשתות Cryo-EM המיוצרות עם התקנים מסורתיים להקפאת צלילה, כגון Vitrobot (מערכת ויטריפיקציה אוטומטית לחלוטין), יציגו בדרך כלל שיפוע של עובי קרח על פני השטח של הרשת (איור 4). זה עשוי להועיל מכיוון שהרשת מכילה אזורים עם עובי קרח שונה; עם זאת, אזורים עם עובי הקרח האידיאלי לאיסוף נתונים חייבים להיות מזוהים כמתואר בפרוטוקול לעיל. רשת cryo-EM אופטימלית צריכה להכיל כמה שפחות זיהום קרח העברה ולהכיל מספיק ריבועי רשת עם רדיד תומך חורי שלם. איסוף נתונים על ריבועי רשת עם סדקים או אזורים שבורים אינו מומלץ מכיוון שתמונות שנאספו יושפעו מסחף כולל חזק יותר באופן משמעותי עם תאורה על ידי קרן אלקטרונים בהשוואה לריבועי הרשת עם רדיד תמיכה שלם. עודף של קרח גבישי יכול לחסום את רוב חורי רדיד האלומיניום ו/או להפריע למיקוד אוטומטי ויש להימנע גם מריבועי רשת כאלה. ריבועי רשת עם קרח דק מציגים בדרך כלל אזורים זגוגיים גדולים וחורי רדיד בהירים רבים הנראים לעין בתמונה שצולמה באמצעות הגדרת האטלס המוגדרת מראש. יש לצפות באופן צפוי ולא ביקורתי את הופעתו של קרח עבה יותר בקרבת פסי רשת, שכן חורי רדיד באזורים אלה של ריבוע הרשת אינם נכללים במהלך הליך בחירת החורים. הימצאותם של מספר חורים ריקים בריבוע רשת עשויה להצביע על כך שהקרח הזגוגי בחורים שמסביב הוא דק ביותר ועשוי להכיל חלקיקים פגומים או ללא חלקיקים כלל. באופן כללי, כדאי לבחור ריבועי רשת עם מגוון עוביי קרח באזורים שונים ברשת לצורך סינון והערכה ראשוניים כדי להבין באילו אזורים יש את התנאים הטובים ביותר לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה ולהציג את צפיפות החלקיקים האידיאלית ואת התפלגות הכיוון. עבור דגימות הפרוטאזום apoF ו-20S ששימשו במחקר זה, אזורים עם הקרח הדק ביותר שניתן לצפות בו מכילים את התנאים הטובים ביותר להדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות אלה.

בעת בחירת חורים באופן אוטומטי בכל ריבועי הרשת שנבחרו באמצעות תוכנת איסוף הנתונים, מומלץ לבצע את משימת ביצוע התבנית על חור מייצג בכל ריבוע רשת כדי לבדוק ולוודא שלא נבחרו ריבועים עבים מדי או דקים מדי או לא זגוגיים באופן בלתי צפוי לאיסוף נתונים. במהלך רכישת נתונים, ניתן לנטר מחווני איכות מרכזיים של תמונות שנאספו, כגון סחף תמונה והתאמת CTF, באמצעות EQM. לאחר מכן ניתן לייעל את איסוף הנתונים על ידי דילוג על אזורים שמניבים תמונות באיכות ירודה. עם זאת, תמונות עם התאמות CTF ברזולוציה גבוהה עדיין יכולות להכיל תמונות עם חלקיקים בכמה כיוונים מועדפים או חלקיקים שעברו דנטורציה בשכבת קרח דקה מדי. איסוף חלקיקים בזמן אמת וסיווג דו-ממדי מתמונות שנאספו יספקו מידע נוסף על איכות הנתונים המבניים בחלקיקים שצולמו ויחשפו הן את הכיוונים המועדפים של חלקיקים שלמים בקרח והן את המבנה הלא עקבי של חלקיקים שעברו דנטורציה (חלקית). חישוב ממוצעי המחלקות יכול אפוא לסייע בשכלול נוסף של אזורים מתאימים לאיסוף נתונים, כפי שכבר יושם והוצג בחבילות תוכנה אחרות ^23,28.

