הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

פעילות אנטי-ויראלית הקשורה לטתרין מושרית על ידי אינטרפרון-α, והיא מורכבת מקשירה מבוססת חלבון, מה שמוביל לשמירה של וירוסים שנוצרו במלואם על משטחי תאים נגועים¹. הצורך בגליקוזילציה של טטרין בעיכוב שחרור הנגיף עדיין אינו ודאי, מה שמרמז על החשיבות של דפוסי גליקוזילציה על גליקנים המבוטאים באופן רקומביננטי עבור מחקרים במבחנה ^1,2, אשר תלוי בקונפורמציה של (במקרה של נגיף שפעת) השפעת המגלוטינין HA ^3,4 . צוין כי שינוי של אוליגוסכריד הקשור לגליקוזילציה הקשורה ל-N מספיק להגבלה בתיווך תרין של שחרור HIV מסוג 1², בעוד שדמריזציה ממלאת תפקיד חיוני במניעת שחרור הנגיף, ובכך מערבת את תחום הטרנס-ממברנה או גליקוזיל-פוספטידיל-אינוזיטול (GPI)-עוגן לקשירת הוויריונים הניצנים⁵ . תכונות ייחודיות מתוארות עבור טתרין אנושי ומורין כדי לחסום וירוסים עטופים מרובים, רטרו-וירוסים, ופילו-וירוסים. BST-2/tetherin הוא חלבון אנטי-ויראלי הניתן לאינטרפרון של מערכת החיסון המולדת^1,6, הפועל עם פעילות אנטי-ויראלית רחבת טווח ונוגד אנטגוניזם על ידי גליקופרוטאינים מעטפת⁵ כדי לבצע טרנסלוקציה של טטרין או לשבש את המבנה של ת'רין ⁶. לדוגמה, גליקופרוטאין HA של מעטפת המבוטא על פני השטח ונוירמינידאז על נגיף שפעת A ידועים באנטגוניזם של טטרין באופן ספציפי לזן⁷, מה שמקל על זיהוי אתרי קשירת קולטן מארח⁸. נוגדנים המכוונים לגליקן נחקרים בסטויכיומטריה של יחסי הגומלין שלהם עם מגני הגליקן המותאמים אישית במהירות ב-HA, וכתוצאה מכך נוצרת זיקה לתת-סוגים שפעת A H3N2 ו-H1N1⁴.

כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה בין חומרים אנטי-ויראליים לבין קוצים במעטפת הנגיף, כלומר ליגנדות פחמימות, ושיטות אימונולוגיות וספקטרוסקופיות משלימות, מסונתזים כימית מונו, די-די-מנוז ותלת-מנוז. הפפטידים המנוזילים נוצרים באמצעות אזידו גליקוזילציה של גליקוזיל {בטא}-פראצטטים לטרנספורמציה של 1,2-טרנס גליקוזיל אזידים⁹, המחקה את ה-N-אצטיל גלוקוזאמין ואוליגוסכרידים עתירי מנוז על פני השטח של וירוסים מסכני חיים. ביואיזוסטרים של טריאזול משמשים לחיקויים של קישורים היוצרים את השאריות המנוזיליות של פפטיד HA¹⁰ ומאפשרים אינטראקציות ספציפיות לאתר עם נגזרות CV-N אנטי-ויראליות סביב נקודת הגליקוזילציה השנייה הקשורה ל-N בתחום ראש ה-HA (HA למעלה עם 4 גליקנים מקושרים N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . אינטראקציות בין חומצה גלוטמית (Glu) וארגינין (Arg) לבין דיפול הסליל שנוצר ביטאו יציבות טובה של פפטידי המודל ושל חלבונים, אך הן מוצגות באמצעות SPR. אם משווים אותו לזיהוי אתר גליקוזילציה מסונתז כימית יחיד ב-HA¹⁰ על ידי עיכוב ישיר של קשירת קולטן על הגליקן, הוכחה זיקה גבוהה יותר של מבנה Fc בעל מוטציה של ארבעה אתרים לקולטן שלו כמעוררת פונקציות אפקטים in vivo, וחושפת את ההרכב הלא קשור של גליקנים מקושרים N המחוברים למוטציה של Fc כדי לקבוע באופן מכניסטי¹³.

CV-N מציג פעילות אנטי-ויראלית נגד HIV 14,15, שפעת¹⁶ ונגיף האבולה, המתווך על ידי קשירת ננומולר לשינויים אוליגוסכרידיים עתירי מנוז על חלבוני ספייק מעטפת^12,17,18,19. קשירת שפעת HA לאתר קשירת פחמימות אחד בעל זיקה גבוהה (H) ב-CV-N או בשני Hs ב-CVN2 דימרי מקושר קוולנטית נקבעת כבעלת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (K D) = 5.7 ננומטר (איור 1A) ו-K_D = 2.7 ננומטר, בהתאמה. גם CV-N וגם CVN2 מכילים עוד אתר אחד או שניים של קשירת פחמימות בעלות זיקה נמוכה (L)^{s 12,17,20,21}. אבולה GP1,2 נקשר ל-2H של CVN2 עם זיקות בתחום הננומולרי התחתון (K_D = 26 ננומטר). CV-N WT מחייב לאבולה GP1,2 ו- HA מציג זיקות מ- K D = 34 nM ל- K_D = 5.7 nM (A / New York / 55/04)¹². לקטינים, כגון CV-N, המכוונים באופן ספציפי לגליקנים עתירי מנוז על מעטפות הנגיף, מעכבים עוד יותר את השכפול של נגיף הפטיטיס C, SARS-CoV, נגיף ההרפס, נגיף מרבורג ונגיף החצבת²².

