מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

Summary

פרוטוקול הכניסה למיקרוסקופיה של הכוח האטומי מציע את האפשרות לנתח את תפקיד התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תא מסוים ברקמה או באיבר במהלך גדילה רגילה או מוגבלת (כלומר, תחת גירעון מים).

Abstract

כאן מתוארת שיטה לאפיון התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאי האפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים באמצעות ננו-אינסטנציות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך אופטי. השיטה מורכבת מהפעלת כוחות מבוקרים על הדגימה תוך מדידת העיוות שלה, ומאפשרת לכמת פרמטרים כגון מודולוס דופן התא של יאנג לכאורה ברזולוציות תת-תאיות. זה דורש אימוביליזציה מכנית זהירה של המדגם ובחירה נכונה של כניסות ועומקי כניסה. למרות שניתן להשתמש בו רק ברקמות חיצוניות, שיטה זו מאפשרת לאפיין שינויים מכניים בדפנות תאי הצמח במהלך ההתפתחות ומאפשרת קורלציה של שינויים מיקרוסקופיים אלה עם גדילה של איבר שלם.

Introduction

תאי הצמח מוקפים בדופן תא שהיא מבנה מורכב המורכב מרשתות אינטראקציה של פוליסכרידים, חלבונים, מטבוליטים ומים שעוביים משתנה מ-0.1 למספר מיקרומטר בהתאם לסוג התא ולשלב הגדילה ^1,2. תכונות מכניות של דופן התא ממלאות תפקיד חיוני בצמיחת צמחים. ערכי קשיחות נמוכים של דופן התא הוצעו כתנאי מקדים לצמיחת התא ולהרחבת דופן התא, ויש ראיות הולכות וגוברות לכך שכל התאים חשים כוחות מכניים כדי לבצע את תפקידיהם. עם זאת, עדיין מתלבטים אם שינויים בתכונות הפיזיקליות של דופן התא קובעים את גורל התא ^2,3,4. מאחר שתאי צמחים אינם זזים במהלך ההתפתחות, צורתו הסופית של איבר תלויה במרחק ובאיזה כיוון תא מתרחב. לפיכך, שורש ערבידופסיס הוא מודל טוב לחקר ההשפעה של התכונות הפיזיקליות של דופן התא בהרחבת התא מכיוון שסוגים שונים של התפשטות מתרחשים באזורים שונים של השורש. לדוגמה, התפשטות אניזוטרופית ניכרת באזור ההתארכות ובולטת במיוחד בתאי האפידרמיס⁵.

השיטה המתוארת כאן שימשה לאפיון התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאי האפידרמיס בקנה מידה ננומטרי של שורשי ערבידופסיס חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשילוב עם מיקרוסקופ פאזה פלואורסצנטית הפוכה⁶. לתיקון מקיף של טכניקת AFM, קרא ^7,8,9.

פרוטוקול זה מתווה שיטה בסיסית להכנת דגימות ושיטה כללית למדידות גמישות מבוססות AFM של דפנות תאי צמחים.

איור 1: סקירה סכמטית של ניסוי כניסת כוח בשורשי ערבידופסיס באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). התוכנית נותנת סקירה של השלבים של ניסוי Force-Indentation מהכנת המצע כדי לשתק את דגימת השורש בחוזקה (1-2), אישור כדאיות השורש באמצעות צביעת פרופידיום יודיד (3), מיקום קנטילבר על פני השטח של תא אפידרמיס מוארך של השורש הראשוני (4-5), מדידת עקומות כוח (6), ועיבוד עקומת כוח לחישוב המודולוס של יאנג הנראה (7-8). EZ: אזור התארכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. הכנת החומר הצמחי ותנאי הגידול

