Method Article

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

DOI:

10.3791/63547

⸱

April 21st, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של היקף עצום של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות ממלאת תפקיד חיוני בחקר הארגונים המורכבים של מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, טכנולוגיות הדמיה מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מתפתחת של הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד של חלבונים ספציפיים עם רגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית באמצעות הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) אלקטרונית המעוררת בתהודה מוקדמת של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן. שיטה זו עוקפת את הגבול של תעלות הניתנות לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמנים מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. הוא תואם בדרך כלל לתכשירי רקמות סטנדרטיים, כולל רקמות קבועות פרפורמלדהיד, רקמות קפואות ורקמות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אנו צופים שפלטפורמה זו תספק תמונה מקיפה יותר של אינטראקציות חלבונים של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור רקמות שלמות ועבות. פרוטוקול זה מספק את זרימת העבודה מהכנת נוגדנים להכתמת דגימת רקמות, להרכבת מיקרוסקופ SRS, להדמיית רקמות epr-SRS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות רקמות מורכבות מורכבות מתת-אוכלוסיות תאיות נפרדות שמיקומיהן המרחביים ורשתות האינטראקציה שלהן שזורים עמוק בתפקודים ובתפקוד לקוי שלהן 1,2. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה ולחקור את המורכבות שלה, ידע על המיקומים המרחביים של חלבונים ברזולוציה של תא יחיד הוא חיוני. לפיכך, טכנולוגיות הדמיית חלבונים מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת ויכולות להפוך לאבן פינה לחקר הביולוגיה של הרקמות 3,4,5. ניתן לסווג את שיטות ההדמיה הנפוצות הנוכחיות של חלבונים מרובבים לשתי קטגוריות עיקריות. האחת היא הדמיה אימונופלואורסצנטית סדרתית המסתמכ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נערך בהתאם לפרוטוקול הניסוי בבעלי חיים (AC-AABD1552) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת נוגדנים מצומדים בצבע רמאן