בחירת הגדרות ההדמיה לאיסוף נתונים, כגון הגדלה, קצב מינון אלקטרונים וטווח ההפחתה, תלויה במספר קריטריונים, כגון רזולוציית המטרה, גודל החלבון, ריכוז הדגימה, תפוקת המיקרוסקופ הרצויה וכו '. עבור מצלמת גלאי האלקטרונים הישירה ששימשה בניסויים אלה, קצב מינון האלקטרונים נבחר בטווח של 4-5 e^-/pix/s על ידי בחירת גודל ועוצמה מתאימים של SPOT כדי לשמור על תאורה מקבילה. כפי שמוצג בטבלה 1, ניתן להשתמש בגודל SPOT שונה בקביעה המוגדרת מראש של Hole/Eucentric Height כדי להבטיח יחס אות לרעש מספיק בתמונה לצורך מרכוז חורים במהלך איסוף הנתונים. יש לבחור את ההגדלה כך שגודל הפיקסלים יהיה קטן פי 2-3 לפחות מרזולוציית היעד לשחזור cryo-EM. עם זאת, ככל שנעשה שימוש בהגדלה גבוהה יותר (כלומר, גודל פיקסל קטן יותר), שדה הראייה הקטן יותר נלכד בתמונות, ויש פחות חלקיקים לכל תמונה, מה שמוביל בסופו של דבר לזמן איסוף נתונים ארוך יותר כדי לאסוף תמונות עם מספיק חלקיקים כדי לשחזר מפות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה. עבור דגימת ה-apoF, השתמשנו בגודל הפיקסלים של 0.43 Å מכיוון שהיה לנו ריכוז דגימה מספיק עבור צפיפות גבוהה של חלקיקים בתמונות וכיווננו רזולוציה תת-2 Å של השחזור. עבור מדגם פרוטאזום 20S, השתמשנו בגודל הפיקסל של 0.68 Å כדי לכסות שדה ראייה גדול יותר בתמונות שנרכשו. בדרך כלל עבור מיקרוסקופי TEM של 200 קילו-וולט, תמונות cryo-EM נרכשות בטווח ה-defocus בין 0.8 ל-2.0 מיקרומטר. עם זאת, עם הניגודיות המשופרת ויחס האות לרעש באמצעות מסנן האנרגיה, ניתן לבצע רכישות נתונים הרבה יותר קרובות למיקוד כדי לשמר טוב יותר מידע ברזולוציה גבוהה בתמונות שנרכשו עקב סטיות קטנות יותר ודעיכה מופחתת בהתאם של פונקציית מעטפת ה- CTF. כמו כן, איננו משתמשים במפתח צמצם אובייקטיבי מכיוון שהמפתח עשוי להציג סטיות תמונה נוספות בעוד שניגודיות התמונה כבר משופרת מספיק על ידי שימוש במסנן האנרגיה. עבור דגימות פרוטאזום apoF ו-20S, השתמשנו בהגדרות ה-defocus של 0.5 מיקרומטר, 0.7μm ו-0.9 מיקרומטר. עבור חלבונים קטנים יותר (<200 kDa), השתמשנו בהגדרות דפוקוס של -0.5 מיקרומטר, -0.7 מיקרומטר ו--0.9 מיקרומטר-כדי לשפר את הניגודיות של חלקיקים ולאפשר בחירת חלקיקים קלה יותר ויישור גס ראשוני בשלב העידון התלת-ממדי של שחזור תלת-ממדי, שהוביל למפות תלת-ממדיות ברזולוציה של ~2.5 Å (תוצאות שלא פורסמו).