מולקולת CV-N הקטנה נחקרה ביסודיות במשך יותר מ-20 שנה, שכן היא מתפקדת כדי לקשור מגוון רחב של נגיפים כדי לעכב את כניסת הנגיף^16,18. ניתוחים מבניים ומבחני זיקה מקשרים מצביעים על קישור צולב של שני Ls בדימר CVN2 שהוחלף על ידי קשירה דו-ערכית בטווח המיקרומולרי כדי להגביר את ההתלהבות לגליקופרוטאינים של מעטפת נגיפית^10,19. קשירה סלקטיבית של Manα1-2Manα על זרועות Man(8) D1D3 ו-Man(9) כוללת שני אתרי קשירה בעלי זיקות שונות הממוקמים על פרוטומרים של חלבונים מנוגדים²⁰, ובכך מגיעים לזיקות קשירה ננומולריות (איור 1B). לפיכך, CVN2 נחשב לנוגדן פסאודו בנוגע ליישומו לקשירת אפיטופים על HIV gp120, בדומה לנוגדנים מנטרלי וירוסים¹⁷. כאן, המחבר מעוניין לחקור את הקשירה הפוטנציאלית של CVN2 לספייק SARS-CoV-2 באמצעות תחום קשירת הקולטן שלו (RBD). עקומות קשירה של אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי משותק (ACE)-2 עם SARS-CoV-2 RBD התוצאה K_D = 4.7 nM עבור אינטראקציה מחייבת רלוונטית ביולוגית זו²³.

לעומת זאת, מחלקות אימונוגלובולינים נבחרות מזהות תבניות חלבונים מבניות ספציפיות ועקביות, המקנים מצע להבשלת זיקה באזורי HA²⁴ המעוגנים בממברנה. CV-N מראה פעילות חזקה מאוד כמעט בכל נגיפי שפעת A ו-B¹⁶, והוא חומר אנטי-ויראלי המנטרל באופן נרחב. הידע שלנו אינו שלם על מיקומם של אפיטופים ממוקדים על הגבעול של HA1 ו-HA2 שעשויים לערב מבנים אפיטופיים למיקוד גליקן על ידי נוגדנים מנטרלים מאוד ובהשוואה לקשירת לקטין²⁵.

איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת SPR עבור CV-N לקפיצות מעטפת הנגיף. (A) בדיקת SPR לקשירת CV-N לליגנד: חלבון HA באורך מלא (90 kDa). ערכת נתונים קינטית (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) המציגה כריכה כפולה בזמן אמת לשפעת HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 גרסה V2 נקשרת לליגנד DM משותק בטווח ריכוז של 500 ננומטר עד 16 מיקרומטר. רצף: שאריות L מודגשות בצהוב. שאריות H מודגשות באפור. E58 ו-R73 הם תחליף לציסטאינים בחלבון ה-wildtype והופכים את V2 לקפל חלבון יציב עם שלושה במקום ארבעה קשרים דיסולפידיים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בעוד שמגן הגליקן בחלק העליון של HA הדיסטלי של הממברנה גורם לקשירת זיקה גבוהה ל-CV-N 12, קשירת CVN2 ל-HA הסמוכה לגשר דיסולפיד של החלק העליון של HA נצפתה גם באתרי הזיקה הנמוכה שלו^10,12. אינטראקציות קוטביות שונות ואתרי אינטראקציה מזוהים בקשירת פחמימות על ידי CV-N. אינטראקציות אלה מאומתות על ידי יצירת וריאנטים נוק-אאוט באתר הקשירה כדי לתאם זיקות קשירה לגליקוזילציה חזויה בסיליקו ¹². לפיכך, הפרויקט שואף להשוות פפטידי HA שעברו מנוזילציה כימית שנבדקו בעבר בזיקה ובספציפיות מחייבת עם רצפי פפטידים קצרים מקוצים הקשורים לסארס 2019-nCoV ו- SARS-CoV-2, המתרחשים באופן טבעי על ידי מספר קטן של אתרי גליקוזילציה שונים המקושרים ל- N וגליקוזילציה מקושרת O. באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים ומבחני קשירה, פינטו ועמיתיו מדווחים על נוגדן חד-שבטי, S309, שעשוי לזהות אפיטופ על חלבון ספייק SARS-CoV-2 המכיל גליקן שמור בתוך תת-הסוג Sarbecovirus, מבלי להתחרות בחיבור הקולטן²⁶. הפרוטוקול של מחקר זה מתאר כיצד תכנון, הבעה ואפיון של וריאנטים של CV-N חשובים כדי לחקור כיצד CV-N ו-CVN2 נקשרים לחלבונים מסוכררים ולפפטידים מאנוסילטים סינתטיים באמצעות טכנולוגיית SPR^10,12.

דימר CVN2L0²⁷ וגרסאות של אתר קשירה (V2-V5) מבוטאים באופן רקומביננטי וריאנטים הם עם תחליפי קשרים דיסולפידיים (C58E ו-C73R) (איור 2A). כמו כן, מוטציה עם מוטציה חד-נקודתית E41A מוכנה מכיוון שתנוחה זו נתפסה כשאריות של מגע צולב בין-מולקולרי. מוטציה זו היא מולקולה מעניינת נוספת למדידות קשירת SPR בין הלקטין לאוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה המפענחת תחומי קשירה ומאפשרת השוואה לצורה הדימרית. המבנה הגבישי המוחלף בתחום של CVN2 מראה מקשר גמיש, המשתרע בין 49 ל-54 שאריות. שני התחומים יכולים להמשיך לנוע סביב הציר כגופים קשיחים, ולפתח מונומר באמצעות אינטראקציות תחום תוך-מולקולריות (תחום A -שאריות 1-39;90-101- עם תחום B -שאריות 40-89) או דימר על ידי החלפת תחום בין-מולקולרי [תחום A (של המונומר הראשון) עם תחום B (של השני), ותחום B (של המונומר הראשון) עם תחום A (של העותק השני)]. אין אינטראקציות קרובות בין תחומי A ו-B של שני הפרוטומרים, למעט Glu41²⁸. ניתן לפתח את הגן עבור CV-N בשיטת PCR חוזרת עם אוליגוס מסונתז 40-mer²⁹ ולאחר מכן הוא משויך לאתרים NdeI ו- BamHI של pET11a לטרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים כפי שתואר על ידי Keeffe, J.R.27. החלבון, המשמש להשגת המבנה הגבישי המתאים (PDB ID 3S3Y), כולל תג טיהור N-terminal 6-histidine ואחריו אתר ביקוע פרוטאז פקטור Xa. מוטגנזה מכוונת אתר משמשת ליצירת מוטציות נקודתיות, להחלפת קודונים ולהוספה או מחיקה של בסיסים או קודונים בודדים או מרובים להחלפת חומצות אמינו. טרנספורמציות אלה מספקות תובנה שלא תסולא בפז לגבי תפקוד ומבנה החלבון. CV-N, CVN2 ו-CVN3 עם ביטוי רקומביננטי וטיהור רקומביננטי נחקרו היטב מבחינה ביופיזית^20,21,27, הם זולים לייצור^, ולכן משמשים לאפיון מבחני קשירה לגליקנים המשותקים על שבבי חיישן SPR. בדיקה חיסונית קונבנציונלית הקשורה לאנזים (ELISA) מספקת פחות יכולת שכפול בנוגע לטכניקת האימוביליזציה של ליגנדות גליקן והופכת קשירה בזמן אמת של גרסאות שונות של אתרי קשירה, המוצגת עבור SPR, למבחני נקודות קצה.