  1. הכן את מאגר ההצמדה כ~ 0.1 M NaHCO3 במאגר PBS, pH = 8.3, אחסן ב- 4 °C (74 °F).
  2. הכן תמיסת גשושית MARS (חומר משלים) N-hydroxysuccinimidy (NHS) המתפקדת על-ידי אסטר-מתפקדת כ-3 mM ב-DMSO נטול מים. ניתן להפנות סינתזה של בדיקות MARS לדיווחים קודמים 13,17,18.
    הערה: למטרות אחסון, יש להגן על פתרון האסטר של NHS בצבע NHS מפני....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מציג תמונות לדוגמה של epr-SRS בדגימות שונות, כולל תאים קבועים (איור 3A), רקמות עכבר קבועות של פרפורמלדהיד (PFA) (איור 3B) ודגימות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) (איור 3C). הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיית SRS מוגבלת עקיפה, הרזולוציה הצידית האופיינית היא ~ 300 ננומטר, והרזולוציה הצירית היא 1-2 מיקרומטר באמצעות אור אינפרה-אדום קרוב לעירור. כתוצאה מכך, מבנים תת-תאיים עדינים כמו מיקרוטו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את פרוטוקול immuno-eprSRS אשר ישים באופן נרחב לסוגי רקמות נפוצים, כולל רקמות עכברים שזה עתה השתמרו, רקמות אנושיות FFPE ורקמות עכבר קפואות. Immuno-eprSRS אומת עבור פאנל של אפיטופים בתאים וברקמות, כמפורט בטבלה 1. פלטפורמה זו של ירייה אחת מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות מחזוריות אינן מתפקדות היטב. לדוגמה, פלואורסצנציה מחזורית דורשת רקמות עבות מכיוון שסבבים מרובים של סימון חיסוני תלת-ממדי הם ארוכים לא מעשיים17. כמו כן, סביר מאוד להניח שהוא יציג שגיאות רישום עקב שי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לרות א. סינגר ולריצ'רד ק.פ. באנינגר על אספקת רקמות הלבלב של העכבר. W.M. מכיר בתמיכה של NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) וצבא ארה"ב (W911NF-19-1-0214).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde,EM Grade Electron Microscopy Sciences15710
α-tubulinAbcamab18251נוגדנים ראשוניים
α-tubulinBioLegend625902נוגדנים ראשוניים
β-III-tubulinBioLegend657402נוגדנים ראשוניים
ובטא;-III-tubulinAbcamab41489נוגדנים ראשוניים
ובטא;-טובוליןAbcamab131205נוגדנים ראשוניים
אגרוז, טמפרטורת ג'ל נמוכהסיגמא אולדריץ'A9414להטמעת מוח
נוגדן נגד טובולין המיוצר בארנב (&אלפא;-טובולין)Abcamab52866נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד קלבינדין המיוצר בעכבר (קלבינדין)Abcamab82812נוגדנים ראשוניים
נוגדנים נגד קולטן GABA B R2  נוגדן המיוצר בשרקנים (קולטן GABA B R2)Millipore SigmaAB2255נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד GFAP המיוצר בעז (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598נוגדנים ראשוניים נוגדנים אנטי
גלוקגון  נוגדן המיוצר בעכבר (גלוקגון)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-514592נוגדנים
ראשוניים נוגדן נגד אינסולין המיוצר בשרקנים (אינסולין)DAKOIR00261-2נוגדנים ראשוניים נוגדנים
נגד MBP המיוצר בחולדה (MBP)Abcamab7349נוגדנים ראשוניים
נוגדנים נגד NeuN המיוצרים בארנב (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639נוגדנים
ראשונייםנוגדן אנטי פוליפפטיד לבלב (PP) המיוצר בעזים- פוליפפטיד לבלב (PP)Sigma AldrichSAB2500747נוגדנים ראשוניים
נוגדן Anti-Pdx1 המיוצר בארנב (Pdx1)Milipore06-1379נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד סומטוסטטין המיוצר בחולדה (סומטוסטטין)Abcamab30788נוגדנים ראשוניים
נוגדן נגד וימנטין המיוצר בעוף ( Vimentin)Abcamab24525נוגדנים ראשוניים
מסנן מעבר פסKR אלקטרוניקהKR27248 מגה-הרץ
BNC 50 אוהם טרמינטורמיני מעגליםכבל STRM-50
BNCכבל קואקסיאלי Thorlabs2249-C, BNC מראה
דיאלקטרית בפס רחבThorlabsBB1-E03750 - 1100 ננומטר
C57BL/6J עכבריםמעבדת ג'קסון000664
צנטריפוגה
מעבהאולימפוס, טבילת שמן אולימפוס, 1.4 נ.א.
ציטוקרטין 18Abcamab7797נוגדנים ראשוניים
ציטוקרטין 18Abcamab24561נוגדנים ראשוניים
ספק כוחDC TopWard6302Dמתח הטיה הוא 64 V
תושבת דיכרואיתThorlabsKM100CLתושבת קינמטית עד 1.3 אינץ' (33 מ"מ) אופטיקה מלבנית גבוהה,
חמור שמאלי נגד עוף IgY (H+L)ג'קסון ImmunoResearch703-005-155נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד עזים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד חזיר גינאה IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד עכבר IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד ארנב IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד חולדות IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153נוגדנים משניים לצימוד MARS
חמור נגד כבשים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147משני נוגדנים לצימוד MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916נוגדנים ראשוניים
אתנולסיגמא אולדריץ'443611
מגבר הסתכלות מהירZurich InstrumentsHF2LIDC - 50 מגה-הרץ
FFPE דגימת כליהUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821נוגדנים ראשוניים
GiantinAbcamab24586נוגדנים ראשוניים
גלוקגוןSanta Cruz Biotechnologysc-514592נוגדנים ראשוניים
H2BAbcamab1790נוגדנים ראשוניים
HeLaATCCATCC CCL-2
מסנן פס פס OD גבוהChroma טכנולוגיהET890/220mסנן את קרן סטוקס ושדר את קרן המשאבה
עט הידרופוביפישר סיינטיפיקNC1384846
אינסוליןThermoFisher701265נוגדנים ראשוניים
מערכת לייזר SRS משולבתפיזיקה יישומית & אלקטרוניקה בע"מpicoEMERALDpicoEMERALD מספק רכבת פולסים יציאה ב-1,064 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ, המשמש כאלומת סטוקס. אלומת התדר המוכפלת ב-532 ננומטר משמשת לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקו-שנייה (OPO) כדי לייצר רכבת דופק נעולה במצב עם רוחב פולס של 5~6 ps (קרן הסרק של ה-OPO חסומה עם מסנן אינטרפרומטרי). אורך גל הפלט של ה-OPO ניתן לכוונון מ-720– 950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה. עוצמת אלומת סטוקס של 1,064 ננומטר מווסתת באופן סינוסואיד על ידי EOM מובנה ב -8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ -90%. קרן המשאבה חופפת מרחבית לקורת סטוקס באמצעות מראה דיכרואית בתוך picoEMERALD. החפיפה הזמנית בין המשאבה לרכבות הדופק של סטוקס מושגת עם שלב עיכוב מובנה ואופטימיזציה על ידי אות SRS של D2O טהור במיקרוסקופ.
מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוךאולימפוסFV1200MPE
תושבת מראה קינמטיתThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 מכווני משושה בפרופיל נמוך
לקטין מ- Triticum vulgaris (חיטה)סיגמא אולדריץ'L0636-5 מ"ג
מפצל קרן דיכרואי ארוך מעברSemrockDi02-R980-25x36980 ננומטר לייזר BrightLine  מפצל קרן דיכרואי שטוח לייזר קצה
יחיד MAP2BioLegend801810מיקרוסקופיה נוגדנים ראשוניים
OlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanלניתוחים מבוססי ספיגה בנפח קטן בקורא צלחות.
סרום חמור רגילJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-Well DishesFisher Scientific12-566-300
עדשת אובייקטיביתOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, מרחק עבודה =  2  מברשת
"מ מכלול פריסקופThorlabsRS99כולל את היחידות העליונות והתחתונות, Ø עמוד 1 אינץ', ומזלג הידוק.
קורא
TecanInfinite 200 PROקורא צלחות מולטי-מוד קל לשימוש. יכולות מדידת ספיגה בטווח ספקטרלי של 230– 1000 ננומטר.
ProLong Gold antifade reagentThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900נוגדנים ראשוניים
Sephadex G-25 בינוניGE Life Sciences17-0033-01שרף סינון ג'ל להתפלה והחלפת חיץ
קופסה מוגנת עם מחברי BNCPomona Electronics2902תיבת אלומיניום עם כיסוי, BNC נקבה / נקבה
Si photodiodeThorlabsFDS1010350– 1100 ננומטר, 10 מ"מ x 10 מ"מ אזור פעיל
סינפסין 2ThermoFisherOSS00073Gנוגדנים ראשוניים
נתיב רקמות Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813שקופית דבק כדי למשוך ולקשור כימית קטעי רקמה טריים או קבועים בפורמלין בחוזקה למשטח ההחלקה (שקופיות זכוכית מחייבות)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomeLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069נוגדנים ראשוניים
XylenesSigma Aldrich214736
זכר / זכר תוכנת הדמיית צבע מ צלחות מד pH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Tissue ImagingRaman DyesStimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

Related Articles