הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פצעי הקרנית העובריים של אפרוחים מציגים יכולת יוצאת דופן להתחדש באופן מלא ומהיר, בעוד שקרניות פצועות בוגרות חוות אובדן שקיפות עקב הצטלקות פיברוטית. שלמות הרקמה של הקרנית העוברית הפצועה משוחזרת באופן מהותי ללא היווצרות צלקת הניתנת לזיהוי. בהתחשב בנגישותו ובקלות המניפולציה שלו, עובר האפרוח הוא מודל אידיאלי לחקר תיקון פצעי הקרנית ללא צלקות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים העובריים המוקדמים כדי לגשת לעין. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-אמבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, המתאימים למועד שבו נוצרות שלוש השכבות התאית של הקרנית. שלישית, פצעי קרנית ליניאריים החודרים לשכבת האפיתל החיצונית ולסטרומה הקדמית מיוצרים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה. מחקרים שנערכו עד כה באמצעות מודל זה גילו כי קרניות עובריות פצועות מציגות הפעלה של התמיינות קרטוציטים, עוברות שיפוץ מתואם של חלבוני ECM למבנה המאקרו התלת-ממדי הטבעי שלהן, והופכות להיות מופנמות מחדש כראוי על ידי עצבים חושיים של הקרנית. בעתיד, ניתן יהיה לנתח את ההשפעה הפוטנציאלית של גורמים אנדוגניים או אקסוגניים על תהליך ההתחדשות בריפוי קרניות באמצעות טכניקות ביולוגיות התפתחותיות, כגון השתלת רקמות, אלקטרופורציה, זיהום רטרו-ויראלי או השתלת חרוזים. האסטרטגיה הנוכחית מזהה את הגוזל העוברי כפרדיגמה ניסיונית מכרעת להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.
מבוא
הקרנית היא הרקמה השקופה והחיצונית ביותר של העין שמעבירה ושוברת אור התורם לחדות הראייה. בקרנית הבוגרת, נזק או זיהום לסטרומה הקרנית מובילים לתגובת ריפוי פצעים מהירה וחזקה המאופיינת בשגשוג קרטוסיטים, פיברוזיס, דלקת מוגברת המובילה לאפופטוזיס הנגרמת על ידי ציטוקינים, יצירת מיופיברובלסטים לתיקון, ושיפוץ כולל של המטריצה החוץ-תאית (ECM)1,2 . בעקבות הפציעה, תיקון רקמת הקרנית גורם לרקמת צלקת אטומה המפחיתה את שקיפות הקרנית ומונעת את מעבר האור, ובכך מעוותת את הראייה ובמקרים הקשים ביותר, מובילה לעיוורון הקרנית3. לפיכך, יש צורך ברור לפתח מודלים אמינים של בעלי חיים כדי לטפל במורכבות של ריפוי פצעים ולזהות את הגורמים התאיים והמולקולריים האחראים לסגירת פצעים ולהתחדשות רקמות.
עד כה, רוב המחקרים שבחנו ריפוי פצעי קרנית השתמשו במודלים של בעלי חיים לאחר הלידה4 או בוגרים 1,2,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה הובילו להתקדמות משמעותית בהבנת תגובת ריפוי פצעי הקרנית והמנגנונים העומדים בבסיס היווצרות צלקות, רקמות הקרנית הפגועות במודלי ריפוי אלה אינן מצליחות להתחדש באופן מלא, ובכך מגבילות את התועלת שלהן לזיהוי הגורמים המולקולריים והמנגנונים התאיים האחראים לשיקום מלא של המורפולוגיה והמבנה הקרנית לאחר הפציעה. לעומת זאת, פצעים עובריים הנוצרים באמצעות סכין בקרנית האפרוח העוברי הם בעלי יכולת פנימית להחלים באופן מלא בצורה נטולת צלקות8. באופן ספציפי, קרנית האפרוח העוברית מציגה התחדשות לא-פיברוטית עם שחזור מלא של מבנה המטריצה החוץ-תאית ודפוסי העצבנות 8,9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר רצף של שלבים המעורבים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים עובריים מוקדמים כדי להקל על הגישה לעובר. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-ממבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, המתאימים לזמן שבו נוצרות שלוש השכבות התאיות של הקרנית ורצוי פצע. שלישית, חתכי קרנית מרכזיים ליניאריים החודרים דרך אפיתל הקרנית ולתוך הסטרומה הקדמית נעשים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
זן הביצים ששימש בפרוטוקול זה היה White Leghorn, וכל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי ווסליאן.