כבר הראינו שהדמיה עם מסנן אנרגיה משפרת את יחס האות לרעש (SNR) בתמונות cryo-EM שנאספו במיקרוסקופים המתקדמים של 300 קילו וולט TEM¹¹. למעשה, כאשר אלקטרונים עוברים דרך דגימה, מתרחשים שני סוגים עיקריים של אינטראקציות: 1) אלקטרונים המפוזרים באופן אלסטי שומרים על האנרגיה שלהם ותורמים להיווצרות התמונה על ידי הפרעה לקרן האירוע שאינה מפוזרת באמצעות מנגנון ניגודיות הפאזה ii) אלקטרונים המפוזרים באופן לא אלסטי מאבדים אנרגיה מסוימת בדגימה ותורמים בעיקר לרעש בתמונות. לכן, SNR יכול להשתפר באופן משמעותי על ידי סינון האלקטרונים המפוזרים באופן לא אלסטי, בעלי אנרגיה נמוכה יותר מקרן האירוע ואלקטרונים המפוזרים באופן אלסטי, באמצעות חריץ אנרגיה צר. עם זאת, זה קריטי להשתמש במסנן אנרגיה יציב מספיק, כגון Selectris או Selectris-X, כדי להיות מסוגל להשתמש בחריצים צרים מאוד (10 eV או קטנים יותר) על פני רכישת נתונים אוטומטית ארוכה (12+ שעות) של מערכי נתונים cryoEM ברזולוציה גבוהה.

תמונות Cryo-EM שנרכשו עם מיקרוסקופי TEM של 200 kV באותם תנאים כמו במיקרוסקופים של 300 kV TEM מציגים SNR קטן יותר ברזולוציה גבוהה (במיוחד <4 Å) עקב דעיכה מהירה יותר של פונקציות מעטפת ה- CTF. כתוצאה מכך, מספר גבוה יותר של חלקיקים (ולכן מספר גבוה יותר של תמונות שנאספו) נדרש כדי להשיג רזולוציה מסוימת בעת שימוש ב- 200 kV TEMs. בנוסף, עומק השדה (10-25 ננומטר בטווח הרזולוציה של 2-3 Å) קטן בכ-20% גם בתמונות³⁵ של 200 קילו-וולט, כלומר פחות חלקיקים בשכבת הקרח (בדרך כלל בעובי של 20-50 ננומטר) יהיו בפוקוס מלא ויתרמו באופן קונסטרוקטיבי לכל התכונות ברזולוציה גבוהה של שחזור תלת-ממדי מחושב, אלא אם כן ערכי ההדחה מעודנים עבור כל חלקיק באופן עצמאי בשלבים המאוחרים יותר של הליך השחזור התלת-ממדי. עבור חלקיקים גדולים יותר (כגון virions icosahedral או מכלולים מקרומולקולריים אחרים), גודל החלקיקים עשוי לחרוג מעומק השדה ברזולוציות גבוהות ולהציג שגיאות פאזה עקב קירוב מישורי של כדור Ewald באלגוריתמים הסטנדרטיים לשחזור תלת-ממדי³⁶. שגיאות אלה ניתנות לשכלול על ידי אלגוריתמים מתקדמים שכבר מיושמים בחבילות עיבוד תמונה נפוצות של cryo-EM 37,28,39. מכיוון שלכדור אוואלד יש עקמומיות גדולה יותר בנתוני 200 קילו-וולט מאשר לנתונים של 300 קילו-וולט, יש צורך בתיקון כדור אוואלד ברזולוציות נמוכות יחסית ו/או עבור מכלולים מקרומולקולריים קטנים יחסית בעת שימוש ב-TEMs של 200 קילו-וולט. מצד שני, תמונות של 200 קילו-וולט מציגות ניגודיות גבוהה יותר של חלקיקים בקרח דק (20-50 ננומטר) שהוא דק משמעותית מהנתיב החופשי הממוצע של 200-300 keV אלקטרון (220-280 ננומטר). הניגודיות הגבוהה יותר מסייעת לשפר את היישור הגלובלי הנכון של חלקיקים בודדים, במיוחד עבור חלבונים קטנים בעלי פיזור חלש שהמבנה שלהם עדיין לא ידוע, ומודל הייחוס התלת-ממדי עדיין לא מבוסס היטב.