וריאנט זיקה מחייבת CVN2L0-V2 (קפל שלם של CV-N הומודימרי עם החלפת גשר דיסולפידית¹⁰) מבוטא בתג שלו ב-Escherichia coli (E. coli), מטוהר מעל עמודת Ni-NTA תוך שימוש בכרומטוגרפיית זיקה ונבדק לקשירת HA (H3N2), פפטיד HA-פפטיד מונומנוזילי ופפטיד דימנוזילי באמצעות SPR. פפטידים מנוזיליים כימית, או חלבון HA ו-S, כולם ליגנדים ואמינים המוצמד למשטח השבב ההידרופילי באמצעות אסטרים תגובתיים או הנדסת חלבונים ביוטין-סטרפטאווידין. אותו הליך של ריצות עוקבות מוחל על ליגנדות אלה, המזריקות דילולים שונים של CV-N וריאנטים של CV-N (ו- CVN2) כדי לקבל מידע קינטי עבור ניתוחי האינטראקציה המולקולרית כמתואר להלן³⁰. שבב חיישן SPR משותק RBD משמש לקשירת מחקרים על פפטידי CV-N ל-S, והזיקות מושוות לקשירת SARS-CoV-2 עם ACE2 האנושי.

עבור המחקר הנוכחי, חלבון היתוך דמוי יוביקוויטין קטן (SUMO) של CVN שימש בבדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים במקום CV-N והוא מתאים לבדיקות מבוססות תאים. שפעת רקומביננטית באורך מלא חלבון HA H3 מתקבל באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) או מבוטא בקווי תאים HEK293 של יונקים ובתאי חרקים נגועים ב-baculovirus על פי פרוטוקולים סטנדרטיים¹². חלבון הספייק של ווהאן-1 מתבטא בתאי HEK293 של יונקים. הסינתזה של פפטיד מונומנוזילי (MM) ופפטיד דימנוזילי (DM) מאפשרת זיהוי של ליגנדות הומוגניות ל-CVN2 ולמולקולה קטנה מונומנוזילית¹⁰.

1. יצירת מבני CV-N

1. עבור כל אחת מגרסאות CVN2 וחלבון CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), קבל את מבנה הגן עם רצף מוביל pelB מסוף N ואת התג שלו בווקטור pET27b(+) ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים, קובץ משלים 1).
2. השג CVN2L0 וגרסאותיו (V2, V3, V4 ו- V5; איור 2A,C) ברקע של גן בתבנית CVN2L0 המורכב משני רצפי דנ"א נפרדים עבור כל CV-N חוזר.
3. ממיסים את הדנ"א הפלסמיד הליופילי במים מזוקקים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (ddH₂O) לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרול.

2. הכנת צלחות LB-agar עם תאים מותמרים של DNA פלסמיד

1. הכינו את מדיום התרבית LB-Lennox על ידי המסת 10 גרם/ליטר של פפטון, 5 גרם/ליטר של תמצית שמרים ו-5 גרם/ליטר של NaCl ב-ddH₂O (ראו טבלת חומרים), והתאימו את ה-pH ל-7.4. בצע את הטרנספורמציה ל- E. coli BL21 (DE3) מוכשר עבור כל גרסה (V2-V5) בשיטה כימית בעקבות דוח¹⁰ שפורסם בעבר.
2. לפצל את התמיסה (900 μL ו- 100 μL), להעביר 100 μL על לוחות LB-agar (50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin), ולהשתמש בעדינות מפזר תאים סטריליים. לדגום את צלחות אגר לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

3. שיבוט

1. החלף את הגן עבור CV-N לאתרי NdeI ו- BamHI של pET11a (ראה טבלת חומרים) לצורך טרנספורמציה (אלקטרופורציה) לתאים אלקטרו-מוכשרים לאחר הפניה²⁷.

4. מוטגנזה מכוונת אתר

1. כדי ליצור CVN2L0²⁹ ומוטציה CVN-E41A ברקע של גן תבנית CVN2L0 המכיל שני רצפי DNA מובחנים עבור כל CV-N חוזר²⁷.
2. צור מוטציות באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת אתר (ראה טבלת חומרים) ופריימרים מוטגניים ספציפיים 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ו-5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' להפעלת PCR³¹.
   1. התחל סדרה של תגובות דגימה באמצעות ריכוזים מרובים של תבנית דנ"א דו-גדילי (dsDNA) הנעה בין 5-50 ng (לדוגמה, 5, 10, 20 ו-50 ng של תבנית dsDNA). שמור על ריכוז פריימר קבוע.
      הערה: תערובת ה-PCR ופרוטוקול המחזור התרמי משמשים בדרך כלל כמתואר במדריך ההוראות של ערכת המוטגנזה^{המכוונת לאתר 32}.
3. הוסף את אנזים ההגבלה Dpn I (1 μL, 10 U/μL, ראה טבלת חומרים) מתחת לשכבת העל של השמן המינרלי. ערבבו תגובות ביסודיות ובעדינות, סובבו כלפי מטה במיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך דקה אחת, ודגרו מיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לעיכול ה-dsDNA המוגף-על ההורי.

