מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

תקציר

אינטראקציות קצרות מועד או חולפות של מקרומולקולות בממברנות השומנים ועםיהן, ממשק שבו מתרחשות תגובות ביולוגיות חיוניות רבות, קשות מטבען להערכה בשיטות ביופיזיות סטנדרטיות. הכנסת מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה (MSPT) מהווה צעד חשוב לקראת אפיון כמותי יסודי של תהליכים כאלה. מבחינה טכנית, הדבר התאפשר הודות להופעתה של מיקרוסקופיית פיזור אינטרפרומטרית (iSCAT) המבוססת על פוטומטריית מסה (MP). כאשר אסטרטגיית הסרת הרקע ממוטבת כדי לחשוף את התנועה הדו-ממדית של חלקיקים הקשורים לממברנה, טכניקה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של הן דיפוזיה והן של מסה מולקולרית של מקרומולקולות ללא תווית על ממברנות ביולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לביצוע וניתוח מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה של מערכות הקשורות לממברנה. מדידות המבוצעות על פוטומטר מסה מסחרי משיגות רזולוציית זמן במשטר אלפיות השנייה, ובהתאם למערכת MP, מגבלת זיהוי מסה עד 50 kDa. כדי להציג את הפוטנציאל של MSPT לניתוח מעמיק של דינמיקת מקרומולקולה מזורזת על ידי ממברנה באופן כללי, מוצגות תוצאות המתקבלות עבור מערכות חלבונים למופת כגון האינטראקציה עם הממברנה המקומית annexin V.

מבוא

ממברנות ביולוגיות, שבעבר נתפסו רק כמחסום מפני המגוון הרחב של התנאים הפיזיקליים הסביבתיים, נחשבות כיום לישויות פונקציונליות ולפלטפורמות קטליטיות ^1,2. בהתבסס על יכולתם למקם, להגביר ולכוון אותות בתגובה לתגובות מקרומולקולות הקשורות לממברנה, ממשקי שומנים מהווים מרכיב חיוני למגוון רחב של תהליכים תאיים כגון סחר בממברנה ומפלי איתות ^3,4,5. חיבור הממברנה, המשמש כאתר גרעין להרכבת קומפלקסים יציבים, מסתמך לעתים קרובות על שיווי משקל דינמי בין צורות מקרומולקולות הקשורות לממברנה לציטוזולים, ולכן הוא בעל אופי חולף ^6,7.

למרות חשיבותם הרבה בביולוגיה, עד כה היה מאתגר לפתח שיטות שיכולות לספק גישה להטרוגניות הקומפוזיציונית, המרחבית והזמנית של תגובות מקרומולקולות הקשורות לממברנה בזמן אמת ^7,8. כדי לפתור את התהליכים המולקולריים הבסיסיים, שני היבטים ניסיוניים הם מכריעים: רזולוציית זמן מספקת ורגישות של חלקיק יחיד. לכן, לטכניקות ממוצעות של אנסמבל כגון התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת תמונות (FRAP) אך גם ספקטרוסקופיית המתאם הפלואורסצנטית הרגישה הרבה יותר (FCS) יש מגבלות, שכן הן במידה רבה משחררות מידע מרחבי ממידע טמפורלי⁹. צעד חשוב לקראת אפיון הדינמיקה של מולקולות בודדות היה אפוא הופעתו של מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) בשילוב עם מיקרוסקופיה רגישה ביותר. בפרט, שתי גישות SPT הוכיחו את עצמן כיעילות בהקשר זה. ראשית, השימוש בפלואורופורים כתוויות ובמערכות זיהוי הפלואורסצנציה המתאימות סללו את הדרך לדיוק ננומטר ולרזולוציה של אלפיות השנייה^של 10,11,12. שנית, גילוי מבוסס פיזור באמצעות ננו-חלקיקי זהב שיפר הן את דיוק הלוקליזציה והן את רזולוציית הזמן לטווח התת-ננומטר והמיקרו-שניות, בהתאמה 13,14,15,16. למרות היתרונות הרבים של שתי הגישות ותרומתן המשמעותית ביחס להבנה המכניסטית של מערכות הקשורות לממברנה^17,18, שתי הטכניקות היו מוגבלות עד כה: הן דורשות תיוג של המולקולות המעניינות, מה שעלול להפריע להתנהגותן הטבעית והן חסרות רגישות להרכב המולקולרי של חלקיקים הקשורים לממברנה^19,20.