1. דגירה של ביצי אפרוחים
- יש לשמור על הביצים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לאחר הטלתן כדי לעצור את ההתפתחות. כאשר אתם מוכנים להתחיל את התפתחות העובר של אפרוח, נגבו את כל קליפת הביצה במגבונים נטולי מוך (ראו טבלת חומרים) רוויים במים בטמפרטורת החדר כדי להסיר לכלוך ופסולת.
- ודאו שקליפת הביצה מחוטאת. נגבו את כל משטח הביצה במגבונים נטולי מוך עם 70% אתנול. נגבו במהירות את האתנול כדי לייבש את הביצית והימנעו מספיגת אתנול דרך קליפת הביצית אל העובר.
- מסדרים את הביצים בצורה אופקית על מגש. סמן את החלק העליון של הביצית כדי לציין את המיקום הצפוי של העובר. דגירה אופקית של הביצים, כאשר פונקציית הנדנדה מופעלת, באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס.
2. חלון הביצים כדי להתכונן לנתיחה של קרום
- מוציאים ביצים מהחממה ביום השלישי להתפתחות העוברית (E3). מעקרים את החלק העליון של הביצים עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו עם 70% אתנול. מייבשים את האתנול ממשטחי קליפת הביצה.
הערה: כדי להבטיח שהפיתוח לא יתעכב במהלך הליך החלונות, הוסרו 6-12 ביצים, וההליך בוצע במהירות על אלה בזמן שהביצים הנותרות הושארו באינקובטור. - מקמו ביצה בצורה אופקית במחזיק ביצה מאובטח (ראו טבלת חומרים). באמצעות הקצה החד של מספריים ניתוח, ליצור חור קטן בחלק העליון של קליפת הביצה ליד הקצה המחודד של הביצה.
הערה: חור זה יקל על הסרת אלבומן, הנחוצה כדי להפיל את החלמון והעובר הרחק ממשטח קליפת הביצה הפנימי. עבור מחזיקי ביצים, נעשה שימוש בדירות מילוי ביצים עיסת נייר, שבתוכם נשלחות הביצים. - דרך החור (שלב 2.2.), הכניסו מחט היפודרמית משופעת של 18 גרם. כאשר המחט נדחפת אל המשטח הפנימי התחתון של הביצה והצד המשופע של המחט פונה לקצה המחודד של הביצה (למשל, הרחק מהמיקום הצפוי של החלמון והעובר ליד אמצע הביצה), יש להסיר 2-3 מ"ל של אלבומן מביצת התרנגולת ולהשליך.
הערה: אם המחט של האדם תניק את העובר או את כלי הדם הקשורים אליו במהלך שלב זה, זה יגרום לכך שהדם ישאף לאלבומן. זה יגרום למוות של עובר. יתר על כן, אם החלמון שואף בשוגג יחד עם האלבומן במהלך שלב זה, העובר לא יהיה בר קיימא. בכל מקרה, יש להשליך את הביצית אם לא ניתן להשתמש בעובר באופן מיידי למטרות אחרות. - נקו את משטח קליפת הביצה המקיף את החור עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו קלות עם 70% אתנול ונגבו את הייבוש. אטום את החור שנועד להסרת אלבומן עם סרט שקוף.
- עם הקצה החד של ניתוח המספריים, צרו חור "חלון" שני בחלק העליון של קליפת הביצה באתר הסימון (שלב 1.3.). יש לוודא שהמספריים אינם מתרחבים רחוק מדי לתוך קליפת הביצית כדי להימנע ממגע ופגיעה בעובר או בכלי הדם העובריים, שלעתים קרובות ימוקמו בתוך הביצית ישירות מתחת לאתר החור השני.
