מאמר שיטה

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

DOI:

10.3791/63547

⸱

21 באפריל 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של היקף עצום של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות ממלאת תפקיד חיוני בחקר הארגונים המורכבים של מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, טכנולוגיות הדמיה מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מתפתחת של הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד של חלבונים ספציפיים עם רגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית באמצעות הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) אלקטרונית המעוררת בתהודה מוקדמת של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן. שיטה זו עוקפת את הגבול של תעלות הניתנות לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמנים מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. הוא תואם בדרך כלל לתכשירי רקמות סטנדרטיים, כולל רקמות קבועות פרפורמלדהיד, רקמות קפואות ורקמות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אנו צופים שפלטפורמה זו תספק תמונה מקיפה יותר של אינטראקציות חלבונים של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור רקמות שלמות ועבות. פרוטוקול זה מספק את זרימת העבודה מהכנת נוגדנים להכתמת דגימת רקמות, להרכבת מיקרוסקופ SRS, להדמיית רקמות epr-SRS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות רקמות מורכבות מורכבות מתת-אוכלוסיות תאיות נפרדות שמיקומיהן המרחביים ורשתות האינטראקציה שלהן שזורים עמוק בתפקודים ובתפקוד לקוי שלהן 1,2. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה ולחקור את המורכבות שלה, ידע על המיקומים המרחביים של חלבונים ברזולוציה של תא יחיד הוא חיוני. לפיכך, טכנולוגיות הדמיית חלבונים מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת ויכולות להפוך לאבן פינה לחקר הביולוגיה של הרקמות 3,4,5. ניתן לסווג את שיטות ההדמיה הנפוצות הנוכחיות של חלבונים מרובבים לשתי קטגוריות עיקריות. האחת היא הדמיה אימונופלואורסצנטית סדרתית המסתמכת על סבבים מרובים של צביעת רקמות והדמיה, והשנייה היא הדמיית ציטומטריה המונית בשילוב עם נוגדנים מתויגים במתכת כבדה 6,7,8,9,10,11,12.

כאן מוצגת אסטרטגיה חלופית להדמיית חלבונים מבוססי נוגדנים מרובבים. בניגוד לשיטת ההדמיה הפלואורסצנטית הנפוצה, שיכולה לדמיין רק 4-5 ערוצים בו זמנית בשל ספקטרום העירור והפליטה הרחב (רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) ~ 500 ס"מ-1), מיקרוסקופיית ראמאן מציגה קו ספקטרלי צר בהרבה (FWHM ~ 10 cm-1) ולכן מספקת ריבוי מדרגי. לאחרונה, על ידי רתימת הספקטרום הצר, פותחה תוכנית חדשנית של מיקרוסקופיית ראמאן בשם מיקרוסקופיית קדם-תהודה אלקטרונית מגורה פיזור ראמאן (epr-SRS), המספקת אסטרטגיה רבת עוצמה להדמיה מרובבת13. על-ידי חקירת מצבי הרטט המצומדים אלקטרונית של צבעי ראמאן, epr-SRS משיג אפקט שיפור דרסטי של פי 1013 על חתכי ראמאן ומתגבר על צוואר הבקבוק הרגיש של מיקרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית (איור 1A)13,14,15. כתוצאה מכך, גבול הגילוי של epr-SRS נדחף לתת-μM, מה שמאפשר זיהוי ראמאן של סמנים מולקולריים מעניינים כגון חלבונים ואברונים ספציפיים בתוך תאים13,16. בפרט, תוך שימוש בנוגדנים מצומדים לצבעי ראמאן, הדמיית epr-SRS של חלבונים ספציפיים בתאים וברקמות (הנקראת immuno-eprSRS) הודגמה ברגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית (איור 1B)13,17. על-ידי כוונון אורך הגל של המשאבה ב-2 ננומטר בלבד, אות ה-epr-SRS יהיה כבוי לחלוטין (איור 1B), המציג ניגודיות רטט גבוהה.