שתי המגבלות הללו התגברו לאחרונה על ידי הצגת גישה חדשנית המבוססת על פיזור אינטרפרומטרי (iSCAT) המכונה פוטומטריית מסה (MP)21,22,23. טכניקה זו מאפשרת לקבוע התפלגויות מסה בתמיסה של ביו-מולקולות על פי ניגודיות ה-iSCAT שלהן בעת נחיתה על ממשק זכוכית. עם זאת, לצורך זיהוי ואפיון של מולקולות ניידות המתפזרות על ממברנות השומנים, היה צורך לפתח גישה מתוחכמת יותר לניתוח תמונות. זה יושם בינתיים בהצלחה ומאפשר לזהות, לעקוב ולקבוע את המסה המולקולרית של ביו-מולקולות בודדות ללא תווית המתפזרות בממשק שומנים^24,25. טכניקה זו, המכונה פוטומטריית מסה דינמית או מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה (MSPT), מאפשרת כיום הערכה של אינטראקציות מקרומולקולות מורכבות על ידי רישום ישיר של שינויים במסה המולקולרית של הישויות שנמצאות במעקב, ובכך פותחת אפשרויות חדשות לניתוח מכניסטי של דינמיקה מולקולרית הקשורה לממברנה.

כאן מוצג פרוטוקול מפורט להכנת דגימות, הדמיה וצינור ניתוח הנתונים הנדרש עבור MSPT. בפרט, נדונים דרישות מדגם ובעיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש במהלך המדידה והניתוח. יתר על כן, הפוטנציאל שאין שני לו לנתח מערכות מקרומולקולות המתקשרות עם ממברנות מוצג באמצעות תוצאות מייצגות שונות.

