מיקרו-דיסקציה של שכבה של עלוני שסתומים טריקוספידיים לאפיון מכני דו-אקסיאלי וכימות מיקרו-סטרוקטורלי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את האפיון המכני הדו-אקסיאלי, כימות קולגן מבוסס הדמיה של תחום תדרים מרחביים מקוטבים, ומיקרו-הבחנה של עלוני מסתמים טריקוספידיים. השיטה שסופקה מבהירה כיצד שכבות העלון תורמות להתנהגויות העלון ההוליסטיות.

תקציר

המסתם הטריקוספידי (טלוויזיה) מווסת את הזרימה החד-כיוונית של דם לא מחומצן מהאטריום הימני לחדר הימני. הטלוויזיה מורכבת משלושה עלונים, כל אחד עם התנהגויות מכניות ייחודיות. ניתן להבין עוד יותר את הווריאציות הללו בין שלושת עלוני הטלוויזיה על ידי בחינת ארבע השכבות האנטומיות שלהם, שהן האטריאליס (A), ספונגיוסה (S), פיברוסה (F) וחדרים (V). בעוד ששכבות אלה נמצאות בכל שלושת עלוני הטלוויזיה, ישנם הבדלים בעוביים שלהם ובמרכיבים המיקרו-סטרוקטורליים שלהם המשפיעים עוד יותר על ההתנהגויות המכניות שלהם.

פרוטוקול זה כולל ארבעה שלבים כדי להבהיר את ההבדלים הספציפיים לשכבה: (i) לאפיין את ההתנהגויות האדריכליות המכניות וסיבי הקולגן של עלון הטלוויזיה השלם, (ii) להפריד את השכבות המורכבות (A/S ו-F/V) של עלון הטלוויזיה, (iii) לבצע את אותם אפיונים עבור השכבות המורכבות, ו-(iv) לבצע פוסט-הוק הערכה היסטולוגית. מסגרת ניסיונית זו מאפשרת באופן ייחודי השוואה ישירה של רקמת הטלוויזיה השלמה לכל אחת מהשכבות המורכבות שלה. כתוצאה מכך, ניתן לאסוף מידע מפורט לגבי המיקרו-מבנה והתפקוד הביו-מכני של עלוני הטלוויזיה באמצעות פרוטוקול זה. מידע כזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי לפיתוח מודלים חישוביים טלוויזיוניים המבקשים לספק הדרכה לטיפול הקליני במחלת הטלוויזיה.

מבוא

הטלוויזיה ממוקמת בין האטריום הימני לחדר הימני של הלב. לאורך כל מחזור הלב, הטלוויזיה מווסתת את זרימת הדם החד-כיוונית באמצעות פתיחה וסגירה מחזורית של העלון הקדמי של הטלוויזיה (TVAL), העלון האחורי של הטלוויזיה (TVPL) ועלון המחיצה של הטלוויזיה (TVSL). עלונים אלה מורכבים וכוללים ארבע שכבות אנטומיות נפרדות – האטריאליס (A), הספונגיוסה (S), הפיברוסה (F) והחדר (V) – עם מרכיבים מיקרו-סטרוקטורליים ייחודיים. סיבי האלסטין באטריאליס ובחדרים מסייעים להחזיר את הרקמה לגיאומטריה הלא מעוותת שלה לאחר העמסה מכנית¹. לעומת זאת, הפיברוסה מכילה רשת צפופה של סיבי קולגן גליים התורמים ליכולת נשיאת העומס של העלונים². הספונטיוסה, המורכבת בעיקר מגליקוזאמינוגליקנים, הושער כי היא מאפשרת גזירה בין שכבות העלון במהלך תפקוד מסתם הלב³. בעוד שלכל שלושת סוגי העלונים יש את אותן שכבות אנטומיות, ישנן וריאציות בעובי השכבות וביחסים המרכיבים שיש להן השלכות על התנהגויות מכניות ספציפיות לעלון.

חוקרים חקרו את התכונות של עלוני הטלוויזיה באמצעות אפיונים מכניים מישוריים, הערכות היסטומורפיולוגיות ואפיונים אופטיים של ארכיטקטורת סיבי הקולגן. לדוגמה, אפיונים מכניים דו-אקסיאליים מישוריים מבקשים לחקות את ההעמסה הפיזיולוגית על ידי החלת תזוזות ניצבות על הרקמה ורישום הכוחות הקשורים. התצפיות שהתקבלו על תזוזת כוח (או מתח-מתיחה) גילו כי כל שלושת עלוני הטלוויזיה מפגינים התנהגויות מכניות לא ליניאריות וספציפיות לכיוון עם תגובות ספציפיות יותר לעלון בכיוון הרקמה הרדיאלית ^4,5,6. מאמינים כי התנהגויות ספציפיות לכרוזים אלה נובעות מהבדלים בתכונות המיקרו-סטרוקטורליות שנצפו באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות ^6,7. יתר על כן, הדמיית דור הרמוני שני⁶, פיזור אור בזווית קטנה⁸, והדמיית תחום תדרים מרחביים^{מקוטבים 7} (pSFDI) שואפים להבין את התכונות המיקרו-סטרוקטורליות הללו והראו הבדלים ספציפיים לעלון בכיוון סיבי הקולגן ובקימפ הסיבים שיש להם השלכות על ההתנהגויות המכניות שנצפו ברמת הרקמה. מחקרים אלה קידמו באופן משמעותי את הבנתנו את המיקרו-מבנה של הרקמות ואת תפקידו בהתנהגויות ברמת הרקמה. עם זאת, הרבה נותר לטפל בחיבור ניסיוני בין מכניקת הרקמות לבין המיקרו-מבנה הבסיסי.