5. טרנספורמציה של תאי חיידקים

1. הפשירו בעדינות את התאים הסופר-מוכשרים של XL1-Blue (ראו טבלת חומרים) על קרח. כדי להפוך כל תגובת בקרה ודגימה, aliquot את התאים supercompetent (50 μL) לצינור פוליפרופילן תחתון עגול מראש (14 מ"ל).
   1. העבר 1 μL של הדנ"א החד-גדילי שטופל ב- Dpn I (ssDNA) מכל תגובת בקרה ודגימה (ssDNA שעבר מוטציה) כדי להפריד בין אליקוטים של התאים העל-טבעיים, אשר מסנתזים את הגדיל המשלים. סובבו בזהירות את תגובות הטרנספורמציה כדי לערבב ולדגור את התגובות על הקרח במשך 30 דקות.
      הערה: לפני העברת הדנ"א המטופל ב-Dpn I לתגובת הטרנספורמציה, מומלץ להסיר את כל השמן המינרלי שנותר בזהירות מקצה הפיפטה. כבקרה אופציונלית, יש לבדוק את יעילות הטרנספורמציה של התאים הסופר-מוכשרים XL1-Blue על ידי ערבוב 0.1 ng/μL של פלסמיד הבקרה pUC18 (1 μL) עם aliquot של 50 μL של התאים העל-מוכשרים.
2. יש למרוח את פעימת החום על תגובות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 42°C למשך 45 שניות, ולאחר מכן להניח את התגובות על הקרח למשך 2 דקות.
   הערה: פולס החום המיושם כבר עבר אופטימיזציה לתנאים שהוזכרו בצינורות פוליפרופילן עם תחתית עגולה (14 מ"ל).
3. הוסיפו 0.5 מ"ל של ציר NZY+ (המכיל לליטר: 10 גרם של אמין NZ (קזאין הידרוליזט), 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, 12.5 מ"ל של 1 M MgCl 2, 12.5 מ"ל של 1 M MgSO₄, 10 מ"ל של₂ M גלוקוז, pH 7.5, וחומם מראש ל-42 °C) ודגרו את תגובות הטרנספורמציה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-225-250 סל"ד למשך שעה אחת. צלחת את הנפח הנכון של כל תגובת טרנספורמציה (5 μL מטרנספורמציית פלסמיד בקרה; 250 μL מטרנספורמציית דגימה) על לוחות אגר LB-אמפיצילין.
   הערה: עבור בקרות הטרנספורמציה והמוטגנזה, יש לפזר תאים על לוחות אגר LB-אמפיצילין בעלי 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוזיד (X-gal, 80 מיקרוגרם/מ"ל) ואיזופרופיל-1-תיו-β-D-גלקטופירנוזיד (IPTG, 20 mM) (ראו טבלת חומרים). לחסן 50 מ"ל של תרביות התאים עם מושבה אחת של E מותמר. תאי קולי לטיהור דנ"א פלסמיד שעבר מוטציה לצורך ניתוחים. מוטגנזה מאושרת על ידי ריצוף DNA במתקן חיצוני.

6. ביטוי וטיהור חלבונים

1. עבור תרבית בקנה מידה גדול, לחסן כמות קטנה של LB (המכיל אמפיצילין) עם מושבה אחת מן הלוח מותמר.
2. באמצעות תרבית הלילה, לחסן את תרבות הביטוי עם תוספים, כגון 10 mM של MgCl₂, 10 mM של MgSO 4, ו 20 mM של גלוקוז_, דילול תרבות הזרעים ל 1/100.
   1. לגדל תאים עם רעידות נמרצות ב 37 מעלות צלזיוס. לגדל תאים ל-Abs 600 ננומטר בין 0.4-0.6 (שלב אמצע הלוג) לפני קירור התאים ל-20 מעלות צלזיוס. השרה עם 1 mM IPTG ולגדול בן לילה.
   2. לאחר מכן, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
3. יש להשעות את כדור התא במאגר מי מלח עם אגירת פוספטים (PBS) ולבצע צנטריפוגה מחדש ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את supernatant עם פיפטה. יש להשעות את הגלולה הנותרת ב-10 מ"ל של חיץ ליזה ולדגירה של המתלים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: הרכב של מאגר ליזה: (50 mM של NaH 2 PO₄, 300 mM של NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/mL של ליזוזים, 1 mM של פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF), 1 mM של dithiothreitol, 1 mM של MgCl₂, pH 8, ראה טבלת חומרים).
   1. מעבירים את התערובת לשני מחזורי הפשרה בהקפאה (-80°C). הפרד שברים מסיסים ובלתי מסיסים על-ידי צנטריפוגה ב-4,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ונתח אותם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE), בפרט, נתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE³³ (איור 2B,C).
      הערה: תאים יכולים להיות lysed במספר דרכים, כגון הפשרה הקפאה, סוניקציה, הומוגניזציה, תזה אנזימטית, או שילוב של שיטות אלה. טיהור מגופי הכללה מומלץ לאיסוף תפוקות חלבון גבוהות²⁶.
4. טהרו חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית עמודה Ni-NTA (ראו טבלת חומרים). טען את החלק המסיס על עמודת חרוזים Ni-NTA מתחדשת (1 מ"ל/דקה). שטפו את המערכת עם חיץ TBS (50 מ"מ של טריס, 150 מ"מ של נתרן כלורי, pH 7.5) לפני תחילת שיפוע (0-100% 500 mM imidazole ב- TBS מעל 60 דקות) ואיסוף שברים (1 מ"ל לדקה). דיאליזה של החלבונים המטוהרים לאפיון ביוכימי כנגד PBS של 100 mM (איור 2C,D).
5. לחלופין, השתמש בג'ל זיקה His-Select Ni 2+ (ראה טבלת חומרים) בצינורות של 14 מ"ל כדי לקשור ולהשעות מחדש את CV-N המתויג שלו באופן רקומביננטי בתמיסות חיץ עם 20 mM imidazole ו-²⁵⁰ mM imidazole, בהתאמה. דגירה באצווה במשך 30 דקות לפחות.
   הערה: החל חלבונים מטוהרים למחצה אלה על עמודה חד-פעמית ארוזה מראש להחלפת חיץ וניקוי של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, פחמימות וחלבונים, שיכולים לטעון 1-1.5 מ"ל מ-eluate מכרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת.
6. העבירו את תמיסות החלבון לצינורות צנטריפוגה באמצעות מסנן חיתוך של 10 kDa (ראו טבלת חומרים) ורכזו אותן על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4,500 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס. למדידות SPR, החלף את תמיסות האנליטים ל- 10 mM HEPES, 150 mM נתרן כלורי, 3 mM חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA), ו- 0.05% Tween20, pH 7.4 (HBS-EP(+), ראה טבלת חומרים).
   1. הוסף את מאגר הריצה SPR זה למקדם דילול של 1:10 וצנטריפוגה ארבע פעמים לנפח ההתחלתי למשך 10 דקות ב- 4,500 x g ו- 4 °C.
7. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop UV-Vis (ראו טבלת חומרים) בהתבסס על מקדם ההכחדה המחושב (20,440 ^{M-1 cm-1}) עבור החלבון העיקרי CVN2L0 המציג גודל של 23,474 Da³⁴. השתמש ב-PBS (100 mM, pH 7.0) או במאגר SPR כריק, ומדוד את ריכוז החלבון בשלושה שלבי דילול (1:1, 1:10 ו-1:100).