פרוטוקול

1. הכנה לדוגמה

1. דור שלפוחיות מולטי-לאמלריות (MLVs)
   1. חשב את כמות השומנים המומסים בכלורופורם בהתאם לתערובת השומנים הרצויה ונפח ההשעיה הנדרש.
      הערה: ריכוז שלפוחית סופי של שומנים במינון 4 מ"ג/מ"ל מומלץ למאגר ההחייאה (תגובה).
   2. פיפטה את הנפח המחושב של שומנים לתוך בקבוקון זכוכית 1.5 מ"ל באמצעות פיפטות תזוזה חיוביות המצוידות בקצות זכוכית.
   3. מאדים את ממס השומנים תחת זרם קלוש של חנקן ומסובבים כל הזמן את הבקבוקון כדי להבטיח חלוקה שווה של השומנים על דפנות הזכוכית.
   4. הבטיחו אידוי מלא של הממסים על ידי הנחת הבקבוקון תחת זרם קבוע של חנקן למשך 15 דקות.
   5. הסר עקבות שיוריים של כלורופורם על ידי ייבוש ואקום במייבש ואקום למשך שעה נוספת.
   6. מייבשים מחדש את תערובת השומנים במאגר ההחייאה (תגובה) הרצוי ומסובבים היטב את ההשעיה עד שסרט השומנים מומס מדפנות הבקבוקון.
      הערה: מאגר התגובה אמור להבטיח פעילות ויציבות של חלבונים. מאגר התגובה ששימש במחקר זה מכיל 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5), 150 mM KCl ו- 5 mM MgCl₂. שימו לב שכל מאגר המשמש לדילול שומנים או חלבונים צריך להיות מסונן כדי להסיר זיהומים חלקיקיים מפריעים (ראו שלב 5).
2. דור של שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (רכבי שטח)
   1. עבור מחזורי הפשרה בהקפאה רצופים של החייאת השומנים (שלב 1.1.6), מרתיחים 500 מ"ל מים בכוס על צלחת חמה (בין 70 °C (70 °C (70 °C (70 °C עד 99 °C)) ומכינים מיכל עם חנקן נוזלי.
   2. הלם-להקפיא את החייאת השומנים בחנקן הנוזלי. מעבירים את הבקבוקון לכוס עם מים חמים עד שהתמיסה מופשרת לחלוטין. חזרו על מחזור ההפשרה המקפיא הזה 8-10 פעמים או עד שהתערובת העכורה הקודמת נראית ברורה.
      אזהרה: השתמש בבגדי בטיחות וציוד מתאימים כגון משקפי מגן, כפפות ופינצטה כדי למנוע כל מגע ישיר עם החנקן הנוזלי, עם בקבוקון השומנים הקפואים או עם המים הרותחים.
   3. עבור יצירת התפלגות שלפוחית מונודיספרזה, הרכיבו מכבש שומנים ובדקו את שלמותו עם מאגר תגובה כדי לוודא שהוא אינו דולף.
      הערה: אם נצפתה דליפה, הרכיבו מחדש בזהירות את מכבש השומנים עד שלא ניכרת שפיכת חיץ.
   4. הבלטת תרחיף השומנים במשך 37 עוברת דרך קרום נוקלאופור בגודל נקבובית של 50 ננומטר²⁶. מספר המעברים צריך להיות לא אחיד כדי להבטיח שתערובת ה-SUV הסופית חצתה את קרום הגרעין ולכן היא נקייה מאגרגטים של שומנים או בועיות מולטי-למלריות. הבועיות המובלטות ישמשו מאוחר יותר ליצירת דו-שכבתי שומנים נתמכים (ראו שלבים 6 ו-7).
      הערה: גם רכבי שטח יכולים להיווצר על ידי סאונדציה של תערובת השומנים המיובשים. עם זאת, הכנה באמצעות שחול מספקת התפלגות חד-ממדית יותר של רכבי שטח, מה שמקל על קרע בשלפוחית במהלך היווצרות דו-שכבתית נתמכת של שומנים. שלפוחית extruded ניתן לאחסן במקרר למשך 3 ימים לכל היותר.

2. ניקוי מגלשות מיקרוסקופ

1. תחלקו מספר שווה של שקופיות מיקרוסקופ (מס' #1.5; עובי 0.17 מ"מ) עם ממדים של 24 מ"מ x 60 מ"מ ו-24 מ"מ x 24 מ"מ במחזיקי מיקרוסקופים של פוליטטראפלואורתילן (PTFE).
2. העבירו את מחזיקי ה-PTFE לכוסות המכילות מים אולטרה-אפורים והעבירו אותם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בהתאם לכוס, יש להתאים את נפח המים כך שיכסה לחלוטין את מחזיק ה- PTFE.
3. השתמש בפינצטה כדי להסיר את המחזיקים מהכוס ולהחליף את המים באיזופרופנול אולטרה-פורה. הכנס את המחזיק לתוך הכוס המכיל איזופרופנול וסוניק שוב במשך 15 דקות.
   הערה: בהתאם לכוס, יש להתאים את נפח האיזופרופנול כך שיכסה לחלוטין את מחזיק ה- PTFE.
4. החלף את האיזופרופנול במים אולטרה-פורים וסוניק את הכוס המכילה את המחזיקים במשך 15 דקות.
5. הסר את מחזיקי ה- PTFE מהכוסות וייבש את החלקות המיקרוסקופיות במחזיק תחת זרם קבוע של גז חנקן או אוויר דחוס.
   הערה: הקפידו על ניקוי נכון של מגלשות הכיסוי על ידי שימוש בכפפות, כוסות נקיות וסרט פרפין כדי לכסות כל. אחרת, שאריות אבק עלולות לגרום לתנודות רקע משמעותיות במהלך מדידות MSPT.

3. הידרופיליזציה של שקופיות מיקרוסקופ

הערה: כדי לקבל דו-שכבת שומנים הומוגנית ונתמכת בנוזל, הידרופיליזציה של שקופיות היא חיונית ויש לבצע אותה ממש לפני הרכבת תא הזרימה.