לאחרונה, מעבדה זו ביצעה אפיונים מכניים של שכבות עלון הטלוויזיה המופרדות לשתי שכבות מרוכבות (A/S ו-F/V) באמצעות טכניקת מיקרו-דיסקציה⁹. עבודה קודמת זו הדגישה הבדלים בתכונות המכניות של השכבות ועזרה לספק תובנה כיצד המיקרו-מבנה השכבתי תורם להתנהגויות המכניות של הרקמה. למרות שחקירה זו שיפרה את הבנתנו את המיקרו-מבנה של עלון הטלוויזיה, לטכניקה היו מספר מגבלות. ראשית, התכונות של השכבות המורכבות לא הושוו ישירות לרקמה השלמה, מה שהוביל לחוסר הבנה מלאה של יחסי המכניקה-מיקרו-מבנה. שנית, ארכיטקטורת סיבי הקולגן של השכבות המורכבות לא נבדקה. שלישית, רק השכבות של ה-TVAL נחקרו בשל קשיים באיסוף השכבות המורכבות משני עלוני הטלוויזיה האחרים. השיטה המתוארת כאן מספקת מסגרת אפיון הוליסטית המתגברת על מגבלות אלה ומספקת אפיונים מלאים של עלוני הטלוויזיה והשכבות המורכבות שלהם.

מאמר זה מתאר את טכניקת המיקרו-דיסקציה המפרידה בין שלושת עלוני הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלהם (A/S ו-F/V) עבור אפיונים מכניים דו-אקסיאליים ומיקרו-סטרוקטורליים 10,11,12. פרוטוקול איטרטיבי זה כולל (i) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של העלון השלם, (ii) טכניקת מיקרו-דיסקציה חדשנית וניתנת לשחזור כדי להשיג באופן אמין את שכבות הטלוויזיה המורכבות, ו-(iii) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של שכבות הטלוויזיה המורכבות. הרקמה נחשפה להעמסה דו-אקסיאלית של מתיחה עם יחסי כוח שונים לבדיקה מכנית. לאחר מכן, pSFDI שימש לקביעת הכיוון והיישור של סיבי הקולגן בתצורות טעונות שונות. pSFDI משמר את ארכיטקטורת סיבי הקולגן המקומית, מאפשר ניתוח תלוי עומס, ועוקף את הצורך האופייני לתקן או לנקות רקמה לניתוח ארכיטקטורת סיבי קולגן, כגון בהדמיית דור הרמוני שני או פיזור אור בזווית קטנה. לבסוף, הרקמות הוכנו באמצעות טכניקות היסטולוגיה סטנדרטיות כדי לדמיין את המיקרו-מבנה של הרקמה. מסגרת איטרטיבית והוליסטית זו מאפשרת השוואה ישירה של התכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות של עלון הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלו.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוקלהומה. רקמות בעלי חיים נרכשו מבית מטבחיים שאושר על ידי USDA.

