הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63569

⸱

16 במרץ 2022

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

תקציר

פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.

כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P2) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.

מבוא

היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית 1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה 1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.

זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה4, 8,14,15,16,17.

בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים 5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.

כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P2 בקרום הפלזמה 8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הליך השימוש בבעלי חיים פעל בהתאם להנחיות NIH ואושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIH.

1. תרבית תאי כרומפין בקר

  1. הכינו את התמיסה של לוק (טבלה 1) ואת כלי האוטוקלבה האוטומטית יום אחד לפני תרבית תאי הכרומפין.
  2. השיגו בלוטות יותרת הכליה של בקר מאבטואר מקומי ביום התרבית, ושמרו אותן שקועות בתמיסה הקרה כקרח של לוק לפני הנתיחה.
    הערה: בלוטות יותרת הכליה הן בנות 21-27 חודשים, אנגוס שחור בריא ושחור משני המינים (בעיקר זכר) עם משקל גוף סביב 1,400 פאונד (~ 635 ק"ג).
  3. יש להכין 30 מ"ל (עבור 3 בלוטות יותרת הכליה) של תמיסת אנזימים טרייה המכילה קולגןאז P, מעכב טריפסין ואלבומין בסרום בקר (טבלה 1) לפני הניתוח ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
  4. בחרו 3 בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסירו את רקמת השומן באמצעות מספריים (איור 1A). לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. כדי להשיג זאת, יש לנפח את הבלוטה דרך וריד יותרת הכליה (איור 1B) באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר בכמות הפעמים הדרושהל-25.
    הערה: כ 150 מ"ל של הפתרון של לוק הוא בדרך כלל נחוץ כדי לשטוף 3 בלוטות.
  5. לצורך העיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן, השאירו את הבלוטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
    הערה: יש צורך בכ-30 מ"ל של תמיסת אנזים כדי לעכל 3 בלוטות.
  6. לאחר העיכול, חותכים את הבלוטה לאורך הווריד לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה (איור 1C). בודדו את המדולה על ידי פינצטה של המדולה הלבנה לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את התמיסה של לוק.
    הערה: ההשוואה בין פנים הבלוטה לפני ואחרי העיכול מוצגת באיור 1C. הפרטים של העיכול ובידוד medullae דווחו בעבר23,25.
  7. חותכים את המדולה ומחברים אותה לחתיכות קטנות עם מספריים (איור 1D). מסננים את מתלי המדולה עם רשת ניילון של 80-100 מיקרומטר לכוס. לאחר מכן להעביר את התסיס לצינור חרוטי 50 מ"ל לצנטריפוגה ב 48 × גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
    הערה: כריכה של medullae בדרך כלל לוקח ~ 10 דקות. כדי להשיג תשואה טובה של תאים, החלקים הטחונים חייבים להיות קטנים מאוד, עד שלא ניתן יהיה לתקן אותם.
  8. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את מתלה התא עם מסננת של 80-100 מיקרומטר, וצנטריפוגה ב-48 x גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
  9. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מ"ל של מדיום תרבית (טבלה 1). קבע את מספר התא באמצעות תאי ספירת המקסיטומטר25.

2. טרנספקציה עם אלקטרופורציה

  1. להעביר 2.8 × 106 תאים לתוך צינור 15 מ"ל. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 × g במשך 2 דקות עם האטה של 3. הוסף 100 μL של מאגר טרנספקציה (ראה טבלת החומרים) המסופק על ידי היצרן לכדור התא, ולאחר מכן הוסף 2 מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG.
    הערה: פלסמיד PH-mNG נוצר על-ידי החלפת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (EGFP) ב-mNG ב-PH-EGFP15 (ראו טבלת החומרים).
  2. ערבבו בעדינות את המתלים על-ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה, והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי (איור 1E). העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור (ראה את טבלת החומרים), בחר את תוכנית O-005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה.
    הערה: הכינו את תרחיף התא לטרנספקציה במכסה אדים של תרבית תאים. אין להכניס בועות אוויר למתלים במהלך שלב הערבוב. המשך לשלב הבא ללא דיחוי.
  3. לאחר אלקטרופורציה, הוסיפו 1.8 מ"ל של מדיום מיד לקובט וערבבו בעדינות עם מיקרופיפטטור המצויד בקצה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 300 μL של ההשעיה של התאים האלקטרופורים על גבי הכיסוי (ראו טבלת החומרים) בכל מנה, וציפו 5-6 כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.
  4. העבירו בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO2 למשך 30 דקות, והוסיפו בעדינות 2 מ"ל של מדיום מחומם מראש לכל מנה לאחר 30 דקות.
  5. שמור את התאים הטרנספקטים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO2 למשך 2-3 ימים לפני הניסוי.
    הערה: התאים בתרבית יחזיקו מעמד במשך שבוע. עדיף להשתמש בתאים בתרבית בימים 2-3.