1. מקם מחזיקי PTFE המכילים רק 24 מ"מ x 60 מ"מ מיקרוסקופ שקופיות בחומר ניקוי פלזמה עם חמצן כגז תהליך ונקה את שקופיות המיקרוסקופ עם פלזמה (פרמטרים המשמשים בעבודה זו: 30% הספק, לחץ חמצן של 0.3 mbar עבור 30 s; ראה טבלת חומרים לפרטים של מנקה הפלזמה בשימוש).
   הערה: כדי להשיג ממברנות נוזל, יש להתאים פרמטרים לניקוי פלזמה כגון כוח, לחץ חמצן וזמן ניקוי עבור כל מכשיר. לשם כך, מומלץ להשתמש בשומנים בעלי תווית פלואורסצנטית כדי להבטיח נזילות ממברנה, אותה ניתן לכמת עם התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויי פוטו-הלבנה (FRAP)²⁷. אם הפרמטרים אינם מותאמים להגדרה המתאימה, דיפוזיה של ממברנה עלולה להיפגע עקב ירידה בנזילות הממברנה.

4. הרכבה של תאי זרימה

1. לפני הרכבת תא הזרימה, שמרו על הרכיבים הבאים מוכנים: שקופיות מיקרוסקופ מנוקות (24 מ"מ x 24 מ"מ), שקופיות מיקרוסקופ הידרופיליות (24 מ"מ x 60 מ"מ), רדיד אלומיניום, קרטון שטוח, אזמל וסרט הדבקה דו-צדדי.
2. עוטפים את הקרטון השטוח בנייר אלומיניום.
3. פרשו את מגלשות המיקרוסקופ של 24 מ"מ על 24 מ"מ על רדיד האלומיניום עם מרחק מספיק זו מזו.
4. חברו רצועות סרט דו-צדדיות לקצוות העליונים והתחתונים של השקופיות.
5. לבלות כל שקופית מיקרוסקופ עם האזמל, כך שניתן להסיר אותו מרדיד האלומיניום. כתוצאה מכך, כל שקופית צריכה לכלול פסים של סרט הדבקה דו-צדדי המחוברים לקצוות העליונים והתחתונים של השקופית (ראו איור 1).
6. חבר את המגלשה בגודל 24 מ"מ x 24 מ"מ עם שתי רצועות הטייפ הדו-צדדיות לשקופית ההידרופילית בגודל 24 מ"מ x 60 מ"מ כדי ליצור נתיב זרימה בין שקופיות המיקרוסקופ הקטנות והגדולות יותר.
   הערה: כדי להבטיח תאי זרימה נקיים, ללבוש כפפות כל הזמן ולוודא ששולחן העבודה נקי מאבק.

5. סינון מאגרי תגובה

1. מסנן סטרילי את כל מאגרי התגובה דרך ממברנות אצטט תאית 0.45 μm כדי להבטיח אות רקע מינימלי במהלך מדידות MSPT.
   הערה: אם נוכחותם של נוקלאוטידים, כגון ATP, חיונית לניסוי מוצלח, היו מודעים לעלייה פוטנציאלית באות הרקע. מומלץ להשתמש רק בכמויות מינימליות שעדיין מבטיחות פעילות חלבונית.

6. היווצרות דו-שכבתית נתמכת של שומנים (SLB)

הערה: מומלץ לבצע את היווצרותם של דו-שכבתי שומנים נתמכים על פוטומטר המסה כדי להבטיח באופן חזותי התפשטות מוצלחת של שלפוחית והסרה מלאה של שלפוחית לא מאוכלסת.