1. אפיון מכני דו-אקסיאלי

1. הכנת רקמות
   1. שלפו עלון טלוויזיה מהמקפיא, סכיני גילוח, עט כירורגי, מלקחיים, פיפטה עם מים שעברו דה-יוניזציה (DI) ומשטח חיתוך. להפשיר את עלון הטלוויזיה באמצעות 2-3 טיפות של מי DI בטמפרטורת החדר.
      הערה: נעשה שימוש במי DI במקום במי מלח עם חיץ פוספט (PBS) כדי למנוע קשיים הנגרמים על-ידי PBS עבור המיקרו-דיסקציה של השכבה.
   2. הניחו את הדגימה שטוחה על משטח החיתוך כאשר שכבת החדר (כלומר, המשטח עם תוספות הכורדה) פונה כלפי מעלה. מקם את הדגימה כך שהכיוון הרדיאלי יתיישר עם כיוון ה-Y והכיוון ההיקפי יתיישר עם כיוון ה-X.
      הערה: כיוון ההיקף מכוון לאורך היקף השסתום.
   3. בחנו את מיקומי ההחדרה של הכורדה של הרקמה. קבעו שטח, באופן אידיאלי בגודל של כ-12 על 12 מ"מ, עם הכמות הנמוכה ביותר של תוספות צ'ורדה גדולות תוך הימנעות מאזורים דקים במיוחד (כלומר שקופים) (איור 1).
   4. הפוך את הדגימה כך שמשטח הפרוזדורים (כלומר, המשטח ללא תוספות של צ'ורדה) פונה כלפי מעלה. ודא שכיווני העלון ההיקפיים והרדיאליים נשארים מיושרים עם צירי X ו-Y, בהתאמה.
   5. חותכים דגימה מרובעת של 12 x 12 מ"מ מרקמת העלון, כדי למנוע את ההחדרות הגדולות של הכורדה או את האזורים הדקים שזוהו בשלב 1.1.3. מוציאים את החלקים הגזומים של רקמת העלון עם המלקחיים ומניחים אותם במיכל פסולת.
      1. אם לא ניתן להימנע לחלוטין מהכנסות צ'ורדה גדולות, חותכים את הרקמות כך שהן נמצאות לאורך קצה הדגימה המרובעת. חשוב להימנע מהכנסות של צ'ורדה מכיוון שהוא מסייע במניעת בעיות עבור המיקרו-דיסקציה המאוחרת יותר.
   6. השתמש בעט כירורגי כדי למקם נקודה קטנה בפינה הימנית העליונה כדי לעקוב אחר כיוון הדגימה. אפשרו לדיו להתייבש במשך כ-30 שניות.
   7. הפוך את הדגימה כאשר המשטח החדרי (כלומר, המשטח עם תוספות אקורדים) פונה כלפי מעלה. חותכים את חיבורי האקורדים בגב הרקמה על ידי מתיחת המיתר מהעלון ושימוש בסכין גילוח כדי לחתוך סמוך למיקום ההחדרה שלו. הפוך שוב את הדגימה כך שמשטח הפרוזדורים (כלומר, המשטח החלק) פונה כלפי מעלה.
2. מדידת עובי
   1. שלף חיישן תזוזת לייזר לא תואם. אפס את חיישן התזוזה על קטע שטוח של מחצלת החיתוך ליד הרקמה הגזומה.
      אזהרה: אין להאיר את הלייזר ישירות לתוך העיניים.
   2. מקם את הלייזר מעל האזור המרכזי של הדגימה. הסר את האוויר הכלוא מתחת למשטח העלון מכיוון שהוא עלול לגרום לשגיאות מדידה. כדי לשחרר אוויר כלוא, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את הבועה לקצה הרקמה או הרימו פינה אחת של הרקמה.
   3. תעד את העובי המוצג בתצוגת חיישן התזוזה. חזור על שתי מדידות נוספות במיקומים אחרים של הדגימה.
   4. חישבו את עובי העלון הממוצע באמצעות שלוש המדידות שנרשמו בשלב הקודם. השתמש בערך זה בעת יצירת פרוטוקולי האפיון המכני הדו-אקסיאליים.
3. הגדרת בודק דו-אקסיאלי והרכבת רקמות
   1. הכינו אמבט מים DI בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להנחיות מערכת הבדיקה, כדי להבטיח את הטמפרטורה בתנאים פיזיולוגיים in vivo .
   2. מלקח מלקחיים, דגימת הרקמה, חומרת הרכבה, כלי בעל קצה דק, דבק ציאנואקרילט נוזלי וחרוזי זכוכית צבועים בשחור (קוטר: 300-500 מיקרומטר).
      הערה: חומרת ההרכבה כוללת את הטינים, את גשר ההרכבה ואת גומי ההרכבה.
   3. הר את דגימת הרקמה למערכת הבדיקה. ודא שהכיוון ההיקפי של הרקמה מתיישר עם כיוון ה-X, שניתן להיעזר בנקודה שהונחה קודם לכן בשלב 1.1.6.
      הערה: הטינים המשמשים כאן צריכים להיות מרווחים באופן שווה על פני כל אורך קצה הרקמה. אורך הקצה האפקטיבי מוגדר להיות 10 מ"מ עבור הרקמה השלמה ו->3.3 מ"מ עבור השכבות המורכבות.
4. מיקום סמן פידוקיאלי
   1. זהה את האזור הריבועי המרכזי של שליש מהרקמה המותקנת. השתמש בפינות המשוערות של אזור זה למיקום הסמן הפידוקיאלי.
   2. מניחים חרוזי זכוכית בסירת שקילה פתוחה ויוצרים בריכה קטנה של דבק ציאנואקרילט נוזלי בסירת שקילה נפרדת. מצפים את החלק העליון של הכלי בעל הקצה העדין בכמות קטנה של דבק. דאב עודף דבק בצד סירת השקילה.
   3. צרו פינה אחת של המערך המרכזי של שליש ריבועים על ידי לחיצה עדינה על הקצה המצופה בדבק על הרקמה. בעזרת מלקחיים, קחו חרוז זכוכית והניחו אותו בזהירות על גבי נקודת הדבק. השתמש במצלמה של מכשיר הבדיקה הדו-אקסיאלי לקבלת עזרה במיקום החרוזים.
   4. חזור על שלבים 1.4.2 ו- 1.4.3 עבור שלושה חרוזים נוספים עד להשלמת המערך המרובע. ודאו שהחרוזים מחוברים היטב, ונקודות הדבק המתאימות שלהם אינן נוגעות זו בזו או נדבקות זו לזו. מייבשים את הדבק לפני הורדת הרקמה לאמבטיית המים.
      1. אם החרוזים דבוקים זה לזה, המתן עד שהדבק יתייבש, ואז השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החרוז או הדבק ולמשוך אותו מהרקמה.
         הערה: הדבק והחרוזים צריכים לרדת, ולאפשר למקם מחדש את מיקום החרוזים.
5. תנאים מוקדמים