בצד הגשושית, פותחה קבוצה של גשושיות ראמאן דמויות קשת בשם צבעי פיזור מנהטן ראמאן (MARS) להצמדת נוגדנים 13,18,19,20. פלטת ראמאן ייחודית זו מורכבת מצבעים חדשניים הנושאים קשרים משולשים מצומדים π (חומר משלים), שכל אחד מהם מציג שיא epr-SRS יחיד וצר בטווח הספקטרלי הביו-אורתוגונלי של ראמאן (איור 1C). על ידי שינוי המבנה של כרומופור הליבה ועריכה איזוטופית של שני האטומים של הקשר המשולש (חומר משלים), פותחו גשושיות ראמאן מופרדות ספקטרלית. תוך מינוף המולטיפלקסיות הניתנות להרחבה, מיקרוסקופיית epr-SRS בשילוב עם פלטת הצבעים MARS מציעים אסטרטגיה אופטית להדמיית חלבונים מולטיפלקס בצילום אחד בתאים וברקמות.

Immuno-eprSRS מספק אסטרטגיה חלופית לשיטות הדמיית חלבוני המולטיפלקס הנוכחיות עם חוזקות ייחודיות. בהשוואה לגישות פלואורסצנטיות עם צביעה מחזורית, הדמיה והסרת אותות, פלטפורמה מבוססת ראמאן זו מבטיחה צביעה והדמיה של סיבוב יחיד. לכן, הוא עוקף את המורכבות המעשית בהליכים מחזוריים ובמידה רבה מפשט את הפרוטוקול, ומכאן פותח טריטוריות חדשות של הדמיית חלבונים מרובבים. לדוגמה, רתימת פרוטוקול ניקוי רקמות המותאם לצבע ראמן, immuno-eprSRS הורחב לשלושה ממדים למיפוי חלבונים מרובב מאוד ברקמות עבות שלמות17. יותר מ-10 מטרות חלבונים צולמו לאורך רקמות מוח של עכברים בעובי מילימטר17. לאחרונה,הודגם גם צימוד אימונו-eprSRS עם פרוטוקול מיקרוסקופיית הרחבה אופטימלית לשימור ביו-מולקולות (ExM)21, הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ירייה אחת של מטרות מרובות. בהשוואה לספקטרוסקופיית מסות הדמיה 4,9, epr-SRS הוא לא-דיסטרוקטיבי ובעל יכולת חתך אופטית פנימית. יתר על כן, epr-SRS יעיל יותר בזמן בסריקת רקמות. בדרך כלל, אזור רקמה של 0.25 מ"מ2 עם גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר לוקח רק כמה דקות כדי לצלם עבור ערוץ epr-SRS יחיד. לדוגמה, זמן ההדמיה הכולל של ארבעה ערוצי SRS ועוד ארבעה ערוצים פלואורסצנטיים באיור 4 הוא בערך 10 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נערך בהתאם לפרוטוקול הניסוי בבעלי חיים (AC-AABD1552) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת נוגדנים מצומדים בצבע רמאן