3. הכנה להקלטת מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

הערה: פרוטוקול זה בוצע עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר ומגבר מהדק טלאי עם הקלטת מהדק מתח יחד עם מגבר נעילה להקלטת קיבוליות. הדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע (סריקהקבועה XY/Z) שימשה כדי לצלם את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים בו זמנית. מישור ה-Z היה ממוקד בקרקעית התא, שם קרום הפלזמה נדבק לכיסויים.

  1. ביום של ניסוי הידוק טלאי והדמיה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמשו בשדה בהיר כדי לוודא שתרבית התאים אינה מזוהמת (איור 1F) ובאפיפלואורסצנציה כדי לבדוק אם יש ביטוי נכון של החלבון המתויג כחלואורסצנטי.
    הערה: לדוגמה, PH-mNG מתבטא בקרום הפלזמה של כ-20-30% מהתאים.
  2. הכן פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט. לשם כך, משכו את הפיפטות עם מושך פיפטות, ציפו את קצותיהן בשעווה נוזלית וליטשו אותן במיקרו-פורג' (ראו טבלת החומרים).
  3. הפעילו את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעילו את תוכנת ההקלטה של מהדקי התיקון (ראו טבלת החומרים). הגדר את הפרמטרים המתאימים לרישום זרם סידן וקיבוליות בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
    1. הגדר פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל, כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות.
    2. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של הקלטת מהדקי מתח ל- -80 mV. קבעו דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80 mV ל-10 mV כתמריץ לגרימת זרם סידן וקפיצת קיבוליות.
    3. עבור מדידות קיבוליות, הגדר את התדר של הגירוי הסינוסואידלי לטווח של 1,000-1,500 הרץ עם מתח שיא לשיא של לא יותר מ-50 mV.
  4. שמור את הפרוטוקול וצור קובץ חדש להקלטה.
  5. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
    1. הפעל את הלייזרים, כולל 458 ננומטר, 514 ננומטר ו- 633 ננומטר, והגדר את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר בהתאם לכל בדיקה פלואורסצנטית כמו בהמשך. FFN511: אורך גל עירור (EX), 458 ננומטר; אורך גל פליטה (EM), 468-500 ננומטר. mNG: EX, 514 ננומטר; EM, 524-560 ננומטר. A655: EX, 633 ננומטר; EM, 650-700 ננומטר.
    2. השתמש בהדמיה רציפה עבור FFN511 ו- mNG כדי למנוע הצלבה בין שתי בדיקות אלה. קבעו משך זמן של דקה אחת להקלטת תמונה (איור 1G).