   1. צור פרוטוקול תנאים מוקדמים מבוקר כוח, שבו הרקמה עם אורך ועובי הקצה תעבור שש חזרות של העמסה שווה-צלעות _לשיא מתח ממברנה T של 40 N/m עם מטען מקדים של 3% × T_שיא¹⁰ וזמני מתיחה והתאוששות של 30 שניות כל אחד.
      1. בנה ספריית בדיקות שרירותית שתאחסן באופן זמני את הנתונים לחישובים עתידיים. הגדר את קצב הטעינה להיות 4.42 N/m.
      2. בנה קבוצת פרמטרים חדשה לבדיקה עם השם Precondiditioning0. הגדר את מצבי הבקרה של ציר X וציר Y כדי לכפות והגדר את פונקציות הבקרה לצעד. הגדר את גודל העומס ככוח המשויך _לשיא T, כלומר, שיא f = _שיא T · L. הגדר את גודל הטעינה מראש כ- 3% _משיא f עבור החזרה הראשונה בלבד והגדר הן את משך המתיחה והן את משך ההתאוששות כ- 30 שניות. הגדר את מספר החזרות כ- 10.
         הערה: השיא המחושב הראשון של מתח פיולה-קירכהוף, כלומר שיא P₌ T_peak/t, עשוי לעלות על 200 kPa עבור רקמות דקות יותר, מה שעלול לגרום לקריעת רקמות במהלך הבדיקה. בתרחישים אלה, שיא מתח הממברנה הותאם ללחץ פיולה-קירכהוף ראשון מקסימלי של 200 kPa.
   2. הפעל את פרוטוקול התנאים המוקדמים. לאחר תנאים מוקדמים, רשמו את ממדי ה-X וה-Y הנוכחיים של הדגימה לשימוש בפרוטוקולי הבדיקה הדו-אקסיאליים.
6. יצירה וביצוע של פרוטוקולי בדיקה דו-אקסיאליים
   1. קבע את הזמן הדרוש כדי להשיג את תצורת השיא השווה-שוויון מהתצורה שלאחר התנאים המוקדמים עם קצב התזוזה הרצוי. בהתחשב בקצב תזוזה קבוע, חישב את זמני הטעינה עבור יחסי הטעינה הנותרים (כלומר, T_XX:T_YY = 1:0.5 ו - T_XX:T_YY = 0.5:1).
   2. הפעל ידנית את המפעילים הליניאריים כדי להתאים את כוחות המטרה ליחס טעינה נתון. חזור על תהליך זה ותעד את מידות העלון עבור כל יחסי הטעינה.
   3. הכן פרוטוקול בדיקה מבוקר תזוזה המעביר באופן ביאלי את הרקמה מהתצורה שלאחר התנאים המוקדמים לתצורות שנרשמו בשלב 1.6.2 (כלומר, T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) בתוך הזמנים שנקבעו בשלב 1.6.1. ודא שלכל פרוטוקול יש שלושה מחזורי טעינה/פריקה כדי לחזור על ההתנהגות המכנית.
      1. בנה ספריית בדיקה שתאחסן את הנתונים לחישובים עתידיים. ודא ששם הספרייה תואם לדגימה הנוכחית.
      2. בנה פרמטר בדיקה חדש עם השם 1:1, הגדר את מצבי הבקרה של ציר X וציר Y לתזוזה והגדר את פונקציות הבקרה לרמפה. הגדר את גודל המתיחה כתצורה שנרשמה בשלב 1.6.1. הגדר את גודל הטעינה מראש כ- 3% _משיא f עבור החזרה הראשונה בלבד, והגדר הן את משך המתיחה והן את משך ההתאוששות כזמן שנרשם בשלב 1.6.1. הגדר את מספר החזרות כ- 3.
      3. חזור על שלב 1.6.3.2 עבור יחסי הטעינה הנותרים (כלומר, T_XX:T_YY = 1:0.5 ו - T_XX:T_YY = 0.5:1), למעט הגדרת גודל הטעינה מראש כלא מוחל. ודא שגודל המתיחה, משך המתיחה ומשך ההתאוששות תואמים לאלה שנרשמו בשלב 1.6.2.
         הערה: רק נתונים מהמחזור הסופי (השלישי) ישמשו לניתוחי מתח ומתח.
   4. בצע את הפרוטוקולים הנשלטים על-ידי תזוזה. לאחר השלמת הבדיקה הדו-אקסיאלית, החזירו את הרקמה לממדיה שלאחר תנאים מוקדמים.
      הערה: יש לבטל את הבדיקה באופן מיידי אם הרקמה מתחילה להיקרע.
7. אפיונים נוספים
   1. השאירו את הרקמה שקועה במי DI והורכבה על מערכת הבדיקה הדו-אקסיאלית. בצע הדמיית pSFDI כמתואר בשלבים 2.1-2.3.
   2. שחררו את הרקמה. אם זוהי רקמה שלמה, המשך למיקרו-דיסקציה המתוארת בשלבים 3.1-3.7. אם לא, לאסוף היסטולוגיה בעקבות שלב 3.7.
      הערה: אמבט המים DI יכול לשמש לאפיונים הבאים באותו יום.
   3. חזור על שלבים 1.2-1.7 עם שכבות ה-A/S וה-F/V שנרכשו לאחר המיקרו-דיסקציה (שלבים 3.1-3.6).
      הערה: החזרה על פרוטוקול הבדיקה של השכבות מאפשרת השוואה ישירה של הרקמה השלמה לשכבות שלה.
8. בדיקה דו-אקסיאלית של נהלי עיבוד נתונים לאחר עיבוד
   1. בצע מתאם תמונה דיגיטלי של תמונות הבדיקה הדו-אקסיאליות שנרכשו כדי לקבוע את מיקומי הסמן התלויים בזמן. חישוב תזוזות הסמן הפידוקיאלי באמצעות Eq (1). ⁵
      (1)
      כאן, x_i(t), X_i ו- d_i(t) הם המיקום התלוי בזמן, המיקום הראשוני (הפניה) והתזוזה של הסמן i.
   2. חישוב גרדיאנט העיוות F על ידי התחשבות בסמנים הפידוקיאליים כאלמנט סופי דו-ליניארי בעל ארבעה צמתים, כפי שמוצג ב- Eq (2)⁵
      (2)
      כאשר B_Xi ו-B_Yi הם הנגזרות של פונקציות הצורה עבור צומת i בכיווני X ו-Y, בהתאמה, ו-u_i(t) ו-v_i(t) הם הרכיבים של d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. חישוב הלחץ הראשון של פיולה-קירכהוף P באמצעות הכוחות שנרשמו, כמו ב- Eq (3)⁵
      (3)
      P_XX ו-P_YY הם רכיבי X ו-Y של P; L ו-t הם אורך ועובי קצה הרקמה; f_X ו-f_Y הם הכוחות שנרשמו בכיווני X ו-Y.
   4. קבע מדדי מאמץ ומתח אחרים לפי הצורך,13 הכוללים את העיוות הנכון של קאוצ'י-גרין C = F^T/F, זן גרין-לגראנז' E = (C - I)/2, σ הלחץ הקאוצ'י = ^J-1PF^T, ואת הלחץ השני של פיולה-קירכהוף S = ^F-1P.
      הערה: כאן, I הוא טנזור זהות מסדר שני, ו- J = det(F) הוא היעקוביאן של גרדיאנט העיוות F.