כאן, הדגמנו בדוגמה של פרוטאזום 20S שניתן לשפר את הניגודיות והאיכות של התמונה באופן דומה עם מסנן אנרגיה בעת שימוש במיקרוסקופ TEM של 200 קילו-וולט. באמצעות אותו מספר חלקיקים, נתונים שנאספו באמצעות חריץ 20 eV שוחזרו לרזולוציה של 2.26 Å בהשוואה לנתונים שנאספו עם חריץ האנרגיה שנפתח במלואו וששוחזר רק לרזולוציה של 2.34 Å. השחזור הטוב ביותר הושג מנתונים שנאספו באמצעות חריץ 10 eV ששוחזר לרזולוציה של 2.14 Å. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם התחזית התיאורטית שלפיה סינון האלקטרונים המפוזרים באופן לא אלסטי מגדיל את ה-SNR בתמונות שנאספו ומאפשר רזולוציה גבוהה יותר בשחזורי cryo-EM ממספר החלקיקים הנתון, כפי שמסוכם בטבלה 4. תוצאות אלה אושרו עוד יותר על-ידי גורמי B שחושבו ממערכי נתונים אלה המצביעים על איכות גבוהה יותר של תמונות בערכות הנתונים המסוננות באנרגיה.

לפיכך, אנו יכולים להסיק כי בעוד מיקרוסקופי TEM של 300 kV מספקים את התפוקה הגבוהה ביותר ואת הרזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית בשחזורי cryo-EM, המיקרוסקופים של 200 kV TEM מספקים גם מערכי נתונים באיכות גבוהה לשחזורי cryo-EM ברזולוציה גבוהה. הראינו כאן כי ניתן לשפר עוד יותר את איכות התמונות שנרכשו, ולכן את הזמן הכולל למבנה, על ידי שימוש ב-200 kV TEM המצויד במסנן אנרגיה ובגלאי אלקטרונים ישיר. הפרוטוקול המוצג מתאר את כל השלבים הדרושים כיצד להשיג באופן שגרתי נתוני cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות הגדרה זו ולחשוף פרטים מבניים עדינים של מבנים תלת-ממדיים מקרומולקולריים, החיוניים להבנת יחסי מבנה-פונקציה מרכזיים בביולוגיה מבנית ובתכנון תרופות מבוססות מבנה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טבעות AutoGrid חבילת	Thermo Fisher Scientific	1036173	של טבעות AutoGrid 100x עבור רשתות EM סטנדרטיות.
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	חבילה של 100 קליפסים המאבטחים את רשתות ה-EM הסטנדרטיות בתוך טבעות AutoGrid.
פלטפורמת ניהול נתונים	Thermo Fisher Scientific	1160939	חלק מתצורת הבסיס של Glacios; כולל Athena Software
EPU Quality Monitor	Thermo Fisher Scientific	1179770
EPU Software	Thermo Fisher Scientific	1025080	חלק מתצורת הבסיס של Glacios
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	גז אתאן המשמש לייצור אתאן נוזלי (טהור לפחות N35, כלומר 99.95% נפח)
Falcon 4 200kV	Thermo Fisher Scientific	1166936	גלאי אלקטרונים ישיר
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids ושינוי פני השטח	Quorum	N/A	זמין גם דרך Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
רשתות QuantiFoil	Quantifoil	N / A	R-2/1, 300 רשת; רשת רדיד פחמן
Relion	MRC המעבדה לביולוגיה מולקולרית	N / A	תוכנת קוד פתוח: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon 4 עבור 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191753	מסנן אנרגיה
Selectris X עם Falcon 4 עבור 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191755	מסנן אנרגיה
UltrAuFoil רשתות	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, 300 רשת; רשתות רדיד זהב
Vitrobot Mk. IV	Thermo Fisher Scientific	1086439	מערכת זיגוג אוטומטית
Whatman 595 נייר סינון Thermo	Fisher Scientific	AA00420S