אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
יוביקוויטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי המתרחש בתאים אאוקריוטים שהוא קריטי לוויסות של מספר מסלולים ביולוגיים, כולל הישרדות תאים, התפשטות והתמיינות. זהו תהליך הפיך המורכב מהצמדה קוולנטית של יוביקוויטין לסובסטרט באמצעות תגובת מפל של לפחות שלושה אנזימים שונים, המורכבים מ-E1 (אנזים הפעלת יוביקוויטין), E2 (אנזים מצומד יוביקוויטין) ו-E3 (אנזים יוביקוויטין-ליגאז). קומפלקס E3 ממלא תפקיד חשוב בזיהוי מצעים וביוביקוויטילציה. כאן מתואר פרוטוקול להערכת יוביקוויטילציה של מצע בתאי יונקים באמצעות קו-טרנספקציה חולפת של פלסמיד המקודד את המצע שנבחר, יוביקוויטין ליגאז E3 ויוביקוויטין מתויג. לפני התזה, התאים שעברו טרנספקטציה מטופלים במעכב הפרוטאזום MG132 (קרבובנזוקסי-לאו-לאו-לוצינל) כדי למנוע השפלה של פרוטאסומלי במצע. יתר על כן, תמצית התאים מוגשת למיצוי חיסוני בקנה מידה קטן (IP) כדי לטהר את המצע הפוליוביקוויטילטיבי לצורך זיהוי מאוחר יותר על ידי כתם מערבי (WB) באמצעות נוגדנים ספציפיים לתג יוביקוויטין. לפיכך, מתואר פרוטוקול עקבי ולא מסובך לבדיקת יוביקוויטילציה בתאי יונקים כדי לסייע למדענים לטפל ביוביקוויטילציה של מצעים ספציפיים ובליגאזות יוביקוויטין E3.
מבוא
שינויים לאחר התרגום (PTMs) הם מנגנון חשוב בנוגע לוויסות חלבונים, החיוני להומאוסטזיס של התא. יוביקוויטילציה של חלבונים היא שינוי דינמי ומורכב שיוצר מגוון של אותות שונים וכתוצאה מכך מספר תוצאות תאיות באורגניזמים אאוקריוטים. יוביקוויטילציה היא תהליך הפיך המורכב מהצמדת חלבון יוביקוויטין המכיל 76 חומצות אמינו למצע, המתרחש במפל אנזימטי המורכב משלוש תגובות נפרדות1. הצעד הראשון מאופיין בהפעלת יוביקוויטין, התלויה בהידרוליזה של ATP כדי ליצור יוביקוויטין המקושר לתיואסטר באנרגיה גבוהה בין יוביקוויטין C-terminus לבין שאריות הציסטאין הנמצאות באתר הפעיל של האנזים E1. לאחר מכן, האוביקוויטין מועבר לאנזים E2 ויוצר קומפלקס דמוי תיואסטר עם יוביקוויטין. לאחר מכן, ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: סקירה כללית של פרוטוקול בדיקת יוביקוויטילציה בתאי יונקים מיוצגת באיור 1.