2. הדמיית תחום תדרים מרחביים מקוטבים

1. הכנת מערכת
   הערה: אם תרצה, ניתן להסיר את הסמנים הפידוציאליים מהרקמה לפני השלבים הבאים.
   1. מרכז את התקן ה-pSFDI מעל הדגימה (איור 2). הפעל את המקרן והאיר את הדגימה באור של 490 ננומטר (ציאן).
   2. פתח את תוכנת המצלמה ובדוק את שדה הראייה של המצלמה. ודא שהדגימה ממורכזת במסגרת ומוכלת לחלוטין בתוך שדה הראייה.
   3. אם הדגימה המותקנת היא עלון שלם, התאימו את בהירות המקרן של עיבוד האור הדיגיטלי (DLP) כדי להבטיח שהרקמה מוארת במלואה ללא בוהק על פני הרקמה. אין להתאים את הבהירות אם הדגימה היא אחת השכבות המורכבות.
   4. סובבו את המקטב על פני טווח התנועה המלא שלו כדי לזהות בוהקים או לכלוך אפשריים בעדשת המקטב. יש לנקות בזהירות את עדשת המקטב באמצעות מטלית מיקרופייבר לפי הצורך.
2. איסוף נתונים
   הערה: ניתן להפוך את איסוף הנתונים הבא לאוטומטי באמצעות תוכנה, כגון LabVIEW או Python.
   1. הזיזו את המקטב למיקום הביתי שלו – מיושר באופן אידיאלי עם אחד מצירי הבדיקה הדו-אקסיאליים. צלם תמונה אחת בגווני אפור ושמור אותה במחשב עם מיקום המקטב (כלומר, 0°).
   2. סובב את המקטב ב- 5° וצלם תמונה נוספת בגווני אפור. חזור על תהליך זה כדי לרכוש 37 תמונות הנעות בין 0° ל- 180° עם תוספת של 5°.
      הערה: ניתן לנתח באופן ראשוני את התמונות מרצף ההדמיה הראשון של pSFDI כדי להבטיח את התגובה האופטית הרצויה מהרקמה. עיין בשלב 2.3 לקבלת הוראות.
   3. חזור על רצף ההדמיה של pSFDI עבור תצורות רקמה רצויות אחרות, לדוגמה, תצורות השיא של פרוטוקולי הטעינה הנחשבים לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית.
3. pSFDI נתונים לאחר עיבוד נהלים
   הערה: השיטה הבאה כוללת שלבים עבור שפת התוכנית MATLAB. עם זאת, ניתן להשתמש בכל שפה מועדפת (לדוגמה, Python, C++) במקום זאת.
   1. השתמש בפונקציה MATLAB imread() כדי לבנות מערכים המכילים את העוצמות מבחינת פיקסלים של 37 התמונות שנרכשו. מטעמי נוחות, סדרו אותם כ-n × m × 37 מערך תלת-ממדי, כאשר n ו-m הם מספרי הפיקסלים לאורך שני הצירים.
   2. הגדר את אזור העניין של הרקמה (ROI) באמצעות פונקציית grabit() המוגדרת על-ידי המשתמש.
   3. התאם את נתוני העוצמה לעומת זווית המקטב עבור כל פיקסל ROI באמצעות סדרת פורייה בת 3 מונחים, כמו ב- Eq (4):
      (4)
      כאן, I(θ) היא העוצמה מבחינת פיקסלים כפונקציה של זווית המקטב, ו-b_i הם קבועי פורייה. השתמש ברגרסיה סטנדרטית של ריבועים ליניאריים לפחות כדי לקבוע b_i.
   4. קבע את כיוון הסיבים מבחינת פיקסלים כזווית המקטב המשויכת לערך המרבי של I(θ). חישוב מידת האניזוטרופיה האופטית (DOA) באמצעות Eq (5).
      (5)
   5. השתמש ב-plot() וב-histogram() כדי להמחיש את כיוון הסיבים הנרכש ואת ערכי ה-DOA. שמור את התוצאות המעובדות לשימוש מאוחר יותר.