  1. הכן את מאגר ההצמדה כ~ 0.1 M NaHCO3 במאגר PBS, pH = 8.3, אחסן ב- 4 °C (74 °F).
  2. הכן תמיסת גשושית MARS (חומר משלים) N-hydroxysuccinimidy (NHS) המתפקדת על-ידי אסטר-מתפקדת כ-3 mM ב-DMSO נטול מים. ניתן להפנות סינתזה של בדיקות MARS לדיווחים קודמים 13,17,18.
    הערה: למטרות אחסון, יש להגן על פתרון האסטר של NHS בצבע NHS מפני אור ולשמור עליו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. ממיסים את מוצקי הנוגדנים במאגר ההצמדה לריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. עבור נוגדנים המומסים במאגרים אחרים, החליפו אותם למאגר ההצמדה לריכוז של 1-2 מ"ג/מ"ל עם מסננים צנטריפוגליים.
    הערה: נוגדנים משניים בעלי ספיחה צולבת מאוד עדיפים על צביעת מולטיפלקס כדי למזער את תגובתיותם של מינים שונים. הנוגדנים המשניים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
  4. בצע את תגובת ההצמדה.
    1. עבור נוגדנים משניים, הוסיפו עודף טוחן פי 15 של תמיסת צבע לתמיסת הנוגדן בבקבוקון זכוכית באיטיות עם ערבוב. לדוגמה, בתמיסת נוגדנים של 0.5 מ"ל 2 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף תמיסת צבע של 35 μL 3 mM.
    2. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עם ערבוב במשך שעה אחת. הגן על התגובה מפני אור.
  5. טיהור.
    1. הכן את שרף סינון הג'ל (טבלת החומרים) במאגר PBS, לאחר שלבים 1.5.2-1.5.4.
    2. הוסיפו 10 מ"ל של אבקת שרף סינון ג'ל לתוך 40 מ"ל של מאגר PBS בתוך צינור של 50 מ"ל.
    3. שמור את הפתרון באמבט מים של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    4. דקאנט את הסופרנטנט והוסף מחדש PBS ל-40 מ"ל. אחסן את הסלורי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. ארזו את עמודת אי-הכללת הגודל (קוטר 1 ס"מ, עמודי זרימת כבידה) עם תמיסת ההחלקה לגובה של 10-15 ס"מ.
    6. שטפו ושטפו את העמודה בכ-10 מ"ל של מאגר PBS כדי לארוז עוד יותר את השרף.
    7. הצמידו את תערובת תגובת ההצמדה (כ-0.5 מ"ל) לטור. הוסף מיד 1 מ"ל של מאגר PBS כמאגר elution כאשר כל תערובת התגובה נטענת. כל הזמן מלאו מחדש את מאגר האלוטיון (PBS) לעמודה.
    8. אספו את ההתרוממות של תמיסת ההצמדה על ידי התבוננות בצבע העמוד (לצבעי MARS יש צבעים ירוקים בהירים עד כחולים) או למדוד את הספיגה ב-280 ננומטר (A280).
  6. ריכז את התמיסה שנאספה ל-1-2 מ"ג/מ"ל באמצעות מסנן צנטריפוגלי.
  7. קבע את הריכוז ואת מידת הסימון הממוצעת (DOL, יחס צבע לחלבון) על-ידי מדידת הספקטרום האולטרה-סגול-גלוי (UV-Vis) של התמיסה המצומדת באמצעות קורא לוחות ננו.
    הערה: חומר משלים מספק תכונות של NHS-esters בצבע MARS לצורך חישוב. ה- DOL הרגיל עבור הנוגדן המשני הוא בסביבות 3.