4. הקלטה של מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

  1. בחר צלחת עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסף 2 μL של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי כוזב FFN511 (מלאי 10 mM, תמיסת עבודה 1:1,000) למדיום. החזירו את המנה לחממה למשך 20 דקות. לחלופין, טען FFN511 לאחר שלב 3.2 ובצע שלבים 3.3-3.5 תוך המתנה כדי לחסוך זמן.
  2. לאחר סיום העמסת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו 2 μL של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 500 μL של תמיסת האמבטיה (איור 2A וטבלה 1). העבירו את הכיסוי מהתבשיל לתוך תא ההקלטה (ראו טבלת החומרים) עם פינצטה, והוסיפו מיד תמיסת אמבטיה המכילה A655 (איור 2B).
    הערה: A655 נשמר ב -20 °C עם ריכוז של 10 mM וריכוז העבודה הוא 40 μM.
    אזהרה: לבשו כפפות כדי למנוע מגע ישיר עם העור עם FFN511 או A655.
  3. מקם טיפת שמן (מקדם שבירה: 1.518; ראה טבלת החומרים) על מטרת טבילת השמן פי 100 (צמצם מספרי = 1.4). הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלק התחתון של הכיסוי, ואז לטבול את קצה חוט ההארקה לתוך תמיסת האמבטיה (איור 2C, D).
    הערה: בחר שמן טבילה המתאים לעבודה בטמפרטורת החדר. המעבר בין עדשת ההגדלה הנמוכה והגבוהה הוא מיותר. טמפרטורת החדר נשמרת סביב 20-22 מעלות צלזיוס במהלך ההקלטה.
  4. הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בהדמיה בהירה וקונפוקלית כדי למצוא תא טוב עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר והתאם אותו למרכז התצוגה כדי למזער אזורים ריקים.
    הערה: השרטוט הסכמטי של תיוג פלואורסצנטי מוצג באיור 3A. לתא טוב יש בדרך כלל קרום חלק וקצה נקי (איור 3B). בהדמיה אפיפלואורסצנטית או קונפוקלית, נראה שלתא טוב יש תחתית גדולה ושטוחה עם ביטוי mNG בהיר (איור 3C).
    גודל הפיקסל הוא ~ 50 ננומטר, בטווח של ~ 40-80 ננומטר בהתאם לגודל התא וגורם הזום השונים.
  5. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית במישור XY במישור Z קבוע (סריקהקבועה XY/Z) של FFN511, PH-mNG ו-A655, עם מרווח זמן מינימלי. התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית הכוונון העדינה.
    הערה: PH-mNG מאותת על קווי המתאר של קרום הפלזמה של התא בהצלבה של מישור XY הקונפוקלי (למעט תחתית התא). ליד תחתית קרום התא, ניתן לראות כתמים A655, המשקפים Ω בצורת Ω או בצורת Λ אינוויגינציות של קרום. אם מישור מוקד ה-Z נמוך יותר מתחתית התא, העוצמה של כל הפלואורסצנציה תהיה חלשה יותר.
  6. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. לשם כך, התחל עם ערך בדיקה ראשוני של הספק של 2.5 mW עבור FFN511 נרגש ב- 458 ננומטר ו- 1 mW עבור mNG נרגש ב- 514 ננומטר. עבור A655 נרגש ב-633 ננומטר עם לייזר HeNe, השתמש בהספק לייזר גבוה, ~12-15 mW (כלומר, 70%-80% מהמקסימום), אשר, לאחר עירור רציף, יכול להלבין את כל A655 פלואורסצנטי בתוך פרופיל בצורת Ω כאשר הנקבובית שלו סגורה.
    הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי, PH-mNG ו-FFN511 פלואורסצנציה יולבנו במהירות. אם עוצמת הלייזר נמוכה מדי, האותות יהיו חלשים או רועשים מכדי לנתח אותם.
  7. הוסף 9 μL של תמיסה פנימית (טבלה 1) לתוך פיפטה טלאי והצמד את הפיפטה למחזיק בשלב מגבר הידוק התיקון (ראה טבלת החומרים).
  8. יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא ~ 2-4 MΩ עם בדיקת פולס מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.
  9. הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות המיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב המחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא (ההתנגדות תגדל); הפעלת לחץ שלילי בעדינות עם המזרק (ההתנגדות תגדל ליותר מ 1 GΩ), לשנות את פוטנציאל ההחזקה מ 0 ל -80 mV.
  10. ברגע שההתנגדות עוברת 1 GΩ, המתן עד ~ 30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה.
  11. כדי ליצור מצב של תא שלם, יש להפעיל לחץ שלילי קצר אך רב עוצמה עם המזרק כדי לקרוע את הממברנה (צורת הדופק הנוכחי משתנה עם קבל ממברנה טעון ומשוחרר). לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית.
  12. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל הדמיית זמן קונפוקלית והקלטת מהדק תיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל בשני יישומי התוכנה השונים בו-זמנית.
    הערה: תוכנת ההדמיה הקונפוקלית יוצרת סרט בקצב של ~ 20-90 אלפיות השנייה למסגרת. הקלטת מהדק התיקון כוללת את מצב המנוחה במשך 10 שניות, את גירוי הדה-פולריזציה של 1 שניות, ותוספת של 49 שניות לאחר הגירוי. תצורת מהדק הטלאים מאפשרת רישום של זרם סידן, קפיצת קיבוליות ודעיכה המושרים על-ידי דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80- ל-10 mV +(איור 3D).
  13. לאחר סיום ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה ל-0 mV. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.
  14. חזור על שלבים 4.7-4.13 כדי להקליט תא נוסף בצלחת. לאחר שעה אחת של הקלטה, החליפו למנה אחרת להקלטה.
    הערה: לאחר שעה אחת של הקלטה, שיעור ההצלחה של הקלטת מהדק טלאי יורד באופן משמעותי. כדי להגביר את היעילות של איסוף הנתונים, מומלץ לרשום רק שעה אחת בכל מנה.