3. מיקרו-דיסקציה של שכבות מרוכבות עלון שסתום טריקוספידיות

1. חיבור רקמות ללוח שעווה
   1. לאסוף את החומרים הנדרשים: לוח שעווה, מים DI, פיפטה, אזמל, מיקרו מספריים, מלקחיים דקים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עבים וסיכות.
      הערה: השתמש רק בפינצטה ללא שיניים או אחיזות, שכן מלקחיים מסוג זה יכולים בקלות רבה לקרוע את הרקמה הדקה של שכבת ה- A/S בעת ביצוע הנתיחה.
   2. שחררו את הרקמה מהבודק הדו-אקסיאלי ומדדו את עוביה באמצעות חיישן תזוזת הלייזר המתואר בשלב 1.2. מניחים את הרקמה על לוח השעווה.
   3. יש לבחון את הצד החדרי של הרקמה לאיתור תוספות גדולות של כורדה. שים לב למיקום של תוספות אלה כדי להימנע מהן במהלך הניתוח (איור משלים S1). צלם תמונה לעיון.
   4. מורחים את הרקמה שטוחה על לוח השעווה כאשר האטריאליס פונה כלפי מעלה. הצמד את הרקמה ללוח באמצעות הפינים:
      1. בכל פינה של הרקמה, הניחו סיכה אחת שנמצאת בזווית הרחק מהרקמה (לצפייה טובה יותר) ומשכה מעט את הרקמה מתוחה (איור 3A). עשו זאת בסדר כיוון השעון או נגד כיוון השעון. יש לוודא כי הפינים נמצאים מחוץ לחורים שנוצרו על ידי הטינים בעת הרכבת הרקמה.
      2. התאימו מעט את מיקום הפינים כדי לוודא שהרקמה מתוחה ובתצורה מרובעת (איור 3B) כך שהרקמה תהיה שטוחה ולא תזוז במהלך המיקרו-דיסקציה של השכבה.
      3. במידת הצורך, מניחים סיכות לאורך צד הרקמה במהלך הנתיחה כדי למתוח את הרקמה יותר. יש לזכור בעת הצבתם וסיכות נוספות שיש לעקוף אותן במהלך הנתיחה.
      4. הסר את סמני חרוזי הזכוכית.
         הערה: השלב הבא הוא אופציונלי. מי ה-DI המוספים מסייעים בשמירה על הידרציה של הרקמות ומונעים מהרקמה להיצמד לעצמה לאורך כל המיקרו-דיסקציה.
      5. באמצעות פיפטה, מניחים מי DI על פני הרקמה כך שהם מכסים לחלוטין את הרקמה באופן דמוי בועה. מלאו את מי ה-DI לפי הצורך לאורך כל הנתיחה.
2. הפוך את הפינה הראשונית.
   1. בחר פינה של הדגימה המוצמדת כדי להתחיל את הנתיחה. הימנעו מתוספות צ'ורדה גדולות ואזורים דקים במיוחד.
   2. בצעו חתך בשכבת ה-A/S על-ידי גרירה קלה של האזמל מעל משטח הרקמה לאורך חורי ההרכבה מבדיקה מכנית (איור 3C). ודאו שאורכו של החתך הוא לפחות 5 מ"מ, ושולי החתך מתחילים להתפרק, וחושפים את שכבת ה-F/V שמתחת.
   3. השתמשו במלקחיים הדקים (ללא קצה חד) כדי לשפשף בחוזקה לאורך החתך ולמשוך את קצוות החתך זה מזה (איור משלים S2).
      1. אם החתך בשכבת ה-A/S לא מתחיל להתפרק, יש לעקוב קלות אחר אותו חתך שוב עם האזמל עד שהוא מתחיל לעשות זאת. היזהרו שלא לחתוך עמוק מדי לתוך הרקמה (מעבר לשכבת ה-A/S המורכבת) מכיוון שזה מקשה על הפרדת השכבות בצורה נקייה.
   4. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.3 כדי ליצור חתך שני בניצב לחיתוך הראשון (איור 3D). ודא ששני החיתוכים מחוברים ויוצרים פינה.
      1. אם שני החתכים אינם מחוברים, הפעילו את הפינצטה הדקה מתחת לשטח הקטן של הרקמה המפריד בין שני החתכים (איור משלים S3). לאחר מכן, בזהירות להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה.
3. מקלפים את הרקמה מהפינה.
   1. משפשפים לאורך החתכים באמצעות המלקחיים הדקים עד שהרקמה מתחילה להיפרד משכבת ה-F/V. ברגע שפיסת רקמה קטנה מופרדת, תפסו אותה בפינצטה ומשכו אותה בעדינות כדי להפריד עוד יותר את השכבות המורכבות.
      הערה: הנח תמיד את קצה הפינצטה הדקה מעבר לקצה הרקמה בעת האחיזה. אחרת, הם עלולים בטעות לתקוע חור בשכבה המורכבת A/S.
   2. ממשיכים לקלף את הרקמה ולשפשף את התפר עד שהיא מגיעה לקצה שני החתכים שנעשו עבור הפינה. לאורך כל התהליך הזה, עברו לפינצטה גדולה יותר כדי לתפוס את הרקמה של תהליך הקילוף כדי למנוע קריעה לא רצויה וקריעה של השכבה המורכבת A/S.
      1. אם בפינה הראשונה שנוסתה יש בעיות משמעותיות בהפרדה, נסה פינה אחרת כנקודת התחלה (חזור לשלב 3.2).
4. להאריך חתכים, לקלף את הרקמה, ולעשות פינה שנייה.