איור 1. סקירה כללית של הליך בדיקת יוביקוויטילציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
1. תרבית תאים
- הגדל את קו תאי HEK293T בצלחת תרבית 100 מ"מ שטופלה ב-TC למפגש של 80....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
UXT (תעתיק המבוטא בכל מקום) הוא חלבון דמוי פרפולדין היוצר קומפלקסים של קיפול חלבונים המתבטאים בכל מקום ברקמות עכברים ובני אדם כגון לב, מוח, שרירי שלד, שליה, לבלב, כליות וכבד18. תוארו שני איזופורמים של שחבור של UXT, הנקראים UXT-V1 ו-UXT-V2, המבצעים פונקציות ומיקומים תת-תאיים נפרדים. UXT-V1 מקומי בעיקר בציטופלסמה ובתוך המיטוכונדריה, והוא מעורב באפופטוזיס המושרה על ידי TNF-α ובהיווצרות איתות אנטי-ויראלי19,20. רוב המחקרים התמקדו ב-UXT-V2 שנמצא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יוביקוויטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי חיוני המווסת את רמותיהם של מספר חלבונים וממלא תפקיד מכריע במסלולי איתות ותהליכים ביולוגיים רבים, ומבטיח סביבה תוך-תאית בריאה. מערכת יוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) היא אחד המוקדים העיקריים של המחקר הפרמצבטי האחרון, המספק את האפשרות לייצב מדכאי גידולים או לגרום לפירוק של מוצרים אונקוגניים22. לדוגמה, התפשטות חריגה של גידולים בתאי פלזמה האחראית להפרשת אימונוגלובולינים חד-שבטיים במיאלומה נפוצה (MM) מקדמת מסלול פתופיזיולוגי עקב הצטברות חלבונים מקופלת ו/או לא מקופלת באופן.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
F.R.T נתמך על ידי מענק FAPESP מספר 2020/15771-6 ו- CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P ו-V.S נתמכים על ידי CAPES. C.R.S.T.B.C נתמך על ידי מלגת FAPESP מספר 2019/23466-1. אנו מודים לסנדרה R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) על התמיכה בחומר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל מיקרו-צינור | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 מ"מ צלחת תרבית מטופלת TC | קורנינג | 430167 | |
| 15 מ"ל צינור | קורנינג | 430766 | |
| 96 בארות צלחת | קרלפלסט | 655111 | |
| חרוזי אגרוז-אנטי-HA | סיגמא-אולדריץ' | E6779 | |
| נוגדן נגד עכבר | Seracare | 5220-0341 | עיזים נגד עכבר IgG |
| נוגדן נגד ארנב | Seracare | 5220-0337 | עיזים נגד ארנב |
| IgG נוגדן נגד אקטין | Sigma-Aldrich | A3853 | דילול בשימוש: 1:2000 |
| נוגדן נגד Fbxo7 | סיגמא-אולדריץ' | SAB1407251 | דילול בשימוש: 1:1000 |
| נוגדן נגד HA | סיגמא-אולדריץ' | H3663 | דילול בשימוש: 1:1000 |
| Anti-Myc | נוגדנים איתות תאים | 2272 | דילול בשימוש: 1:1000 |
| מגיב ברדפורד | סיגמא-אולדריץ' | B6916-500ML | |
| BSA | סיגמא-אולדריץ' | A9647-100G | אלבומין בסרום בקר |
| Nuaire | NU-4850 | ||
| צנטריפוגה | Eppendorf | 5804R | 500 x g למשך 5 דקות |
| מד pH דיגיטלי ChemiDoc | BioRad | ||
| Kasvi | K39-2014B | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle' s | קורנינג | 10-017-CRV | עם גלוקוז גבוה |
| Gibco | F4135 | פילטראט שימוש קודם | |
| פפטיד | HA סיגמא-אולדריץ' | I2149 | |
| תאי HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE Healthcare | ||
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| מיקרוסקופ אופטי | OPTIKA מיקרוסקופים | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | לביטוי יונקים |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; | Tag 2xFlag (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-Δ F-box | נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; | Tag 2xFlag (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI. &דלתא; 335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; | Tag HA (מסוף C). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | נתרם באדיבות על ידי ד"ר מרסלו דאם; | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). אנזימי הגבלה: EcoRI ו-KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| פוספט חוצץ מלח 10x | AccuGENE | 51226 | כדי להשיג 1x PBS, יש לדלל את ה-10x PBS למים טהורים במיוחד |
| פוליאתילנימין (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| שייקר נדנדה | Kasvi | 19010005 | |
| מערכת SDS-PAGE | BioRad | 165-8004 | |
| הומוגנייזר תמיסה | פניקס לופרקו | AP-22 | |
| בסיס טריזמה | סיגמא-אולדריץ' | T6066-500G | |
| טריפסין (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| ריאגנט לומינול ווסטרן בלוטינג | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | SC-2048 |
מקורות
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
- Koegl, M., et al. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