1. כדי ליצור את החומר הצמחי הדרוש, לעקר את הזרעים של Arabidopsis סוג בר וקווי עניין מוטנטיים.
   הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו בדברים הבאים: ttl1: קווי החדרת T-DNA Salk_063943 (עבור TTL1; AT1G53300) - קולומביה-0 (Col-0) סוג פראי; מוטנט Procuste1 (prc1-1), המורכב ממוטציה נוק-אאוט (Q720stop) בגן CESA6 (AT5G64740), כפי שתואר קודם לכן^ב-10,11; ו-TTL1 x PRC1-1 מוטציה כפולה.
   1. שים נפח משוער של 50 μL של זרעים microtube. הוסף 500 μL של 70% אתנול + 0.01% תמיסת טווין בטמפרטורת החדר. מערבבים ודוגרים במשך 7 דקות.
   2. יוצקים את תמיסת האתנול ומוסיפים 500 μL של 20% נתרן היפוכלוריט. מערבבים ודוגרים במשך 7 דקות.
   3. יוצקים את תמיסת hypochlorite נתרן ולשטוף את הזרעים שלוש עד ארבע פעמים עם מים סטריליים.
2. ציפוי
   1. הכינו מראש מורשיגה בסיסית וסקוג (MS) בינונית¹² + 1.5% סוכרוז + 1% אגר (pH 5.7) (ראו טבלת חומרים). אוטוקלאב את המדיום. הכינו קולט אדים למינרי שיעבוד בסביבה סטרילית ותייגו את צלחות הפטרי המרובעות הדרושות לניסוי. יוצקים את המדיום לתוך צלחות הפטרי ומאפשרים למדיום להתמצק.
   2. צלחת את הזרעים המעוקרים באמצעות קצוות פיפטה סטריליים על צלחות פטרי מרובעות המכילות את המדיום. מפזרים את הזרעים באופן שווה בשתי שורות. כאשר הזרעים יבשים, סגרו את המכסים ואטמו את הצלחות. ריבוד הזרעים ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 4 ימים.
      הערה: יש צורך בריבוד כדי לסנכרן את הנביטה.
   3. מניחים את הלוחות אנכית בתא הגידול במשטר של יום ארוך (16 שעות של אור / 8 שעות של חושך) עם 25 μmol m^{2 s−1} עוצמת אור ו 23 °C (יום / לילה). לגדל את השתילים במשך 7 ימים.

2. טיפול מתח אוסמוטי (אופציונלי)

הערה: סעיף זה מספק פרטים על הצמיחה של שורשי Arabidopsis בפוטנציאל אוסמוטי של -1.2 MPa כפי שהוערך על ידי אוסמומטר קריוסקופי (טבלת חומרים). חלק זה ניתן להשמיט או לשנות בהתאם לשאלה הניסויית העומדת על הפרק.

1. הכינו MS בסיסי בינוני + 1.5% סוכרוז + 400 מ"מ מניטול + 1% אגר (pH 5.7). אוטוקלאב את המדיום. יוצקים את המדיום בצלחות פטרי מרובעות במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומאפשרים למדיום להתמצק.
2. בעזרת פינצטה (טבלת חומרים), הניחו שתילים בני 5 ימים שגודלו מראש ב-MS בסיסי + 1.5% סוכרוז בינוני בצלחות פטרי מרובעות המכילות את המדיום בתוספת מניטול של 400 מ"מ. מניחים את הלוחות אנכית בתא הגידול באותם תנאים כמו בשלב 1.2.3. לגדל את השתילים תחת תנאי מתח אוסמוטי זה במשך 7 ימים.
   הערה: כדי להעריך את הסתגלות צמיחת השורש הראשוני במהלך עקה אוסמוטית חמורה, מומלץ להשתמש בשתילים 5 ימים לאחר הנביטה שגדלו בתנאים מבוקרים כדי להבטיח שגודל השורש כבר נקבע¹³. לחלופין, ניתן לבצע את הניתוח בכל שלב של הפיתוח כדי לקבוע את ההשפעה ההתפתחותית של פעולת מתח אוסמוטית.

3. ניסויי ננו-אינדנטנציה של מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM)