   1. הרחיבו את שני החיתוכים שנעשו עבור הפינה הראשונה על ידי הצבת קצה האזמל בתחתית כל חתך וגרירה קלה שלו לאורך משטח הרקמה (איור 4A). ודא שכל חתכי ההארכה הם לפחות 5 מ"מ ושלוחות החתך מתחברות לחיתוכים המקוריים וממשיכות לעקוב אחר חורי הטין או התפר.
      הערה: אם חתך ההרחבה עמוק מדי, יש לעקוב מקרוב אחר הפילינג הקרוב כדי לוודא שחלקים של הפיברוסה אינם מופרדים בשכבת A/S המורכבת (איור 5A).
   2. המשיכו להאריך את החתכים ולקלף את שכבת ה-A/S המורכבת העליונה בחזרה תוך כדי שפשוף התפר עד לסיום צד אחד. שימו לב שהרקמה תופרד לחלוטין לאורך חתך אחד; ודא שהתפר בין השכבות המורכבות A/S ו-F/V יהיה ישר (איור 4B).
   3. חזור על ההוראות בשלב 3.2 ובשלב 3.3 כדי ליצור פינה שנייה בניצב לקצה הצד המקולף במלואו (איור 4C).
5. הפרד לחלוטין את שכבת ה-A/S.
   1. הרחיבו את החתכים הנותרים תוך הימנעות מהכנסות גדולות של צ'ורדה. המשך להפריד בין שכבות ה-A/S וה-F/V באמצעות טכניקות השפשוף והמשיכה שבהן נעשה שימוש עבור הפינה הראשונה. שים לב למספר שיקולים או בעיות שעלולים להתעורר במהלך תהליך זה:
      1. אל תכלול את התוספות של הכורדה מאזור ההפרדה A/S (איור 5B) רק כאשר החרגה זו תאפשר דגימת A/S גדולה מספיק לאפיונים ניסיוניים (>3.3 מ"מ).
      2. אם הרקמה נקרעת או נוצר חור, יש להפסיק להפריד את הרקמה באופן מיידי. כדי למנוע לכידת פינצטה, הניחו את המספריים בכל חור שנוצר וחתכו את הרקמה מהמרכז. אם הפגם נוצר לאורך תפר ההפרדה, התחילו להפריד את הרקמה לאורך קצה אחר כדי למנוע קרע נוסף (איור 5C).
      3. חפשו קשרים בין-שכבתיים שעשויים להופיע בעת הפרדת הרקמה ולמנוע הפרדה נוספת של הרקמה ללא סיכון גבוה לקריעה (איור 5D). שימו לב שאלו גדילים דקים אך חזקים שיש לחתוך בזהירות באמצעות מספריים. הימנעו מיצירת חור בשכבת ה-A/S או חיתוך כלפי מטה לשכבת ה-F/V, מכיוון שהדבר יגרום להפרדה לא אחידה.
      4. המשך בתהליך זה עד להפרדת הדגימה הגדולה ביותר האפשרית של שכבת ה- A/S. סמן את כיוון הדגימה באמצעות העט הכירורגי (איור 6A).
6. סיים את הנתיחה.
   1. השתמשו במספריים כדי לחתוך לאורך תפר ההפרדה עבור קצה הרקמה הנותר (איור 6B). ודא שחתך זה קרוב ככל האפשר לתפר ההפרדה.
   2. מניחים את השכבה המורכבת המופרדת A/S שטוחה על משטח החיתוך. במידת הצורך, השתמש באזמל כדי ליישר את קצוות הרקמה וליצור צורת רקמה מרובעת המתאימה לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית. מניחים את שכבת ה-A/S במי DI עד שהיא מוכנה לבדיקה.
   3. סמן את הכיוון של שכבת ה-F/V שנותרה על לוח השעווה. חותכים את הריבוע הגדול ביותר האפשרי מחוץ לשטח שבו הוסרה שכבת ה-A/S (איור 6C), ואז מניחים אותה במי DI.
7. היסטולוגיה
   1. לבלות שתי רצועות של רקמה – מיושרות עם הכיוונים ההיקפיים והרדיאליים – לשימוש בהיסטולוגיה. השתמש בפרוטוקולים שונים עבור השכבות השלמות והשכבות המורכבות (כלומר, A/S ו- F/V).
      1. עבור השכבה השלמה, קח את הדגימות מהרקמה שנותרה מוצמדת ללוח השעווה. השתמשו ברקמה מחוץ לחורי הטין/תפר, שכן חלק זה של הרקמה לא נותח וייצג את העלון השלם.
      2. עבור השכבות המורכבות A/S ו-F/V, אספו דגימות היסטולוגיה רק לאחר השלמת הבדיקה וההדמיה במלואן. שחררו את הדגימה ממערכת הבדיקה הדו-אקסיאלית, הניחו את הרקמה שטוחה על משטח חיתוך, וכרתו את הרצועות ההיקפיות והרדיאליות באמצעות סכין גילוח.
   2. מניחים את הרצועות שנכרתו בקלטות רקמות ומטביעים את הקסטות ב-10% פורמלין.
   3. השליכו את הרקמה הנותרת. נקו את כלי הנתיחה באמצעות תרכובת ניקוי (ראו טבלת החומרים).
   4. לאחר 24-48 שעות של קיבוע, העבר את הקלטות לאתנול, שם ניתן לאחסן אותן ללא הגבלת זמן עד לעיבוד היסטולוגיה וצביעה.
      הערה: ניתוח היסטולוגי זה יכול לאשר כי המיקרו-דיסקציה מוצלחת. אזהרה: 10% פורמלין גורם לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. זה עלול גם לגרום לתגובה אלרגית או לסרטן באמצעות שאיפה. בעת הטיפול, לבשו ציוד הגנה אישי מתאים, כגון כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה, והשתמשו רק בחללים מאווררים היטב, כגון במכסה אדים. כאשר אינו בשימוש, ודא שמיכל האחסון סגור היטב.