5. ניתוח נתוני מהדק תיקון

  1. פתח תוכנה מתאימה (ראה טבלת החומרים) לניתוח נתונים. לחץ על | PPT טען | קובץ PULSE לחצני קובץ לטעינת הקובץ .dat. לחץ על עשה זאת וארבעה עקבות יפורטו בגרף אחד באופן אוטומטי, כולל זרם הסידן ועקבות הקיבול.
  2. לחץ על | Windows לחצני גרף חדשים, בחר את Pulse_1_1_1, הגל הראשון ב- Y Wave(s), ולחץ על עשה זאת כדי להתוות את גרף זרם הסידן. לחץ על | Windows לחצני טבלה חדשים, בחר את Pulse_1_1_1 ולחץ על עשה זאת כדי להציג את הנתונים הגולמיים של זרם סידן, שניתן להשתמש בהם כדי להתוות את העקבות הממוצעים של תאים מרובים.
  3. צייר ריבוע בהתאם בגרף זרם הסידן, לחץ לחיצה ימנית והרחב את האות הנוכחי כך שיכלול את קו הבסיס ואת שיא זרם הסידן. לחץ על גרף | הצג מידע כדי להציג את הסמנים A ו- B ולהעביר אותם לקו הבסיס ולשיא בהתאמה. פרטי הגרף יוצגו בתחתית וניתן יהיה להעריך פרמטרים.
  4. חזור על שלב 5.2, אך בחר את Pulse_1_1_1_Cm, הגל השני ב- Y Wave(s), כדי להתוות את עקבות הקיבול. חזור על שלב 5.3 והצב את הסמנים A ו- B במיקום המתאים למדידת פרמטרי הקיבול, כגון קו בסיס, משרעת וקצב דעיכה.
  5. העתק נתונים גולמיים בשלב 5.2 לגיליון אלקטרוני, חישב את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של הממוצע עבור קבוצת תאים מוקלטים, והתווה את העקבות הממוצעים של זרם סידן וקיבוליות ממברנה (איור 3E) בתוכנה מתאימה.