איור 2: רצפי CV-N והבעה . (A) CVN2 ללא קישור בין כל חזרה של CV-N (101 חומצות אמינו כל אחת) וארבעה גשרים דיסולפידיים מבוטא בווקטור pET11a ב-E. קולי. (B) ביטויים של שתי מושבות עצמאיות עבור CV-N (מונומר) ו-CVN2 (דימר). (C) גרסאות הקשר הדיסולפידיות מטוהרות ומנותחות ב-SDS-PAGE. סמן משקל מולקולרי נמוך (6 μL) משמש כהפניה. WT = CVN2L0 הנושא ארבעה גשרים דיסולפידיים כפי שמסומנים ב-(A). V2 הוא גרסה עם החלפת קשר דיסולפידית על ידי שאריות קוטביות בעמדות 58 ו-73. V3-V5 הן גרסאות עם שני קשרי S-S שנותרו וקוטביות (C58E-C73R) או לא-קוטביות (C58W-C73M) המחליפות חומצות אמינו או שילוב של תחליפי זוגות שאריות אלה. (D) כרומטוגרמות HPLC של CVN2L0 מטוהרות מלוטות בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה עם שיפוע ליניארי מ-5%-65% מאגר B במאגר A מעל 30 דקות. חיץ A הוא: 0.1% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית ב-ddH₂O, חיץ B הוא: 0.08% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית באצטוניטריל. חלבון מנותח על עמוד ג'ל סיליקה בעל ביצועים גבוהים 300-5-C4 (150 x 4.6 מ"מ) ב-214 ננומטר ו-280 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

7. ספקטרוסקופיית SPR

1. השתמש במערכת SPR דו-ערוצית (ראה טבלת חומרים) עם מאגר פועל HBS-EP(+) ו-10 mM גליצין HCl pH 1.5-1.6 כמאגר ההתחדשות. הפעל את המכשיר, degasser, דוגם אוטומטי, משאבה ולשטוף את המערכת כולה עם ddH₂0 במשך 1 שעות. יש להניח את מאגר ההפעלה המוכן לשימוש בבקבוק נפרד.
2. יש להפיל שמן אמרסיה על הגלאי ולהרכיב שבב חיישן זכוכית (ראו טבלת חומרים) המצופה בסרט זהב דק ובצדו העליון מתפקד עם הידרוג'ל קרבוקסימתילדקסטרן ישירות על הגלאי שמתחת לתא הזרימה בעל שלוש היציאות. תקן את ההגדרה על-ידי משיכת הטיפול כלפי מטה.
   הערה: C19RBDHC30M 200 ננומטר סטרפטווידין נגזר קרבוקסימתילדקסטרן הידרוג'ל עם צפיפות בינונית של ביוטינילציה תסמונת נשימתית חריפה חמורה coronavirus-2 חלבון RBD, הוא שבב חיישן מוכן לשימוש עם ליגנד משותק מראש.