1. דיללו רכבי שטח טריים שהובלטו (ראו שלב 1 לפרטים נוספים) לריכוז סופי של 0.4 מ"ג/מ"ל במאגר התגובה הנדרש. לחלופין, כדי לקדם קרע בשלפוחית, הוסיפו 2 mM CaCl₂ למתלי השלפוחית.
   הערה: קטיונים של דיוולנט עלולים לגרום לצבירה של שומנים מסוימים כגון PiP₂. עבור תערובות המכילות שומנים כאלה, יש להימנע משימוש ב- CaCl₂ לקידום קרע שלפוחית או קטיונים דיאלוונטיים אחרים במאגר ההחייאה. במידת הצורך לניסוי, ניתן להוסיף קטיונים דיואלנטיים לאחר היווצרות מוצלחת של דו-שכבת השומנים הנתמכת.
2. יש לשטוף 50 μL של תרחיף השלפוחית לתוך תא הזרימה (שלב 4) ולדגום את התא למשך 2 דקות.
   הערה: ניתן לשטוף מאגרים, שלפוחיות או תמיסות חלבון דרך תא הזרימה באמצעות חתיכה קטנה של רקמת השרייה. עם זאת, ניתן גם להשתמש במערכת משאבה מכנית.
3. הסר שלפוחיות לא משולבות באמצעות שטיפה חוזרת (לפחות שלוש פעמים) של תא הזרימה עם 200 μL של מאגר התגובה בכל פעם.
   הערה: יש לשטוף היטב את הבועיות מתא הזרימה כדי להבטיח אות רקע יציב במהלך מדידות MSPT.

7. יצירת עקומת כיול

הערה: כדי להמיר את הניגודיות של חלקיקים שזוהו למסה מולקולרית, יש לכייל את האות שלהם באמצעות חלבונים בגדלים ידועים. מומלץ להתאים את משטר גודל החלבון הסטנדרטי כך שיכסה את טווח המסות המולקולריות הצפויות למערכת המעניינת.

1. ביוטינילציה של חלבונים סטנדרטיים עם שאריות ציסטאין
   1. חשב את הכמות המתאימה של מאלימיד-ביוטין עבור החלבון הסטנדרטי על פי הוראות היצרן.
   2. דגירו את החלבון הסטנדרטי עם הנפח שנקבע של מאלימיד-ביוטין למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   3. כדי להסיר מאלימיד-ביוטין לא מצומד מקומפלקס הביוטין-חלבון המצומד, בצעו כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל על עמודה המתאימה לחלבון המעניין.
   4. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד.
      הערה: כדי לאחסן את החלבון הסטנדרטי למדידות נוספות, הקפיאו את החלבון באליקוטים חד-פעמיים בחנקן נוזלי ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. מדידת חלבונים סטנדרטיים לעקומת הכיול
   1. בתא זרימה, הכינו דו-שכבת שומנים נתמכת עם רכבי שטח מוציאים במינון 0.4 מ"ג/מ"ל (ראו שלבים 1 ו-6 לפרטים נוספים) המכילים 0.01% מול (v/v) ביוטיניל קאפ PE (1,2-דיאולוויל-sn-גליצרו-3-פוספוטנולמין-N-קאפ ביוטיניל).
   2. מוסיפים 50 μL של 2.5 ננומטר streptavidin divalent streptavidin לדו-שכבתי בתא הזרימה ודגירה במשך 10 דקות.
      הערה: סטרפטווידין דיוולנטי הובטא וטוהר כמתואר ב- Howarth et ^al.28. כמו כן ניתן להשתמש בסטרפטווידין טטרוולנטי. עם זאת, השימוש בסטרפטווידין דיוולנטי יכול להפחית את התגובה האפשרית של סטויכיומטריות בין ליפידים ביוטינילציה לבין חלבונים סטנדרטיים המצומדים למואטי ביוטין על מנת להקל על הקצאת מינים.
   3. הסר סטרפטווידין דיפלנט לא מאוגד עם 100 μL של מאגר תגובה.
   4. הוסיפו 50 μL של חלבון סטנדרטי מצומד ביוטין של 100 ננומטר לדו-שכבתי בתא הזרימה ודגרו למשך 2 דקות.
      הערה: בהתאם ליעילות הביוטינילציה והאם נעשה שימוש בסטראפטווידין די-או טטרוואלנט, הריכוזים האופטימליים של חלבון סטנדרטי מצומד ביוטין וסטרפטווידין עשויים להשתנות.
   5. בצע מדידת MSPT בהתאם לפרטים המתוארים בשלב 8.
      אזהרה: תנאי ההדמיה צריכים להיות זהים הן לתקני הדגימה והן לתקני הכיול.