2. הכנת דגימת רקמות

  1. Paraformaldehyde קבוע רקמות המוח של העכבר.
    1. להרדים את העכברים (C57BL/6J, נקבה, 25 d לאחר הלידה) עם איזופלורן. הערך את ההרדמה הנכונה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן.
    2. להרוג את העכברים על ידי תזוזה צוואר הרחם. יש להחדיר לעכברים מיד 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS באופן טרנסקרדיאלי.
    3. אסוף את מוח העכבר, בהתאם לשלבים 2.1.4-2.1.5
    4. חותכים כלפי מעלה מגזע המוח לאורך התפר הסגיטלי. מקלפים את שני חצאי הגולגולת הצידה ומוציאים את המוח עם פינצטה.
    5. תקן את המוח שנאסף ב-4% PFA ב-PBS ב-4 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את המוח במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להסיר עודפי PFA.
    6. מכניסים אגרוז מוצק למים לריכוז סופי של 7% (w/v) בכוס, עם מכסה רופף. מערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב מזכוכית. מחממים את ההברקה במיקרוגל עד שהתמיסה ברורה.
    7. אפשרו לאגרוז להתקרר ל-45-55 מעלות צלזיוס.
    8. יוצקים את האגרוז הנוזלי לתוך תא קטן, ואז מעבירים את המוח מ-PBS לאגרוז נוזלי ומכוונים אותו עם מרית כדי להטמיע את המוח. המתן עד שגוש הרקמות-אגרוז יתקשה.
    9. חתכו את הרקמה-אגרוז לפרוסות קורונליות בעובי 40 מיקרומטר באמצעות ויברטום.
    10. מעבירים את הרקמה לצלחת של 4 בארות לצורך ההכתמה הבאה. הסר את האגרוס עם פינצטה. לשטוף את הרקמה עם 1 מ"ל של PBS, שלוש פעמים.
  2. קבוע רקמות לבלב עכבר קפוא.
    1. תקן את הלבלב של העכבר ב-4% PFA ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך 16-20 שעות.
    2. שטפו את הדגימה ב-1 מ"ל של PBS (4 °C) שלוש פעמים כדי להסיר PFA.
    3. הטבע את הדגימה (בגודל של כ-0.3-0.5 ס"מ) בבלוקים מורכבים אופטימליים של טמפרטורת חיתוך (OCT). שים 2 טיפות של OCT לתוך cryomold פלסטיק. מניחים את הרקמה בכיוון הנכון ושופכים OCT על גבי הרקמות עד שאף אחת מהרקמה לא נשארת חשופה.
    4. חתכו את הלבלב לפרוסות בעובי 8 מיקרומטר ושיתקו אותן לשקופית זכוכית קושרת רקמות, אחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    5. לפני ההכתמה, שיזבו את הדגימה ל-RT. שטפו את הרקמה עם PBS כדי להסיר בלוקי OCT.
  3. דגימות FFPE.
    1. יש לאפות את שקופית רקמת ה-FFPE בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. דפראפיניזציה והתייבשות: מקם דגימות ברצף בתמיסות הבאות בצינור 50 מ"ל ב- RT למשך 3 דקות בכל פעם עם רעידות קלות:
      קסילן פעמיים,
      אתנול פעמיים,
      95% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      70% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      50% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת,
      מים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת.
    3. העבירו את הדגימה ל-20 mM נתרן ציטראט (pH 8.0) ב-100 מעלות צלזיוס בצנצנת זכוכית. ודא שהרקמות שקועות בתמיסה.
    4. שים את הצנצנת באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    5. שטפו את הדגימה עם מים שעברו דה-יוניזציה ב-RT למשך 5 דקות.

3. צביעת רקמות אימונו-eprSRS

  1. השתמש בעט הידרופובי כדי לשרטט גבול סביב חלקי הרקמה במגלשה.
    הערה: צנצנת צביעת שקופיות משמשת לביצוע שלבי הדגירה של הרקמה בשקופית. רקמות צפות (מקטעי מוח עכברים בעובי 40 מיקרומטר) מוכתמות בלוחות באר.
  2. דגירה של הרקמות עם 0.3-0.5% PBST (טריטון X-100 ב- PBS) למשך 10 דקות.
  3. דגירה של הרקמות עם חיץ חוסם (5% סרום חמור, 0.5% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 30 דקות.
  4. הכינו את תמיסת ההכתמה העיקרית: הוסיפו את כל הנוגדנים הראשוניים ל-200-500 μL של מאגר צביעה (2% סרום חמורים, 0.5% Triton X-100 ב-PBS) בריכוזים הרצויים. צנטריפוגה היא תמיסת הכתם העיקרית ב-13,000 x גרם למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
  5. דגירה של הרקמה בתמיסת הנוגדן העיקרית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
    הערה: להכתמת מקטעי רקמות על המגלשה, שים את הדגימה בקופסת צביעה עם מגבון לח כדי לשמור על לחות.
  6. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת. השתמש ב- 1 mL PBST עבור רקמות צפות. עבור רקמות על המגלשה, לשטוף את השקופיות בצנצנת צביעה החלקה ולוודא שהרקמות כולן שקועות בתמיסה.
  7. דגירה של הרקמה ב 200-500 μL של חיץ חוסם במשך 30 דקות.
  8. הכינו את תמיסת הכתם המשנית: הוסיפו את כל הנוגדנים המשניים (והלקטינים במידת הצורך) ל-200-500 μL של מאגר צביעה עם ריכוזים רצויים (בדרך כלל 10 מיקרוגרם/מ"ל). צנטריפוגה תמיסת הכתם המשנית ב 13,000 x g למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
  9. דגירה של הרקמות ב 200-500 μL של תמיסת נוגדנים משנית ב 4 °C (4 °F) למשך 1-2 ימים.
  10. שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
  11. אינקובציה עם 200-500 μL של פתרון DAPI למשך 30 דקות.
  12. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
  13. עבור קטעי רקמות צפות, העבר אותם למגלשות זכוכית עם פיפטה מפילת זכוכית. מורחים את הרקמה עם מברשת טישו ומנקים את הסביבה במגבונים במידת הצורך.
  14. הרכיבו את הרקמה בטיפה של ריאגנטים נגדיים עם כיסוי זכוכית והצמידו אותה לציפורניים.