8. בדיקת קשירת SPR לקשירת CV-N ל-HA, חלבון S ו-RBD

1. שיתקו את הליגנדות החלבוניות לשבבי חיישנים לפי השלבים הבאים.
   1. פתח טבלת הפעלה על ידי לחיצה על טופס בשורת התפריטים והפעל עורך טבלאות בתוכנת SPRAutoLink המשולבת (ראה טבלת חומרים). בחר ולחץ על BASIC_Immobilization מרשימת טבלאות ההפעלה הזמינות ובצע את השלבים של ההליך הניסויי על מסך המחשב. עורך הדוגמאות המתאים שבו נעשה שימוש מוצג בפינה השמאלית העליונה.
   2. לחץ על עורך ערכת דוגמאות במקטע טופס כדי למלא את רשימת הריאגנטים עבור שני ארונות תקשורת הממוקמים בדוגם האוטומטי לניתוחים נוספים. לחץ על Autosampler Direct Control כ"כלי" בשורת התפריטים כדי להחזיר את המדפים קדימה או אחורה. בחר 4 °C כטמפרטורת ההפעלה.
      הערה: תוכנת SPR מאפשרת "שליטה ישירה במכשיר SPR" ו"שליטה ישירה במשאבה " באמצעות בחירת הכלים המתאימים, כמו גם טיפול בדגימה אוטומטית, ועל ידי לחיצה על טופס; ניתן גם להפעיל את עורך הטבלה, מתווה הנתונים או לאחר העיבוד כדי לבצע ניתוח נתונים. הקבצים נשמרים ישירות בספריית ברירת המחדל ומיוצאים כ- scrubber.files מהחלון שלאחר העיבוד.
2. הפעל את המשאבה כדי להחדיר ddH₂0 על ידי לחיצה על כלים ושליטה ישירה משאבה ולהקליט נתונים על ידי לחיצה על SPR מכשיר שליטה ישירה, ובכל פעם התחל בחלונות החדשים שהופיעו. שים את ריאגנטים צימוד (שלב 8.3) בבקבוקונים 300 μL, לשים אותם לתוך מדפי autosampler ולהתחיל את שולחן ההפעלה על ידי לחיצה על הפעלה.
   הערה: משטחי השבב מותנים ב-pH 9.0 של חיץ גליצין של 10 mM או שהם נשטפים ב-1 M נתרן כלורי, 0.1 M נתרן בוראט בופר pH 9.0 כדי למצב משטח שבב שמקורו בקרבוקסיל עבור תערובת הפעלה EDC/NHS³⁰.
3. עבור אינטראקציה פשוטה זו בין חלבון לחלבון, השתמש בשבב CMD500D (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור יחידות אינדקס מיקרו-שבירה (μRIU) = 2500 - 3000 תא זרימה עם HA משותק ו- μRIU = 400 תא זרימה עם חלבון ספייק. בקצב זרימה של 15 μL/min, להזריק תערובת מימית ושווה של 0.4 M N-אתיל-N'-(דימתילאמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC*HCl) ו-0.1 M N-הידרוקסיוקסינימיד (NHS) על ידי יישום הצעדים הרציפים הבאים.
   1. מילוי מחדש של משאבת המילוי ב-25,000 μL/min, בצע התאמה בסיסית למשך 30 שניות, הזרקת 90 μL של תמיסת הפעלת דגימה (EDC/NHS) במשך 6 דקות זמן מגע, ולאחר מכן החזק למשך 5 דקות נוספות.
   2. חזור על מחזור זה לאחר שקו הבסיס פועל במשך דקה אחת ב-10 μL/min רק על תא הזרימה השמאלי (כחול) כדי להזריק ולשתק פפטידים מסונתזים כימית¹⁰, HA וחלבון ספייק ב-20 מיקרוגרם/מ"ל, ולאפשר את התאמת הבסיס הבאה עם ddH₂O למשך 1.5 דקות לפני המרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5.
4. החלף את הצינורות מהדוגם הנוזלי לדגה מ- ddH₂0 לבקבוק עם HBS-EP(+) (איור משלים 1).
5. נתחו את חיישני ה-SPR.
   1. כדי לבצע מחקרים קינטיים, השתמש בריכוזי אנאליטים שונים (^10-5-10-8 M), עם שלב התחדשות לאחר כל זריקה ומדידות ריקות לאחר אנליזות שונות. שנה את קצב הזרימה ל-10 μL/min והתחל בזריקות למשך 4 דקות זמן מגע, לאחר מכן 5 דקות ייצור בסיסי, ושני שלבי התחדשות של 2 דקות כל אחד עם מרווח של 30 שניות.
   2. הזריקו את תמיסת המאגר למדידות ריקות שהחיישנים שלהן מופחתים מריצות דגימה כדי לנרמל ריכוזי חלבונים שונים.
6. לחץ על טופס, גלול מטה ושנה ל"לאחר עיבוד "על ידי לחיצה על מצב פעולה זה. לחץ על הוסף כדי לבחור עקומות איגוד שנוצרו לאורך זמן בטופס התוויית הנתונים עבור כל תא זרימה, וייצא את שכבת העל כקובץ scrubber ( .ovr). לחץ על קובץ כדי לפתוח את אפשרויות שמירת הקבצים. השג עקומות תגובה על-ידי יישור עקומות לשמאל ולימין והפחתת אותות של ערוץ הייחוס השני מאלו של ערוץ הליגנד.
   הערה: הנתונים מופעלים ב"לאחר עיבוד" על ידי הגדרת חיישנים באופן חישובי. הוא מוכנס לתוך שכבה של חיישנים מתאי זרימה שמאליים וימניים, או מיוצג כסנסוגרמות מההפרש של שני הערוצים.
7. נקו את כל הנוזלים עם pH 9.5 של מאגר גליצין של 50-100 mM, מים ו-20% אתנול לפני ואחרי מדידות קשירה כדי להסיר עקבות של מלח או כל זיהום חלבוני, או מחמיר יותר, עם 0.5% SDS וגליצין.
   הערה: כדי למנוע נזק למכשיר, מומלץ לבדוק את היציבות המכנית של שבב הזכוכית לפני הכנסה מחדש של מחסנית השבב למכשיר אם השבבים אוחסנו מתחת למאגר או בלחות של 100%.

מולקולת CVN2L0 שהוחלפה על-ידי תחום דימרי נבדקת להיקשרות לאזור העליון של HA בשלושה ניסויי SPR נפרדים, וזיקת הקישור מוצגת בערכיK D. ההנחה היא שתחום B כולל אתרי קשירה H, המושפעים מהחלפת קשר דיסולפיד בשאריות יוניות, ותחום A יוצר L10,18. הזרקות בודדות של CVN2L0 וגרסאות V2 (שלושה גשרים דיסולפידיים) ו-V5 (שני גשרים דיסולפידיים) נבדקות תחילה לצורך קשירה לשבב החיישן המצומד ל-HA כדי להעריך את יכולות הקישור לפני הגדרת מדידת הקינטיקה באמצעות הדגימה האוטומטית ועורך טבלת הריצה (איור 3A ואיור משלים 2). הזרקות חוזרות ונשנות הן אוטומטיות עבור סדרה של CVN2L0, V2 ו-V5 בריכוזים שונים בתחום הננומולר והטוחנות μ במערכת לאורך זמן (איור 3B-D). בקורלציה בין מספר קשרי Cys-Cys שלמים, CVN2L0 מחייב HA משותק ב- KD = 255 nM כאשר מגיעים לרוויה טובה. במקרה זה, שני ערכיK D, המחושבים מנתונים קינטיים או על ידי התאמת נתוני שיווי המשקל לאיזותרם המחייב של Langmuir, נמצאים בהסכמה מתונה (טבלה 1 ואיור משלים 3, איור משלים 4).

