הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פצעי הקרנית העובריים של אפרוחים מציגים יכולת יוצאת דופן להתחדש באופן מלא ומהיר, בעוד שקרניות פצועות בוגרות חוות אובדן שקיפות עקב הצטלקות פיברוטית. שלמות הרקמה של הקרנית העוברית הפצועה משוחזרת באופן מהותי ללא היווצרות צלקת הניתנת לזיהוי. בהתחשב בנגישותו ובקלות המניפולציה שלו, עובר האפרוח הוא מודל אידיאלי לחקר תיקון פצעי הקרנית ללא צלקות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים העובריים המוקדמים כדי לגשת לעין. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-אמבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, המתאימים למועד שבו נוצרות שלוש השכבות התאית של הקרנית. שלישית, פצעי קרנית ליניאריים החודרים לשכבת האפיתל החיצונית ולסטרומה הקדמית מיוצרים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה. מחקרים שנערכו עד כה באמצעות מודל זה גילו כי קרניות עובריות פצועות מציגות הפעלה של התמיינות קרטוציטים, עוברות שיפוץ מתואם של חלבוני ECM למבנה המאקרו התלת-ממדי הטבעי שלהן, והופכות להיות מופנמות מחדש כראוי על ידי עצבים חושיים של הקרנית. בעתיד, ניתן יהיה לנתח את ההשפעה הפוטנציאלית של גורמים אנדוגניים או אקסוגניים על תהליך ההתחדשות בריפוי קרניות באמצעות טכניקות ביולוגיות התפתחותיות, כגון השתלת רקמות, אלקטרופורציה, זיהום רטרו-ויראלי או השתלת חרוזים. האסטרטגיה הנוכחית מזהה את הגוזל העוברי כפרדיגמה ניסיונית מכרעת להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.
מבוא
הקרנית היא הרקמה השקופה והחיצונית ביותר של העין שמעבירה ושוברת אור התורם לחדות הראייה. בקרנית הבוגרת, נזק או זיהום לסטרומה הקרנית מובילים לתגובת ריפוי פצעים מהירה וחזקה המאופיינת בשגשוג קרטוסיטים, פיברוזיס, דלקת מוגברת המובילה לאפופטוזיס הנגרמת על ידי ציטוקינים, יצירת מיופיברובלסטים לתיקון, ושיפוץ כולל של המטריצה החוץ-תאית (ECM)1,2 . בעקבות הפציעה, תיקון רקמת הקרנית גורם לרקמת צלקת אטומה המפחיתה את שקיפות הקרנית ומונעת את מעבר האור, ובכך מעוותת את הראייה ובמקרים הקשים ביותר, מובילה לעיוורון הקרנית3. לפיכך, יש צורך ברור לפתח מודלים אמינים של בעלי חיים כדי לטפל במורכבות של ריפוי פצעים ולז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
זן הביצים ששימש בפרוטוקול זה היה White Leghorn, וכל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי ווסליאן.
1. דגירה של ביצי אפרוחים
- יש לשמור על הביצים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לאחר הטלתן כדי לעצור את ההתפתחות. כאשר אתם מוכנים להתחיל את התפתחות העובר של אפרוח, נגבו את כל קליפת הביצה במגבונים נטולי מוך (ראו טבלת חומרים) רוויים במים בטמפרטורת החדר כדי להסיר לכלוך ופסולת.
- ודאו שקליפת הביצה מחוטאת. נגבו את כל משטח הביצה במגבונים נטולי מוך עם 70% אתנול. נגבו במהירות את האתנול כדי לייבש את הביצית והימנעו מספיגת אתנול דרך קליפת הבי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הניתוח המוקדם יותר של ACM ו-CAM ב-E5.5 כדי לחשוף את אזור הגולגולת של העובר המתפתח, נוצרה באובו סדרה של חתכים שהשתרעו על פני הקרנית המרכזית E7 (איור 1). פצע אידיאלי לחקר התחדשות הקרנית מתרחש בעקבות שלושה חתכים, שכל אחד מהם מיוצר באותו מיקום של הקרנית. החתך הראשון חוצה את אפיתל הקרנית, ואילו החתכים השני והשלישי חודרים לקרום המרתף שמתחתיו ולסטרומה הקדמית, בהתאמה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו-דיסקציה חדה (ראו טבלת חומרים) ולהפעיל את כמות הלחץ הנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
האפרוח הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר תיקון פצעי קרנית עובריים, ללא צלקות. בניגוד ליונקים, האפרוח נגיש בקלות לאורך כל הפיתוח באמצעות אסטרטגיות אובו8 או אקס אובו 24. הקרנית של האפרוח העוברי גדולה בהרבה מהקרניות של מכרסמים, כאשר כמעט 50% מנפח הגולגולת מוקדש לעין25, מה שהופך אותה למקובלת מאוד על מניפולציות פיזיות כמו פציעה. יתר על כן, ביצי עוף זמינות בקלות כל השנה, לעתים קרובות מחוות מקומיות, וחסכוניות, ודורשות רק חממה צנועה כדי לתמוך בפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים בנוגע למידע המוצג בכתב יד זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח אמנותי ומלומד דרך אוניברסיטת אילינוי ווסליאן ל- TS ומומנה בחלקה על ידי NIH-R01EY022158 (PL).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 18 G מחט היפודרמית | פישר סיינטיפיק | 14-826-5D | |
| סכין מיקרו-חיתוך בזווית 30 מעלות | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | בדיקות מולקולריות | D1306 | |
| 5 מ"ל מזרק | פישר סיינטיפיק | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor תווית נוגדנים | משנייםבדיקות מולקולריות | ||
| סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| מגשי ביצי עוף | GQF | O246 | |
| מלקחיים לניתוח, קצה עדין, משוננים | VWR | 82027-408 | |
| מספריים לניתוח, קצה חד | VWR | 82027-578 | |
| איריס 1 x 2 רקמת שיניים מלקחיים, VWR מעוקל מלא | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| מספריים מיקרו-ניתוחים | VWR | 470315-228 | |
| עכבר אנטי פיברונקטין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | B3 / D6 | |
| עכבר אנטי למינין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | 3H11 | |
| עכבר אנטי-נוירונים ספציפי β-טובולין (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| עכבר אנטי-טנאסצין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | M1-B4 | |
| פרפורמלדהיד | סיגמא | 158127 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא | P4333 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Sigma | P5405 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 חממת ביצים | GQF | 1502 | |
| קרע באריזה ידנית (רוחב 1.88 אינץ') | סקוטש | n/a |
מקורות
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