- באמצעות מלקחיים מעוקלים של הקשתית, מרחיבים את חור ה"חלון" כך שיתפרש על פני כ-2-3 ס"מ קוטרם ומשמשים כ"חלון" לעובר המתפתח שמתחת לקליפה.
- הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה. ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של 2-3 ס"מ שמכסה ישירות את העובר.
הערה: ביצים שבהן העוברים אינם מוטלים ישירות מתחת לחור שנוצר בשלב 2.6. אסור להשתמש בהם מכיוון שניתוחי הממברנה הקרובים יהיו מאתגרים להשלמה. אפילו עם נדנדה אופקית של הביצים, כ -10% מהביצים אינן שמישות בשל המיקום הלקוי של העובר. עוברים אלה יכולים לשמש למטרות אחרות.
- הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה. ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של 2-3 ס"מ שמכסה ישירות את העובר.
- כדי להגביל את הזיהום החיידקי, יש להוסיף דרך חור החלון (למשל, לתוך הביצה) ~ 100-200 μL של תמיסת רינגר (8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, ו-0.23 גרם של CaCl2.2H 20 לכל L של H20 מזוקק) המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין (50 U/mL של פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, ראה טבלת חומרים).
- אטמו את חור החלון באמצעות סרט דבק שקוף. בצע את איטום הביצה על ידי יישור פינה של הסרט על הציר הארוך של החור ולחיצה על הקלטת לקליפה במרחק של כ-1-2 ס"מ מקצה החור.
- ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הסרט יחד, יצרו צורה כיפה מעל החור, ולחצו על דש הסרט התלוי יתר על המידה על הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.
הערה: ביצים צריכות להיות בחלון E2 או E3. לפי הניסיון, חלון לפני E2 גורם לכדאיות עוברית נמוכה. יתר על כן, על ידי E4, העובר והממבריונים החוץ-אמבריוניים נקשרים לקליפת הביצה10, וכל ניסיון לחלון E4 או מאוחר יותר גורם לעתים קרובות לפגיעה בעוברים או לקריעה של כלי דם חוץ-ממבריוניים, כאשר כל אחד מהאירועים מוביל לתוצאה של מוות עוברי.
- ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הסרט יחד, יצרו צורה כיפה מעל החור, ולחצו על דש הסרט התלוי יתר על המידה על הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.
- להחזיר את הביצים "החלונות" לחממה להמשך פיתוח. הקפידו לשמור על הביצים אופקיות ולכבות את פונקציית הנדנדה של האינקובטור.
- חזור על שלבים 2.2.-2.9. עבור כל ביצה.
3. מיקרו-דיסקציות של הקרומים החוץ-ממבריוניים
- הסר ביצה עם חלונות E5.5 מהאינקובטור. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים.
- השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לצפות בעובר ובקרומים החוץ-ממבריוניים שלו דרך החלון. במידת הצורך, השתמשו במספריים או במלקחיים מעוקלים של הקשתית כדי להרחיב את החלון כך שהעובר ימוקם היטב מתחת לחלון, תוך הקפדה שלא לפגוע בכלי הדם העובריים.
- הוסיפו שתי טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהעובר נמצא בשלב ההתפתחותי הנכון (המבורגר המילטון שלב 27, ~E5.5)11,12 ואתר את מיקומם של קרום השפיר (ACM) והממברנה הכוריואלנטואית (CAM).
הערה: בשלב זה, העובר מוקף ב-ACM, הכולל את קרום מי השפיר ואת הממברנה הכוריונית העילית המתמזגת ומכוסה חלקית באלנטואה בעלת כלי הדם הגבוהים, המשתרעת מאזור המעיים של העובר ומתמזגת עם כוריון הכיסוי ליצירת CAM11,12. ה-ACM אינו בעל כלי דם כבדים, מה שמאפשר לנתח את הממברנות הללו כדי לחשוף את העובר מבלי לפגוע בכלי הדם ולפגוע בעובר. - בצע ניתוחי קרום חוץ-אמבריוניים בשלב זה (E5.5).