איור 3: בדיקת קשירת SPR לקשירת ליגנד באמצעות אינטראקציות רב-ערכיות. CVN2 (WT) וגרסאות האתר המחייבות V2 ו-V5 עם תחליפי דיסולפידים בכיס קושר הפחמימות בעל זיקה גבוהה נבדקים לקשירת HA משותק קוולנטית. (A) ניתן לחלץ עקומות קשירה של תאי זרימה שמאליים וימניים של CVN2, V2 ו- V5 מפרוטוקול ההפעלה SPR, וחיישנים מסוכמים בשכבת-על. (B) סנסוגרמה מניסוי SPR קונבנציונלי שהוצגה כאנליזות קינטיות לקשירת CVN2L0 ל-HA, הזרקת ריכוזי אנליטים מ-10-4 ל-10-8 M. CVN2L0 נמדדת עד לריכוז הגבוה ביותר ב-1.5 מיקרומטר (שורה עליונה) ועד 500 ננומטר (שורה תחתונה), שעבורו לא מושגת רוויה על משטח השבב או קשירת שיווי משקל. RU = יחידות תגובה. נעשה שימוש בשבב חיישן CMD500D. (C) חיישן SPR לקשירת V2 ל-HA. (D) V5 מחייב ל-HA. האיור (B-D) מועתק באישור הפניה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: זיקות מחייבות של CVN2 וריאנטים ל-HA שנמדדו באמצעות SPR. Scrubber 2.0 (תוכנת BioLogic) מנוצלת כדי להתאים לעקומות שיוך SPR ודיסוציאציה בזמן אמת ולחישוב קבועי הדיסוציאציה של שיווי המשקל (KD) מנתונים קינטיים ושיווי משקל. Ka = קצב אסוציאציה קבוע. Kd = קבוע קצב דיסוציאציה.

בעוד שערכיK D לקשירת CVN2L0 ו-V2 ל-HA נמצאים שניהם בתחום הננו-מולר, V5 פוחת בכריכה (טבלה 1). ב-V5, שני קשרים דיסולפידיים מוחלפים על-ידי שאריות זיווג יונים שמפעילות מחדש אינטראקציות יוניות פוטנציאליות בין שאריות Glu ו-Arg שעברו מוטציה (איור 2A,3D). נתונים ראשוניים מנותחים בעקבות קצב השיוך המשולב וקצב משוואות הדיסוציאציה, המתארות את הקינטיקה המחייבת של האינטראקציה של CV-N מסיס עם ליגנד משותק ואת הדיסוציאציה של הקומפלקס שנוצר משטח השבב. מבוצעות שתי מדידות בלתי תלויות, ומנותחות סנסיגרמות, שוות ערך לאלה המתקבלות משכפלים. KD מחושב כמניין של koff/kon (טבלה משלימה 1)10,35. עם זאת, KD קשור לנתוני שיווי המשקל המתאימים לאיזותרם קשירת לנגמיור 36, כאשר תגובת קשירת שיווי המשקל משורטטת כפונקציה של ריכוז האנליטים (איור משלים 3A,4A,3B,4B). באופן תלוי ריכוז, קבוע קצב הדיסוציאציה kd נקבע לאחר ניתוחים ומשולב בהתאמת שלב האסוציאציה (kon) כדי להעריך את קבוע קצב השיוך ka. (לוח 1, איור משלים 3C, איור משלים 4C).

לאחר מכן, הכריכה של CV-N ל- HA מושווית לאינטראקציה שלה עם RBD. קשירת CV-N WT ל-SARS-CoV-2 RBD נמדדת בזיקה חלשה יותר (K D = 260 μM, איור 4A) בהשוואה להיקשרות ל-HA (KD = 5.7 ננומטר)8,10,12 וקשירה לחלבון S (KD = 18.6 μM, איור 5). ריכוז לעומת תגובה משורטטים עבור קשירת CV-N WT ל-RBD, בהנחה שמיקוד ספציפי של פחמימות שאולי נשמרו בתת-היחידה RBD S1 (איור 4A). אותה עלילת זיקה מוצגת עבור קשירת CVN2L0-V4 ל-DM שאינה ניתנת עוד לניתוח עקב החלפת קשרים דיסולפידיים המפריעים לקשירת זיקה גבוהה לפפטידים גליקוזילים קטנים (איור 4B).

CVN2L0-V4 (2 קשרים דיסולפידיים הפוכים להחלפה לא סימטרית של שאריות ציסטאין על ידי שאריות גלו-ארג או חומצות אמינו אמפיפתיות Trp ו-Met) יכולים ליצור רשתות קשרי מימן לא קוטביים סביב האתר המדומה B לקשירת פחמימות10. צפיפות גבוהה יותר של גליקנים על חלבון HA מגיעה להיקשרות עם שאריות Glu-Arg קוטביות במקום ציסטינים (טבלה משלימה 1), וקשר עם פפטידים מנוזילים (KD = 10 μM עבור DM) בין CVN2L0 ושינויים לתוך Glu-Arg, אך מראה דיסוציאציה לא רציפה של גרסאות מפפטיד מונוגליקוזילט זה, בפרט כאשר H משתנה על שני המונומרים. עבור האינטראקציה בין CVN2L0-V4 עם DM, התגובה של הזרקת 56 μM CVN2L0-V4 מניבה תגובה גבוהה יותר מאשר Rמקסימום. (איור 4B). V5 (2x Glu-Arg) נכשל בדיסוציאציה מ-DM הקשור לפני השטח (הנתונים אינם מוצגים). לסיכום, עקומות התגובה של ריכוזים נמוכים יורדות לפני סיום ההזרקה עבור כל החיישנים ב- CVN2 קושרים לפפטיד ללא קשירת H מקורית ומונומר ל- RBD.