4. הרכבה של מיקרוסקופ SRS

הערה: מערכת פלואורסצנציה קונפוקלית מסחרית משמשת בהדמיית SRS-פלואורסצנציה טנדם. תיאורים נוספים ניתן למצוא בדו"ח קודם17. פרוטוקול זה יתמקד בצד ההדמיה של SRS באמצעות עירור בפס צר.

  1. הכינו שולחן אופטי מבודד רטט בחדר עם בקרת טמפרטורה.
  2. הניחו מערכת לייזר כפול מסונכרנת (משאבה וסטוקס) על השולחן האופטי (איור 2A) עם צ'ילר מחובר.
    הערה: הלייזר הבסיסי במערכת הלייזר הכפול מספק רכבת פולס יציאה ב-1064 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ. קרן סטוקס היא מהלייזר הבסיסי. עוצמתה של קרן סטוקס הופנתה באופן סינוסואידי על ידי אפנן משרעת אלקטרו-אופטית מובנה (EOM) ב-8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ-90%. החלק השני של הלייזר היסודי מוכפל תדרים ל-532 ננומטר, המשמש גם לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקוס-שניות (OPO) כדי לייצר רכבת פולסים נעולה במצב עם רוחב פולסים של 5-6 ps (קרן האידלר של ה-OPO חסומה באמצעות מסנן אינטרפרומטרי). אורך הגל של הפלט של ה- OPO ניתן לכוונון בין 720-950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה.
  3. הרכיבו את המראות (טווח אורכי גל: 750-1100 ננומטר), מפצלי אלומות דיכרואיים (DBS, מסנן מעבר ארוך של 980 ננומטר, מלבני), ועדשה (achromatic, ציפוי AR עבור 650-1050 ננומטר) לתושבות המתאימות שלהם. השתמש בתושבות מראה יציבות מאוד עבור המראות ומפצלי הקרן הדיכרואיים.
  4. מדוד את גובה פלט הלייזר ואת גדלי הקרן של המשאבה ואת קרני סטוקס. התאם את גובה המראות והעדשות כדי להבטיח שהאור יפגע במרכז כל האלמנטים האופטיים.
  5. הניחו את מראה M1 על הטבלה האופטית והכינו אותה כ-45° ליציאת הלייזר (איור 2B). השתמש בידיות שעל התושבת הקינמטית כדי לבצע התאמות קצה והטיה. ודא שהאור נע באותו גובה לאורך השולחן וקו ישר ביחס לשולחן.
  6. מקם ויישר את מפצלי הקרן הדיכרואיים (מסנני מעבר ארוך של 980 ננומטר) ואת המראות כדי לפצל את המשאבה ואת אלומות סטוקס (איור 2A-B).
  7. מקם ויישור זוגות עדשות (L1, L2 ו-L3, L4) בכל אחד מנתיבי הקרן כדי לרכז את הקורות ולהרחיב את קוטרי הקרן כך שיתאימו לאישון האחורי של המטרה (איור 2A-B).
  8. השתמשו במראות M7 ו-M8 כדי ליישר קרני לייזר משולבות לתוך המיקרוסקופ (איור 2C). יישמו תחילה קרן אחת למיקרוסקופ והשתמשו בזוגות המראה על הקרן השנייה כדי להבטיח את החפיפה המרחבית של שתי האלומות.
  9. הגדר את חלק הזיהוי.
    1. הרכיבו מעבה שמן מצופה אינפרא-אדום (1.4-NA) כדי לאסוף את המשאבה ההולכת קדימה ואת קורות סטוקס לאחר שעברו דרך הדגימות (איור 2C).
    2. הרכיבו פוטודיודה Si בעלת שטח גדול על קופסה מסוככת עם מחברי BNC (איור 2E). הוסף ספק כוח DC 64-V לפוטודיודה המותקנת כדי להגדיל את סף הרוויה ואת רוחב הפס של התגובה.
    3. שחזרו את האור ההולך קדימה באמצעות מראה בגודל 2 אינץ'. מקד מחדש את האור על הפוטודיודה לאחר מסנן אופטי כדי לחסום את קרן סטוקס המווסתת (איור 2D).
    4. שלח את זרם הפלט של הפוטודיודה למגבר נעילה מהיר המסתיים עם 50 להדגמת אותות. שלח הדק של 8 מגה-הרץ למגבר הנעילה כאות הייחוס.
    5. שלח את רכיב ה- X הפאזה של מגבר הנעילה לתוך תיבת הממשק האנלוגית של המיקרוסקופ.
  10. מטב את החפיפה הטמפורלית עם שלב ההשהיה הממונע המובנה על ידי מדידת אות ה-SRS של נוזל D2O טהור במיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של תמונות