1. הכנת הדגימה לניסויים בננו-אינדנטנציה
   הערה: זהו צעד מכריע ליישום AFM בחקר דגימות ביולוגיות חיות. המדגם חייב להיות מחובר היטב למצע כדי להיות יציב מכנית במהלך מדידות הזחה. יחד עם זאת, יש לשמר את התכונות המבניות של המדגם. אסטרטגיה יעילה לייצוב מדגם גדול עבור AFM היא להשתמש בדבקים. הדבק חייב להתייבש במהירות ואסור שיהיה רעיל או תגובתי עם המדיום שמסביב. בפרוטוקול זה, צלחות פטרי פוליסטירן שימשו כמצע ודבק סיליקון לא חומצי (טבלת חומרים) שימש לקשירת שתילי הערבידופסיס.
   1. מורחים שכבה דקה של דבק סיליקון לתוך צלחת פטרי עם כיסוי. השאירו את הדבק באוויר במשך 45 שניות.
   2. בפינצטה, מניחים את השתיל על הדבק, מכוונים אותו לכיוון שנמנע ממגע בין החלקים הבולטים של השתיל לבין הקנטילבר. לאחר מכן, לחץ את השורש בעדינות לשכבת דבק הסיליקון כדי לקשור אותו בחוזקה. השאירו את השתיל במגע עם הדבק במשך 45 שניות לפני שתמשיכו בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
   3. דגירה של השתילים המחוברים עם 2 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI; טבלת חומרים) במשך 5 דקות בחושך ולשטוף אותם בזהירות שלוש פעמים עם 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) (טבלת חומרים).
   4. מקם את השתילים הדוגרים ב- PI במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך יחד עם ה- AFM. כדי לצפות בפלואורסצנציה, קבעו את אורכי הגל של העירור והפליטה על 572 ננומטר ו-617 ננומטר, בהתאמה. היעדר פלואורסצנציה בתוך תאי האפידרמיס מאשר את הכדאיות של השורשים.
   5. מכסים את השתיל בתמיסת מלח (PBS) אחת עם אגירת פוספטים.
2. פרוטוקול כניסה
   הערה: בצע את כל מדידות ה-AFM תוך שעה אחת לאחר אימוביליזציה של הדגימה על תמיכתה בטמפרטורת החדר. החדר שבו AFM ממוקם צריך להיות מתוחזק ב 25 מעלות צלזיוס עם מזגן. תמיסת PBS צריכה להיות באותה טמפרטורה.
   1. הרכיבו תעלת סיליקון ניטריד סטנדרטית עם קצה פירמידלי (ראו טבלת חומרים) לתוך מחזיק הבדיקה AFM לנוזל (טבלת חומרים).
   2. יישר את הלייזר על המכל קרוב למיקום הקצה. לאחר מכן, הזז את הפוטודיודה כדי למקם את נקודת הלייזר במרכז הגלאי.
   3. כדי לכייל את רגישות הסטייה, מקם צלחת פטרי פוליסטירן עם PBS אחד מתחת ל-AFM.
      הערה: שלב זה נחוץ כדי לחשב את הכניסה. כאשר מדידת כוח מתבצעת על משטח קשה, אין כניסה למשטח, ולכן כל שינוי בתזוזה של סורק z מתאים לסטייה הקנטילית. לכן, חשוב מאוד לכייל את רגישות הסטייה על משטח קשה. שימוש במשטח רך יעריך יתר על המידה את רגישות הסטייה, מה שיגרום לקבועי קפיץ נמוכים מדי.
   4. התאם את הפוטודקטור כך שהסטייה ללא מגע תהיה קרובה ל- 0 V. כייל את רגישות הסטייה על ידי ביצוע כניסה (עקומת כוח), עם גודל רמפה של 3 מיקרומטר, קצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה, וסף טריגר של 0.5 V.
   5. כדי לכייל את קבוע הקפיץ של הקנטילבר, השתמש בכלי השירות Thermal Tune של תוכנת AFM (טבלת חומרים) המומלצת עבור בדיקות עם קבועי קפיץ הנמוכים מכ-5 N/m או השתמש בשיטה המתוארת בהתייחסות¹⁴. לפני הפעלת Thermal Tune בתוכנה, ודא שהבדיקה אינה מקיימת אינטראקציה עם הדגימה.
      1. הזן את הטמפרטורה cantilever. לחץ על כיול > כוונון תרמי או על סמל המנגינה התרמית בסרגל הכלים NanoScope . בחר טווח תדרים (1-100 הרץ).
      2. לחץ על רכישת נתונים בחלונית כוונון תרמי. המתן עד שה- AFM ישיג נתונים ולאחר מכן לחץ על לחצן מתנד הרמוני פשוט (Fluid).
      3. התאם את רוחב המסנן החציוני ל- 3. התאם את רוחב סל PSD כדי להפחית את הרעש בנתונים הנרכשים בממוצע. הציבו גבולות התאמה סביב פסגת התהודה הראשונה.
      4. לחץ על חשב קבוע אביב k ולאחר מכן, לחץ על כן בחלון המוקפץ ושאל אם המשתמש רוצה להשתמש בערך זה.
      5. חזור על השלבים שתוארו לעיל שלוש פעמים וקח באופן ידני ממוצע של ערכי קפיץ קבועים. הזן ערך ממוצע זה בתיבה קבוע קפיץ ברשימת הפרמטרים רמפה בתצוגת PicoForce . הכיול מסתיים בנקודה זו.
   6. באמצעות המיקרוסקופ האופטי ההפוך בהגדלה של 10x, 20x ו-40x עיניות, מקם את גשושית ה-AFM על פני השטח של התא האפידרמלי המוארך הרביעי של השורש הראשוני, תוך הקפדה למקם אותו במרכז התא.
   7. עם ערך קבוע הקפיץ המחושב (שלב 3.2.5.5), השג עקומות כוח בגודל רמפה של 3 מיקרומטר, סף טריגר של 11 nN וקצב כניסה ונסיגה של 0.6 מיקרומטר לשנייה בנקודות נבחרות.
      הערה: בעבודה קודמת^15,16 נמצא כי תדירות נמוכה של כניסה ונסיגה מסייעת למזער היסטרזיס וכוח גרירה.
   8. קבל עקומות כוח משלושה תאים לכל שורש עבור כל טיפול (השתמש בשלושה שכפולים ביולוגיים לכל טיפול). צלם לפחות 150 עקומות כוח עבור כל שורש.