איור 4: ניתוחי SPR של (A) מונומר CV-N WT המחייב ל-RBD. K D מחושב על ידי התאמת נתונים קינטיים (צד שמאל, K D = 260 μM) ומושווה לנתוני זיקה (צד ימין) באמצעות מודל ביומולקולרי פשוט לקשירת 1:1 בין ליגנד לאנליטי (K D equil = 274 μM). תגובת קשירת שיווי משקל או יכולת קשירה משורטטת כפונקציה של ריכוז בהשוואה לעקומות הקשירה SPR (0-605 μM CVN). H = אתר קשירה בעל זיקה גבוהה. L = אתר קשירה בעל זיקה נמוכה. שניהם נמצאים ב-CV-N וב-CVN2L0. (B) דימריק CVN2L0-V4 נקשר ל-DM, בהנחה של 2L ללא KD הניתן לניתוח. ריכוזי CVN2L0-V4 הם 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: מוטציה CVN-E41A ו-CV-N WT נקשרים לגליקופרוטאין (A) S. החצים מציינים את תחילת שלב האסוציאציה והדיסוציאציה. (B) קשירת CVN-E41A ל-RBD ב-SARS-CoV-2. הליגנדות משותקות מראש על שבבי חיישנים מסוג HC polycarboxylate ו-CMD500D. יחידת המשנה Covid-19 S1 [Pinto, D. et al.26; ו- Barnes, C. et al.37] משמשת לאימוביליזציה של RBD. קצב זרימה: 30 μL / min, 25 ° C; נתונים גולמיים מתווים. לשם השוואה, מתוארת קשירת נוגדנים בסרום הדם האנושי ל- RBD עם מקדם דילול של 1:200. (C) בדיקת SPR של CV-N WT הנקשרת לגליקופרוטאין S המשותקת לרמת תגובה של 400 μRIU כדי ללכוד CV-N. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הוכח בעבר כי CV-N מונומרי עם L יחיד אינו יכול לקשור מספיק gp120, אך יכולת הנטרול של CV-N דורשת קישור צולב של שני אתרי קשירת פחמימות והיא משוחזרת בעיקר על ידי דימריזציה כדי לתפקד עם 2H12,19. לפיכך, מוטציה מונומרית CVN-E41A באה לידי ביטוי, אשר חשודה כמערערת את היציבות של תחום B או יכולה להפריע לקישוריות עם התחום השני A, כמו שנמצא ב- CV-N WT. CVN-E41A מונומר חושף יציבות בעת קשירה לחלבון S בדומה למונומר CV-N. אף על פי שתגובת SPR עבור ריכוזי אנליטים של 605-680 μM גורמת ליחידות תגובה גבוהות ולחיישני SPR טיפוסיים עבור קשירת CV-N WT ו-E41A, בהתאמה, המוטציה אינה יציבה כאשר היא מדוללת (איור 5).

איור משלים 1: חיישן SPR ללכידת חיקוי DM כחלק מהחלק העליון של שפעת HA. צילום מסך: תרשים נתוני SPR המציג את פרוטוקול הריצה של SPR לאימוביליזציה של DM על שבב חיישן SPR CMD500D, המצופה בהידרוג'ל קרבוקסימתיל דקסטרן 500 ננומטר ומתאים לניתוחי קינטיקה של אנליזות בעלות משקל מולקולרי נמוך על צפיפות ליגנד גבוהה. שבבי חיישנים מותקנים ישירות על הגלאי עם שמן אמרסיה ומקובעים מתחת לתא זרימה בעל שלוש יציאות. לאחר מרווה את משטח השבב המופעל עם 1 M אתנולמין HCl pH 8.5, CVN2 מוזרק פעמיים (ריכוז = 1 μM ו 2 μM, בהתאמה). סגול: ההבדל בין תא זרימה 1 לתא זרימה 2; התגובה נרשמת במרווח של 0.2 שניות כחול: תא זרימה 1: 3000-4000 יחידות מיקרו-שבירה אינדקס שבירה (μRIU) מצופות מתמיסת 400 ננומטר של הליגנד DM למשטח קרבוקסילי מופעל. אדום: תא זרימת הפניה 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הפעלה ידנית על שבב חיישן CMD500D המתפקד על-ידי HA, המציג קשירה של CVN2L0-V5, V2 ו-CVN2L0 דימריים. בקצבי זרימת החדרה של 30-50 μL/min, CVN2L0 וגרסאות קשר דיסולפידיות המבוטאות בתג His-ומטוהרות מעל Ni-NTA מוזרקות בטווח האמצעי של μM ונבדקות לקשירת HA עם שלב אסוציאציה של 3 דקות ושלב דיסוציאציה של 2 דקות. ההזרקות הן V5 (15 μM), V2 (2.4 μM), 0 μM, CVN2L0 תת-שיבוט מחלבון פיוז'ן SUMO (1 μM), ו- CVN2L0 (2 μM). חיץ ריצה ב- pH פיזיולוגי משמש לכל הניסויים ב- 25 מעלות צלזיוס. כל התמיסות מתפרקות ומסוננות (0.2 מיקרומטר) לפני ההזרקה למערכת. סגול: ההבדל בין תא זרימה 1 לתא זרימה 2; התגובה נרשמת במרווח של 0.2 שניות. כחול: תא זרימה 1: 2540 μRIU HA. אדום: תא זרימת הפניה 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: CVN2 נקשר ל-HA. ניתוח של חיישנים כאשר עקומות מיושרות באופן אוטומטי. (A) חיישנים מאופסים ומיושרים באמצעות תוכנת Scrubber (משמאל) ואיזותרמים קושרים המציגים עקומת תגובה תלוית ריכוז לאנליטים מאוגדים (מימין). (ב) איזותרם מחייב המבוטא באחוזי קיבולת. (C) עקומות האסוציאציה התיאורטית והדיסוציאציה המותאמות באופן חישובי. (D) נתוני קינטיקה על חיישני SPR ללא עקומות מותאמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: CVN2 מחייב ל-HA. ניתוח של חיישנים כאשר עקומות מיושרות באופן ידני. (A) חיישנים מאופסים ומיושרים באמצעות תוכנת Scrubber (משמאל) ואיזותרמים קושרים המציגים עקומת תגובה תלוית ריכוז לאנליטים מאוגדים (מימין). (ב) איזותרם מחייב המבוטא באחוזי קיבולת. (C) עקומות האסוציאציה התיאורטית והדיסוציאציה המותאמות באופן חישובי. (D) נתוני קינטיקה על חיישני SPR ללא עקומות מותאמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: נתונים קינטיים המתקבלים מחיישני SPR לקשירת גרסאות הקשר CVN2L0 ו-Cys-Cys V2, V4 ו-V5 ל-HA באמצעות מודל קשירה של Langmuir 1:1. KD [M] = k כבוי/k מופעל  או kd/ka. כל הנתונים נוצרים ב-25 °C במאגר HBS-EP(+): אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

למחבר אין מה לחשוף.