הערה: E5.5 הוא הזמן האידיאלי לבצע את ניתוחי הממברנה החוץ-אמבריונית. ניתוח הממברנות מוקדם יותר (למשל, ב-E4) לפני היווצרות CAM מפחית את נגישות העוברים בשלבים מאוחרים יותר11. יתר על כן, ב- E5.5, העובר מכוסה רק באופן חלקי על ידי ה- CAM בעל כלי הדם הגבוהים, אך במהלך 1-2 הימים הבאים, ה- CAM עוטף במהירות ומונע גישה נוספת לעובר11,12. מסיבה זו, כריתת ממברנה ב- E6 ואילך מאתגרת ככל שהסיכון לקריעת כלי דם עולה.- השתמשו בזוג מלקחיים עדינים מעוקרים כדי לתפוס בעדינות את ה-ACM ולהרחיק אותו מהעובר. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור ב- ACM ישירות מעל המצח המשתרע מהממברנה מעל הממברנה שמעל המצח ועד לממברנה שמעל הראש.
הערה: צעד זה מרגיע את קרום הכוריון והאמניון, ובכך מקל על אחיזתם וניתוחם עוד יותר עם מלקחיים בשלבים הבאים. ראו איור 1 לשרטוט מועיל של האופן שבו מנתחים את הממברנות דרך חלון קליפת הביצה.
- השתמשו בזוג מלקחיים עדינים מעוקרים כדי לתפוס בעדינות את ה-ACM ולהרחיק אותו מהעובר. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור ב- ACM ישירות מעל המצח המשתרע מהממברנה מעל הממברנה שמעל המצח ועד לממברנה שמעל הראש.
- השתמש בשני זוגות של מלקחיים עדינים וסטריליים כדי לתפוס בעדינות את השן בשתי תנוחות סמוכות בין ה-ACM ל-CAM (למשל, אזור בין החתך שנעשה מעל ה-forelimb לקצה הקרוב ביותר של ה-CAM).
- הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה, כאשר זוג אחד נע בגב אל העובר והשני בגחון.
הערה: תנועה זו משמשת לקריעת השן עוד יותר תוך הפרדת ה-ACM (הנמשך בכיוון הגב ביחס לעובר על ידי זוג מלקחיים אחד) לבין ה-CAM (הנמשך בכיוון הגחון ביחס לעובר על ידי זוג המלקחיים השני). - יש לוודא שהממברנות מופרדות כאשר ה-CAM אינו מכסה עוד את העובר, והעורק והווריד האלנטואיים, הנובעים מהמעיים העובריים אל ה-CAM, נראים לעין בקלות.
- הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה, כאשר זוג אחד נע בגב אל העובר והשני בגחון.
- השתמש במלקחיים עדינים מעוקרים כדי לנתח ולהסיר את כל קרום השן שנותר המכסה את העובר. זה נפוץ ביותר ציין כי אמנון הנותרים יכסה חלקית את המחצית הקאודלית של העובר.
- באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את השמניון ליד אזור אמצע הגולגולת של העובר ומשכו בזהירות את האמניון בכיוון קאודלי ביחס לעובר לכיוון ה-CAM שנעקר מוקדם יותר. העובר ייחשף כעת באופן מלא, וצמיחה נוספת של ה-CAM תתרחש בעיקר הרחק מהעובר המתפתח.
הערה: ראה איור 1 לקבלת סכמות מועילות לגבי האופן שבו העובר שנחשף יופיע לאחר כריתת ממברנה. כמו כן, עיין בדוח11 שפורסם בעבר לקבלת דיאגרמות סכמטיות מועילות של שלבים 3.3.-3.6.
- באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את השמניון ליד אזור אמצע הגולגולת של העובר ומשכו בזהירות את האמניון בכיוון קאודלי ביחס לעובר לכיוון ה-CAM שנעקר מוקדם יותר. העובר ייחשף כעת באופן מלא, וצמיחה נוספת של ה-CAM תתרחש בעיקר הרחק מהעובר המתפתח.
- הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- אטום מחדש את חור החלון באמצעות סרט שקוף, כמתואר בשלב 2.8. מחזירים את הביצה לחממה להמשך פיתוח, שומרים על הביצה אופקית ושומרים על תפקוד הנדנדה של האינקובטור מושבת.
- חזור על שלבים 3.1.-3.8. עבור כל ביצה.
הערה: ניתוחי הממברית החוץ-אמבריונית ב-E5.5 שתוארו לעיל יאפשרו גישה לעובר דרך E7, כלומר כאשר ניתן לבצע פציעה 8,9. על ידי E8, הצמיחה המתמשכת של רקמת CAM מתחילה לכסות את אזור הגולגולת של העובר, ובכך מונעת גישה נוספת לקרנית. אם רוצים לבצע פציעה בקרניות E8-E9 ישנות יותר, ניתן למקם מחדש את הגחון של CAM הגדל ביחס לעובר (שלב 3.10)." אם רוצים לפצוע ב-E7, שלב 3.10. אין צורך לבצע ואפשר להמשיך לשלב 4, פציעת הקרנית. - הסר ביצת E7 מהאינקובטור שהקרום החוץ-אמבריוני שלה נותח בעבר ב- E5.5 (שלבים 3.1.-3.8.). תפסו עם מלקחיים מעוקרים כל רקמות קרום אמניון זמינות שהתמזגו עם ה-CAM ומשכו בעדינות את קרום האניון הרחק מאזור הגולגולת של העובר בכיוון הגחון ביחס לעובר.
הערה: מכיוון שקרום השפיר שנעקר מהעובר מתמזג עם ה-CAM, ה-CAM הגדלה והסקולרית מאוד תעקוב אחר המלקחיים האוחזים באמניון ותתרחק מאזור הגולגולת. חזור על שלב זה מדי יום כדי להרחיק את ה- CAM ללא הרף מהעובר עד שהעובר נמצא בגיל הרצוי לפציעה.
4. פציעת קרנית
- קבל ביצה מהחממה לפציעה בגיל העוברי הרצוי, E7-E9. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים. הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- השתמשו בסכין מיקרו-ניתוחית כדי ליצור חתך שמשתרע על פני היקף הקרנית של עין ימין (בשל האופן שבו העובר מטיל את הביצית, עין שמאל אינה נגישה אך יכולה לשמש כבקרה שאינה פצועה), המקבילה לסדק הכורואידי (איור 1) ובהתאם לו. החתך הראשון יחצה את אפיתל הקרנית.
- השתמש בסכין המיקרו-ניתוח כדי לחתוך שוב את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון פי 2 יותר (למשל, שלושה חתכים בסך הכל, כאשר חתך 2 וחתך 3 מתרחשים יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו חתך 1)11. החתך השני יחצה את קרום המרתף, והשלישי יחדור את הסטרומה הקדמית.
הערה: אם העובר התיישב תחת ה-CAM המנותח, ניתן להשתמש במלקחיים מעוקלים מעוגלים מעוגלים מעוקרים של הקשתית כדי להזיז בזהירות את הראש החוצה מתחת ל-CAM. מקם את מלקחי הקשתית המעוקלים מתחת לראש, תוך יצירת מגע עם הצד השמאלי של הראש. ערסלו את כל הראש על גבי מלקחיים סגורים מעוקלים של הקשתית והרימו בעדינות את הראש סביב ומעל ה-CAM. כדי לסייע בכדאיות, השתמש בטכניקה דומה עם מלקחיי הקשתית המעוקלים כדי לתחוב את העובר בחזרה מתחת ל- CAM לאחר הניתוח כדי לקדם צמיחה נכונה של ה- CAM.
- השתמש בסכין המיקרו-ניתוח כדי לחתוך שוב את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון פי 2 יותר (למשל, שלושה חתכים בסך הכל, כאשר חתך 2 וחתך 3 מתרחשים יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו חתך 1)11. החתך השני יחצה את קרום המרתף, והשלישי יחדור את הסטרומה הקדמית.