6. ניתוח נתוני הדמיה קונפוקלית

  1. פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל תוכנה שסופקה על-ידי היצרן (ראה טבלת החומרים).
    הערה: ניתן להשתמש בכמה תוכניות חינמיות אחרות, כגון ImageJ או Fiji, לעיבוד נתונים ולכימות התמונות המתקבלות בסעיף 4.
  2. לחץ על | תהליך ProcessTools ושימוש בכלים כדי ליצור ממוצע מתגלגל (לדוגמה, ממוצע מתגלגל עבור כל 4 תמונות) עבור כל תמונה בהילוך מהיר ולשמור קבצים אלה.
    הערה: לאחר גלגול הממוצע, ניתן לבצע התאמה מתאימה של הבהירות והרקע כדי להראות טוב יותר את השינויים הפלואורסצנטיים של שלושה ערוצים, מה שעשוי לסייע בזיהוי אירועי היתוך. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
  3. לחץ על הכפתורים כימות | כלים | פרופיל מחסנית, בדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי כדי לזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף את אזורי העניין (ROIs) לאירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור את ה- ROIs.
    הערה: גודל ההחזר על ההשקעה, המכסה את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים, היה דומה לגודל השלפוחית בתאי כרומפין24. לצורך הניתוח נעשה שימוש בנתונים גולמיים, בעוד שהנתונים הממוצעים המתגלגלים המגדילים את יחס האות לרעש סופקו כדי להראות בבירור את שלושת האותות.
  4. לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקבצי ההדמיה הגולמיים כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה.
    הערה: האות הפלואורסצנטי הגולמי ישמש להתוויית עקבות של ערוצים שונים. עבור כל ROI, קו הבסיס מוגדר כעוצמה שלפני הגירוי, וניתן לנרמל את עקבות העוצמה לנקודת ההתחלה.
  5. לחץ על כלים | מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה. לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה, בתיקיית קבצים.
    1. זהה אירוע היתוך על ידי עלייה בו-זמנית בעוצמת הפלואורסצנציה הנקודתית PH-mNG (FPH) ו-A655 (F655) (בתוך מסגרת אחת), המלווה בירידה בפלואורסצנציה של נקודת FFN511 (FFFN).
    2. חפש את המראה של FPH PH ו- F655, המציין היווצרות נקודה PH-mNG / A655 עקב פרופיל Ω שנוצר על ידי היתוך, המאפשר דיפוזיה של PH-mNG מממברנת הפלזמה והפצה מתמשכת של A655 מהאמבטיה.
    3. חפשו ירידה ב-FFFN , אשר מציינת את שחרורה משלפוחית עקב פתיחת נקבוביות היתוך ואינה כוללת את האפשרות שהופעת FPH ו-F655 עשויה להיות מאינווגינציה של ממברנה הנגרמת על ידי אנדוציטוזה.
    4. בדוק את התמונותהקבועות של XY/Z בהילוך הזמן המציגות אירועי היתוך המתרחשים בתחתית התא. נתחו שלושה מצבים של אירועי היתוך: 1) היתוך קרוב, 2) היתוך שהייה, ו-3) היתוך-כיווץ.
      הערה: אירועי היתוך נצפו רק לעתים רחוקות לפני דה-פולריזציה, בעוד שניתן היה לצפות בעשרות אירועי היתוך לאחר דה-פולריזציה. לאחר ההיתוך, פרופיל Ω עשוי לסגור את הנקבובית שלו, לשמור על הנקבובית הפתוחה שלה או להתכווץ כדי להתמזג לתוך קרום הפלזמה.
      1. כדי לזהות היתוך קרוב, חפשו עמעום F655 מכיוון שסגירת נקבוביות היתוך מונעת את החלפת ה-A655 של האמבטיה, בעוד ש-FPH מתקיים, מה שמשקף את ההמרה המתמשכת של PtdIns(4,5)P2 ל-PtdIns(4)P, או FPH דועך עם השהיה, המשקף את הצביטה המתמשכת של שלפוחית (היתוך קרוב, איור 4A,B).
      2. חפשו FPH ו-F655 מתמשכים כדי לזהות היתוך שהייה (איור 4C).
      3. חפשו הפחתות מקבילות של FPH ו-F655, מה שמצביע על התכווצות בפרופיל Ω כדי לזהות היתוך כיווץ (איור 4D).
        הערה: בדוק את קבצי ההדמיה המקוריים כדי לבדוק את עקבות ההדמיה אם אינך בטוח לגבי סוג האירוע. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
  6. העלילה מייצגת עקבות של שינויי עוצמה עבור שלושת הערוצים האלה: FFN511, PH-mNG ו- A655. לכמת את אחוז מצבי ההיתוך השונים בכל תא ומספרי העלילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות ההליכים הניסיוניים שהוכחו באיור 1 ובאיור 2, תאי כרומפין מבלוטת יותרת הכליה של בקר הועתקו עם PH-mNG כדי לתייג את קרום הפלזמה; A655 נוסף לתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך; והנוירוטרנסמיטר הכוזב הפלואורסצנטי FFN511 הועמס בשלפוחיות לזיהוי שחרור. לאחר מכן, הדמיית זמן קונפוקלית במישור XY של FFN511, PH-mNG ו-A655 בוצעה כל 20-90 אלפיות השנייה בתחתית התא (מישור מוקד Z ~100-200 ננומטר מעל קרום התא). הקלטה של מהדק טלאי של תאים שלמים ויישום של דה-פולריזצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר 4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר אקסו-פיטום ואנדוציטוזה. עיבוד תמונה קונפוקלי שיטתי מספק מידע על מצבים שונים של התנהגויות נקבוביות לאירועי היתוך וביקוע.