  1. בצע הדמיית epr-SRS רב-ערוצית עם כוונון אורך גל רציף של משאבה.
    1. הגדר את כוח הלייזר למשאבת P = 10-40 mW ו- PStokes = 40-80 mW בלוח הבקרה של הלייזר.
    2. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים ל- 2-4 μs והשתמש במסגרות מרובות בממוצע של 10-20 פריימים בתוכנת המיקרוסקופיה.
      הערה: הימנע משימוש קומבינטורי בהספק לייזר גבוה (משאבת P> 40 mW, PStokes> 80 mW) וגודל פיקסלים קטן (<0.2 מיקרומטר), אשר ככל הנראה גורמים ל'אפקט הלבנה' של צבעי ראמאן עקב עירור מרובה-פוטון.
    3. הגדר את קבועי הזמן של מגבר הנעילה למחצית מזמן השהייה של הפיקסל.
  2. אי-התערבבות ספקטרלית ליניארית.
    הערה: epr-SRS עוקב אחר תלות ליניארית קפדנית באות לריכוז על פני כל טווח הריכוזים; לפיכך, אי-ערבוב ספקטרלי ליניארי יעיל להסרת כל שיחות צולבות פוטנציאליות בין ערוצים. עבור מדידת epr-SRS של ערוץ N עם N גשושיות MARS, אותות מדודים (S) יכולים לבוא לידי ביטוי כ- S = MC, כאשר C הוא ריכוזי הגשושית MARS, ו- M היא מטריצת N x N הנקבעת על ידי חתכי ראמאן של גשושיות MARS.
    1. מדוד מטריצה M על דגימות אימונו-eprSRS בצבע יחיד המסומנות בבדיקות MARS שונות.
    2. השתמש במשוואה C = M−1· S כדי לקבוע את מטריצת הריכוז של גשושית MARS באמצעות מדידת אותות מדגם מולטיפלקס S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מציג תמונות לדוגמה של epr-SRS בדגימות שונות, כולל תאים קבועים (איור 3A), רקמות עכבר קבועות של פרפורמלדהיד (PFA) (איור 3B) ודגימות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) (איור 3C). הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיית SRS מוגבלת עקיפה, הרזולוציה הצידית האופיינית היא ~ 300 ננומטר, והרזולוציה הצירית היא 1-2 מיקרומטר באמצעות אור אינפרה-אדום קרוב לעירור. כתוצאה מכך, מבנים תת-תאיים עדינים כמו מיקרוטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את פרוטוקול immuno-eprSRS אשר ישים באופן נרחב לסוגי רקמות נפוצים, כולל רקמות עכברים שזה עתה השתמרו, רקמות אנושיות FFPE ורקמות עכבר קפואות. Immuno-eprSRS אומת עבור פאנל של אפיטופים בתאים וברקמות, כמפורט בטבלה 1. פלטפורמה זו של ירייה אחת מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות מחזוריות אינן מתפקדות היטב. לדוגמה, פלואורסצנציה מחזורית דורשת רקמות עבות מכיוון שסבבים מרובים של סימון חיסוני תלת-ממדי הם ארוכים לא מעשיים17. כמו כן, סביר מאוד להניח שהוא יציג שגיאות רישום עקב שי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לרות א. סינגר ולריצ'רד ק.פ. באנינגר על אספקת רקמות הלבלב של העכבר. W.M. מכיר בתמיכה של NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) וצבא ארה"ב (W911NF-19-1-0214).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% Paraformaldehyde,EM Grade Electron Microscopy Sciences15710
α-tubulinAbcamab18251נוגדנים ראשוניים
α-tubulinBioLegend625902נוגדנים ראשוניים
β-III-tubulinBioLegend657402נוגדנים ראשוניים
ובטא;-III-tubulinAbcamab41489נוגדנים ראשוניים
ובטא;-טובוליןAbcamab131205נוגדנים ראשוניים
אגרוז, טמפרטורת ג'ל נמוכהסיגמא אולדריץ'A9414להטמעת מוח
נוגדן נגד טובולין המיוצר בארנב (&אלפא;-טובולין)Abcamab52866נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד קלבינדין המיוצר בעכבר (קלבינדין)Abcamab82812נוגדנים ראשוניים
נוגדנים נגד קולטן GABA B R2  נוגדן המיוצר בשרקנים (קולטן GABA B R2)Millipore SigmaAB2255נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד GFAP המיוצר בעז (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598נוגדנים ראשוניים נוגדנים אנטי