תוצאות

המיקרו-דיסקציה תניב דגימות A/S ו-F/V בעוביים אחידים יחסית שניתן להרכיב על מכשיר בדיקה דו-אקסיאלי (מסחרי). ניתוח היסטולוגי של העלון השלם ושתי השכבות המנותחות יוודא אם הרקמה הופרדה כהלכה לאורך הגבול בין הספונטיוסה לפיברוסה (איור 7). בנוסף, ניתן להשתמש במיקרוגרפים ההיסטולוגיים כדי לקבוע את עובי שכבת הרקמה ואת שברי המסה המרכיבים באמצעות תוכנת ImageJ. דיסקציה כושלת מתרחשת כאשר היא מייצרת דגימת A/S קטנה מדי להרכבה לבוחן הדו-אקסיאלי. זה קורה לרוב כאשר ה-A/S נקרע במהלך הקילוף, או כאשר נוצר חור בשכבת...

דיון

שלבים קריטיים עבור הפרוטוקול כוללים: (i) המיקרו-דיסקציה של השכבה, (ii) הרכבת הרקמה, (iii) מיקום הסמן הפידוקיאלי, ו-(iv) הגדרת pSFDI. מיקרו-דיסקציה מתאימה של השכבה היא ההיבט החשוב והקשה ביותר של השיטה המתוארת כאן. לפני פתיחת חקירה תוך שימוש בטכניקה זו, הדיסקטור(ים) צריכים לתרגל לטווח ארוך עם טכניקת המיקרו-דיסקציה וכל שלושת עלוני הטלוויזיה. הדיסקטור צריך לוודא שדגימות השכבה המורכבת גדולות מספיק (>3.3 מ"מ) ובעלות עובי אחיד. יש להשתמש בהיסטולוגיה כדי לאשר כי לנתחים יש באופן עקבי הפרדת שכבות מדויקת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10% תמיסת פורמלין,	סיגמא-אולדריץ	HT501128-4 ליטר
	תרכובת ניקוי	אלקונוקס
BioTester - בודק דו-צירי	CellScale ביו-חומרים בודקים		1.5 N קיבולת תא עומס
מחצלת חיתוך	דאהל	B0027RS8DU
מים נטולי יונים	N/A
מלקחיים בעלי קצה עדין	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
	מעוקלים Scientific Labwares	16122
עבים	Scientific Labwares
- Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	10.66
עקירת לייזר חיישן	Keyence	IL-030
דבק ציאנואקרילט נוזלי	לוקטיט	2436365
MATLAB	MathWorks	גרסה 2020a
מספריים מיקרו מכשירי	HTI Instruments	CAS55C
פיפטה	Belmaks	360758081051Y4
מכשיר הדמיה תחום תדר מרחבי מקוטב	N/A		מיוצר בבית באמצעות מקרן אור דיגיטלי, מקטב ליניארי, תושבת מקטב מסתובבת ומצלמת מכשיר מצמד טעינה. ראה doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) לפרטים נוספים.
אזמל	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
סכיני גילוח תעשייתיים בקצה יחיד (פלדת פחמן כירורגית)	VWR International	H3515541105024
עט כירורגי	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	מקור עסקי	BSN32351
לוח שעווה	N / A		מיוצר בבית באמצעות דוגמנות שעווה ומגש אפייה
שקילה סירה	טהורה Ponta	mdo-azoc-1030