- הוסיפו 3-4 טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- אטום מחדש את חור החלון בנייר דבק שקוף וחזור לחממה, תוך השארת הביצה אופקית. אפשרו לעובר להתפתח ולפצע הקרנית להחלים לתקופה הרצויה (למשל, 0.5-11 יום), ולאחר מכן להרדים את העובר באופן הומני על ידי עריפת ראשים.
- השתמשו במלקחי קשתית מעוקלים כדי לקצור את העין מעובר המתת חסד שצף בצלחת פטרי של תמיסת המלח של רינגר על ידי אחיזה עדינה של העין בצד האחורי שלה, היכן שהעין ורקמת הפנים נפגשות, והרמת העין כולה בזהירות הרחק והשתחררות מרקמת הפנים.
- השתמש במלקחיים עדינים כדי לתקוע חור קטן (3-5 ס"מ) בחלק האחורי של העין כולה ולתקן את כל העין ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C ב הלילה עם תסיסה קלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הניתוח המוקדם יותר של ACM ו-CAM ב-E5.5 כדי לחשוף את אזור הגולגולת של העובר המתפתח, נוצרה באובו סדרה של חתכים שהשתרעו על פני הקרנית המרכזית E7 (איור 1). פצע אידיאלי לחקר התחדשות הקרנית מתרחש בעקבות שלושה חתכים, שכל אחד מהם מיוצר באותו מיקום של הקרנית. החתך הראשון חוצה את אפיתל הקרנית, ואילו החתכים השני והשלישי חודרים לקרום המרתף שמתחתיו ולסטרומה הקדמית, בהתאמה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו-דיסקציה חדה (ראו טבלת חומרים) ולהפעיל את כמות הלחץ הנ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
האפרוח הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר תיקון פצעי קרנית עובריים, ללא צלקות. בניגוד ליונקים, האפרוח נגיש בקלות לאורך כל הפיתוח באמצעות אסטרטגיות אובו8 או אקס אובו 24. הקרנית של האפרוח העוברי גדולה בהרבה מהקרניות של מכרסמים, כאשר כמעט 50% מנפח הגולגולת מוקדש לעין25, מה שהופך אותה למקובלת מאוד על מניפולציות פיזיות כמו פציעה. יתר על כן, ביצי עוף זמינות בקלות כל השנה, לעתים קרובות מחוות מקומיות, וחסכוניות, ודורשות רק חממה צנועה כדי לתמוך בפ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים בנוגע למידע המוצג בכתב יד זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח אמנותי ומלומד דרך אוניברסיטת אילינוי ווסליאן ל- TS ומומנה בחלקה על ידי NIH-R01EY022158 (PL).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 18 G מחט היפודרמית | פישר סיינטיפיק | 14-826-5D | |
| סכין מיקרו-חיתוך בזווית 30 מעלות | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | בדיקות מולקולריות | D1306 | |
| 5 מ"ל מזרק | פישר סיינטיפיק | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor תווית נוגדנים | משנייםבדיקות מולקולריות | ||
| סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| מגשי ביצי עוף | GQF | O246 | |
| מלקחיים לניתוח, קצה עדין, משוננים | VWR | 82027-408 | |
| מספריים לניתוח, קצה חד | VWR | 82027-578 | |
| איריס 1 x 2 רקמת שיניים מלקחיים, VWR מעוקל מלא | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| מספריים מיקרו-ניתוחים | VWR | 470315-228 | |
| עכבר אנטי פיברונקטין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | B3 / D6 | |
| עכבר אנטי למינין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | 3H11 | |
| עכבר אנטי-נוירונים ספציפי β-טובולין (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| עכבר אנטי-טנאסצין (IgG1) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | M1-B4 | |
| פרפורמלדהיד | סיגמא | 158127 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא | P4333 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Sigma | P5405 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 חממת ביצים | GQF | 1502 | |
| קרע באריזה ידנית (רוחב 1.88 אינץ') | סקוטש | n/a |
מקורות
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
- Waldvogel, J. A. The bird's eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