גלוקגון  נוגדן המיוצר בעכבר (גלוקגון)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-514592נוגדנים
ראשוניים נוגדן נגד אינסולין המיוצר בשרקנים (אינסולין)DAKOIR00261-2נוגדנים ראשוניים נוגדנים
נגד MBP המיוצר בחולדה (MBP)Abcamab7349נוגדנים ראשוניים
נוגדנים נגד NeuN המיוצרים בארנב (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639נוגדנים
ראשונייםנוגדן אנטי פוליפפטיד לבלב (PP) המיוצר בעזים- פוליפפטיד לבלב (PP)Sigma AldrichSAB2500747נוגדנים ראשוניים
נוגדן Anti-Pdx1 המיוצר בארנב (Pdx1)Milipore06-1379נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד סומטוסטטין המיוצר בחולדה (סומטוסטטין)Abcamab30788נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד וימנטין המיוצר בעוף ( Vimentin)Abcamab24525נוגדנים ראשוניים
מסנן מעבר פסKR אלקטרוניקהKR27248 מגה-הרץ
BNC 50 אוהם טרמינטורמיני מעגליםכבל STRM-50
BNCכבל קואקסיאלי Thorlabs2249-C, BNC מראה
דיאלקטרית בפס רחבThorlabsBB1-E03750 - 1100 ננומטר
C57BL/6J עכבריםמעבדת ג'קסון000664
צנטריפוגה
מעבהאולימפוס, טבילת שמן אולימפוס, 1.4 נ.א.
ציטוקרטין 18Abcamab7797נוגדנים ראשוניים
ציטוקרטין 18Abcamab24561נוגדנים ראשוניים
ספק כוחDC TopWard6302Dמתח הטיה הוא 64 V
תושבת דיכרואיתThorlabsKM100CLתושבת קינמטית עד 1.3 אינץ' (33 מ"מ) אופטיקה מלבנית גבוהה,
חמור שמאלי נגד עוף IgY (H+L)ג'קסון ImmunoResearch703-005-155נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד עזים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד חזיר גינאה IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד עכבר IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד ארנב IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד חולדות IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד כבשים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147משני נוגדנים לצימוד MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916נוגדנים ראשוניים
אתנולסיגמא אולדריץ'443611
מגבר הסתכלות מהירZurich InstrumentsHF2LIDC - 50 מגה-הרץ
FFPE דגימת כליהUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821נוגדנים ראשוניים
GiantinAbcamab24586נוגדנים ראשוניים
גלוקגוןSanta Cruz Biotechnologysc-514592נוגדנים ראשוניים
H2BAbcamab1790נוגדנים ראשוניים
HeLaATCCATCC CCL-2
מסנן פס פס OD גבוהChroma טכנולוגיהET890/220mסנן את קרן סטוקס ושדר את קרן המשאבה
עט הידרופוביפישר סיינטיפיקNC1384846
אינסוליןThermoFisher701265נוגדנים ראשוניים
מערכת לייזר SRS משולבתפיזיקה יישומית & אלקטרוניקה בע"מpicoEMERALDpicoEMERALD מספק רכבת פולסים יציאה ב-1,064 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ, המשמש כאלומת סטוקס. אלומת התדר המוכפלת ב-532 ננומטר משמשת לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקו-שנייה (OPO) כדי לייצר רכבת דופק נעולה במצב עם רוחב פולס של 5~6 ps (קרן הסרק של ה-OPO חסומה עם מסנן אינטרפרומטרי). אורך גל הפלט של ה-OPO ניתן לכוונון מ-720– 950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה. עוצמת אלומת סטוקס של 1,064 ננומטר מווסתת באופן סינוסואיד על ידי EOM מובנה ב -8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ -90%. קרן המשאבה חופפת מרחבית לקורת סטוקס באמצעות מראה דיכרואית בתוך picoEMERALD. החפיפה הזמנית בין המשאבה לרכבות הדופק של סטוקס מושגת עם שלב עיכוב מובנה ואופטימיזציה על ידי אות SRS של D2O טהור במיקרוסקופ.
מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוךאולימפוסFV1200MPE
תושבת מראה קינמטיתThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 מכווני משושה בפרופיל נמוך
לקטין מ- Triticum vulgaris (חיטה)סיגמא אולדריץ'L0636-5 מ"ג
מפצל קרן דיכרואי ארוך מעברSemrockDi02-R980-25x36980 ננומטר לייזר BrightLine  מפצל קרן דיכרואי שטוח לייזר קצה
יחיד MAP2BioLegend801810מיקרוסקופיה נוגדנים ראשוניים
OlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanלניתוחים מבוססי ספיגה בנפח קטן בקורא צלחות.
סרום חמור רגילJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-Well DishesFisher Scientific12-566-300
עדשת אובייקטיביתOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, מרחק עבודה =  2  מברשת
"מ מכלול פריסקופThorlabsRS99כולל את היחידות העליונות והתחתונות, Ø עמוד 1 אינץ', ומזלג הידוק.
קורא
TecanInfinite 200 PROקורא צלחות מולטי-מוד קל לשימוש. יכולות מדידת ספיגה בטווח ספקטרלי של 230– 1000 ננומטר.
ProLong Gold antifade reagentThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900נוגדנים ראשוניים
Sephadex G-25 בינוניGE Life Sciences17-0033-01שרף סינון ג'ל להתפלה והחלפת חיץ
קופסה מוגנת עם מחברי BNCPomona Electronics2902תיבת אלומיניום עם כיסוי, BNC נקבה / נקבה
Si photodiodeThorlabsFDS1010350– 1100 ננומטר, 10 מ"מ x 10 מ"מ אזור פעיל
סינפסין 2ThermoFisherOSS00073Gנוגדנים ראשוניים
נתיב רקמות Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813שקופית דבק כדי למשוך ולקשור כימית קטעי רקמה טריים או קבועים בפורמלין בחוזקה למשטח ההחלקה (שקופיות זכוכית מחייבות)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069נוגדנים ראשוניים
XylenesSigma Aldrich214736
זכר / זכר תוכנת הדמיית צבע מ צלחות מד pH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  3. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  4. Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
  5. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
  6. Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657(2018).
  7. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  8. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  9. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851(2019).
  10. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).
  13. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465(2017).
  14. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  15. Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
  16. Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
  17. Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
  18. Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).
  19. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).
  20. Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).
  21. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
  22. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
  23. Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537(2018).
  24. Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
  25. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  26. Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Stimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

מאמרים קשורים