ניטור סימולטני של זרמי סידן ושינויי קיבוליות באותו תא עם תצורת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים לתוכניות המחקר התוך-גופיות של NINDS (ZIA NS003009-13 ו- ZIA NS003105-08) על התמיכה בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין 5'-טריפוספט מלח מגנזיוםSigmaA9187-500MGATP להכנת תמיסה פנימית
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto צבע לתווית תמיסת אמבטיה
נוקלאופקטור בסיסי לנוירונים ראשונייםLonzaVSPI-1003מאגר טרנספקציה אלקטרופורציה יחד עם ערכת
בורוסיליקט פיפטה זכוכית נימיתוורנר מכשירים64-0795קיר סטנדרטי עם נימה OD = 2.0 מ"מ מזהה = 1.16 מ"מ אורך = 7.5 ס"מ
אלבומין סרום בקרסיגמאA2153-50Gמגיב לעיכול בלוטות
סידן כלוריד 2 Mאיכות ביולוגית351-130-721מגיב להכנת תמיסת אמבטיה
מסנני תאים, 100 ומיקרו; mFalcon352360חומר לסינון תרחיף תאי כרומפין
תמיסת צזיום הידרוקסידסיגמא232041מגיב להכנת תמיסה פנימית ומאגר מלאי Cs-glutamate/Cs-EGTA
קולגנאז Pסיגמא11213873001אנזים לעיכול בלוטות
CoverslipNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, קוטר 14 מ"מ.#1 עבה 60 חתיכות למינין כיסויים גרמניים מצופים
D-(+)-גלוקוזסיגמאG8270-1KGריאגנט להכנת לוק s תמיסה ופתרון אמבטיה
DMEMThermoFisher Scientific11885092מגיב להכנת מדיום תרבית
EGTASigma324626-25GMמגיב להכנת מאגר מלאי Cs-EGTA לתמיסת אמבטיה
אלקטרופורציה ונוקלאופקטורAmaxa BiosystemsNucleofector IIהעברת פלסמידים לתאים
סרום בקר עובריThermoFisher Scientific10082147מגיב להכנת מדיום תרבית
FFN511Abcamab120331נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי לסימון שלפוחיות
גואנוזין 5'-טריפוספט נתרן מלח הידרטSigmaG8877-250MGGTP להכנת תמיסה פנימית
HEPESSigmaH3375-500Gמגיב להכנת לוק' s פתרון
Igor ProWaveMetricsIgor proתוכנה לניתוח מהדק תיקון והצגת נתוני הדמיה
Leica Application Suite X תוכנהLeicaLAS Xתוכנה קונפוקלית לאיסוף וניתוח נתוני הדמיה
Leica TCS SP5 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeica LeicaTCS SP5מיקרוסקופ קונפוקלי לאיסוף
נתוני הדמיהL-חומצה גלוטמיתסיגמא49449-100Gמגיב להכנת מאגר מלאי Cs-גלוטמט לתמיסת אמבטיה
מגבר נעילהHekaLock-inתוכנה להקלטת קיבול
מגנזיום כלוריד 1 Mאיכות ביולוגית351-033-721EAמגיב להכנת תמיסה פנימית ותמיסת אמבטיה
המציטומטר מתכתי Hausser Bright-LineHausser Scientificתא ספירה3120
MicroforgeNarishigeMF-830פיפטות פולניות לשיפור היווצרותם ויציבותם של אטמי ג'יגה-אוהם
יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22 ומיקרו; mMilliporeSLGPR33RB חומר לשטיפה ועיכול
בלוטות mNG (mNeonGreen)אלל ביוטכנולוגיהABP-FP-MNEONSBתבנית ל-PH-mNeonGreen בנייה
ניילון רשת סינון מסך סינון 100 מיקרוןEIKO CO03-100/32חומר לסינון מתלה מדולה
מהדק תיקון EPC-10HekaEPC-10מגבר לנתוני תיקון-מהדק אוסף
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407עמוד שדרה לבנייה PH-mNeonGreen
חולץ פיפטהמכשיר סאטרP-97הכינו פיפטות להקלטת מהדק תיקון
אשלגן כלוריסיגמאP5404-500Gמגיב להכנת לוק ' s פתרון ופתרון אמבטיה
תוכנתדופק HekaPulse תוכנה לאיסוף נתוני תיקון-מהדק תא
הקלטה תא כיסויWarner Instruments64-1943/QR-40LPהחל פיפטה מהדק תיקון על תאים חיים
נתרן כלוריסיגמאS7653-1KGמגיב להכנת לוק' תמיסה, תמיסת אמבטיה ותמיסה פנימית
נתרן הידרוקסידסיגמאS5881-500Gמגיב להכנת לוק' s תמיסה
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמאS0876-500Gריאגנט להכנת לוק' s תמיסה
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמאS8282-500Gריאגנט להכנת לוק' s פתרון
ערבוב פלטה חמהBarnsted / Thermolyneסוג 10100תנור חימום לציפוי פיפטה עם מזרק שעווה
, 30 מ"לBecton Dickinson302832חומר לשטיפה ועיכול
של בלוטות Tetraethylammonium chlorideSigmaT2265-100GTEA להכנת תמיסת אמבטיה
מעכב טריפסיןSigmaT9253-5Gמגיב לעיכול בלוטות
סוג F נוזל טבילהLeica195371-10-9שמן הרכבה קונפוקלי של Leica
, : :

מקורות

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Patch Clamp
מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.