4. מדוד את המודולוס של יאנג לכאורה

1. התאימו כל עקומת כוח למודל הבא עבור כניסות פירמידליות¹⁷: , כאשר E הוא המודולוס הנראה של יאנג של המדגם, הוא מודולוס פואסון של הדגימה, ו- α הוא הזווית למחצה לקודקוד. השליכו את ההתאמות עם מקדם מתאם (r²) < 0.99. שקול את היחס של פואסון עבור חומר בלתי דחוס לחלוטין: = 0.5 ואת הגיאומטריה של indenter נתון על ידי היצרנים.
   הערה: השתמש ב-100 ננומטר הראשונים מנקודת המגע של עקומת ההעמסה כדי שההתאמה תהיה רגישה ככל האפשר למכניקה של דופן התא וכדי להפחית את ההשפעה של לחץ הטורגור על ערכי המודולוס של יאנג הנראה⁸. ההתאמה נעשתה באמצעות תוכנית MATLAB מותאמת אישית (זמינה על פי בקשה אישית בכתב ל- J. C. B) המאפשרת קביעת עומק כניסה ספציפי מנקודת המגע של עקומת ההעמסה.
2. צור היסטוגרמה מנורמלת עם נתוני המודולוס של יאנג לכאורה והתאם אותה להתפלגות גאוסית. השליכו נקודות נתונים מחוץ לרווח בר-סמך של 95% וחשבו מחדש הן את ההיסטוגרמה והן את ההתאמה של גאוס. חשב ודווח על הממוצע וסטיית התקן של המודולוס של יאנג לכאורה.
3. קבע את משמעות ההשוואות בין קבוצות על ידי מבחני השוואה מרובים כמו ANOVA.

Results

ניסויי כניסת כוח
הטקסט הבא מציג כמה תוצאות הצפויות כאשר נערך ניסוי כניסת כוח כדי להראות את הפלט האופייני לצפות כאשר הפרוטוקול מבוצע היטב.

עקומות תזוזת כוח
חלקות כניסת כוח מייצגות שהתקבלו בהסטת דגימות חיות במיקום הממוקם במרכז התא של אזור התא של התא של התא של אזור התא של השורש מוצגות באיור 2. כאשר קצה ה-AFM מתחיל להסיט פנימה את פני השטח של דופן התא, הכוח מתחיל לגדול (מסומן על-ידי 1 באיור 2A) בגלל ...

Discussion

מכניקת התאים ודפנות התאים הופכת רלוונטית יותר ויותר כדי לקבל תובנה לגבי האופן שבו מכניקה משפיעה על תהליכי גדילה. כאשר כוחות פיזיקליים מתפשטים על פני מרחקים ניכרים ברקמות מוצקות, חקר השינויים בתכונות הפיזיקליות של דופן התא וכיצד הם חשים, מבוקרים, מכוונים ומשפיעים על צמיחת הצמח הופכים לתחום מחקר חשוב ^2,3,8.

מוצגת כאן שיטה לחקר התכונות הפיזיקליות של דופן התא של תאים באזור ההתארכות של שורש הערבידופסיס. ני...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)			מכילה נתרן כלורי וחוצץ פוספט ופותחה כדי למנוע הלם אוסמוטי ולשמור על מאזן המים בתאים חיים.
תוכנת AFM	Bruker, Billerica, MA, ארה"
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)	זרז BioScope, Bruker, Billerica, MA, ארה"
מחזיק בדיקת זרז-נוזל	Bruker, Billerica, MA, ארה"	CAT-FCH	מחזיק בדיקה עבור זרז Bioscope, המיועד להפעלת נוזל במגע או במצב הקשה.  תואם גם להפעלה אווירית.
אוסמומטר קריסקופי; דגם OSMOMAT 030	Gonotech, ברלין, גרמניה
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	ריכוז מקורי, (1962)
מיקרוסקופ הפוך אופטי המחובר ל-AFM	Olympus IX81, מיאמי, פלורידה, ארה"ב
PEGAMIL	Anaerobicos S.R.L., בואנוס איירס, ארגנטינה	100429	דבק סיליקון ניטרלי, לא חומצי
צלחות פטרי	Deltalab	200201.B	פוליסטירן, 55 x 14 מ"מ, קרינה סטרילית.
Propidium iodide	Sigma	P4170	לבדיקת כדאיות שורש.
בדיקת סיליקון ניטריד, DNP-10, שלוחה A	Bruker, Billerica, MA, ארה"ב	DNP-10/A	למיקרוסקופיה של אפנון כוח בפעולה נוזלית. רדיוס קצה בדיקה של 20-60 ננומטר. 175-μ שלוחה משולשת באורך M,  עם קבוע קפיץ של 0.35 N/m.
פינצטה	סיגמא	T4537