8. הדמיה

1. היווצרות SLB והכנת מדגם
   1. כפי שתואר ביתר פירוט בשלב 6, הציגו רכבי שטח של תערובת השומנים הרצויה (25 μL) לתא זרימת הדגימה ויצרו דו-שכבת שומנים נתמכת. יש לשטוף היטב את התא (שלוש פעמים) עם 100 μL של מאגר תגובה כדי להסיר את כל הבועיות הלא מאוכלסות.
   2. הוסף 50 μL של החלבון המעניין לתא הדגימה.
      הערה: מכיוון ש-MSPT היא שיטה של חלקיק יחיד, ריכוז החלבון חייב להישמר בטווח pM עד nM כדי לאפשר זיהוי ומעקב אחר חלקיקים ללא הפרעה.
2. רכישת וידאו
   1. הגדר את תנאי ההדמיה הרצויים כגון גודל שדה הראייה (FOV), קצב הפריימים, זמן החשיפה וזמן הרכישה בתוכנת הרכישה.
      הערה: ההגדרות הבאות הוכחו כעובדות עבור MSPT על פוטומטר מסה מסחרי (ראה טבלת חומרים): FOV של 128 פיקסלים x 35 פיקסלים, קצב פריימים של 1 קילוהרץ וכתוצאה מכך בערך 200 פריימים לשנייה לאחר ממוצע מסגרת של פי 5 לאחר מכן, וזמן חשיפה של 0.95 אלפיות השנייה.
   2. התאם את המיקוד באופן אוטומטי או ידני. במידת הצורך, העבר את ה- FOV למצב עם ממברנה הומוגנית באמצעות הבקרה הצידית.
   3. צור תיקיית פרוייקט והתחל להקליט את הסרט. עם השלמת ההקלטה, ציין שם קובץ בתיבת הדו-שיח המתבקשת על-ידי תוכנת הרכישה. לאחר מכן הסרט נשמר באופן אוטומטי בתיקיית הפרוייקט כקובץ MP לניתוח מאוחר יותר.
      הערה: הקלט לפחות שלושה שכפולים בתאי זרימה שונים כדי להבטיח את שלמות הממברנות הבודדות ואת יכולת השכפול של התוצאות. ניתן להגדיר מראש את משך הסרט ותלוי בסוג הניסוי. ברוב המקרים, מומלץ זמן רכישה בין 5 דקות ל -7 דקות.
      אזהרה: כברירת מחדל, הקלטות סרטים בתוכנת רכישת הפוטומטר ההמוני המסחרי נדחסות לפני שהן נשמרות כדי לצמצם את שטח האחסון. עם זאת, יש לכבות את דחיסת הקבצים כדי לאפשר ניתוח נתונים מותאם אישית כמתואר בפרוטוקול זה. פרטים על אופן כיבוי דחיסת הקבצים ניתן למצוא במדריך למשתמש של היצרן.

9. ניתוח נתונים

הערה: צינור ניתוח הנתונים מלווה בשתי מחברות Jupyter אינטראקטיביות (MSPT analysis.ipynb, הדמיית סרטים.ipynb). מחברות Jupyter ומודולי Python הקשורים לכתיבה מותאמת אישית הדרושים לביצוע ניתוח MSPT המתואר להלן זמינים במאגר ציבורי: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. לקבלת הוראות מפורטות על הניתוח שלהלן, הקוראים מופנים לניתוח MSPT.ipynb גישה באמצעות הקישור לעיל.

1. עיבוד וידאו
   1. הסר פיזור סטטי דומיננטי של אור באמצעות אלגוריתם הערכת הרקע מבחינת פיקסלים באמצעות הפונקציה image_processing.mp_reader .
      1. כדי להחיל את הסרת הרקע, בחר באפשרות continuous_median עבור מצב הפרמטר והגדר אורך מתאים לחלון החציון הזזה (window_length) בקטע מחברת B.1. לחלופין, שמור את הסרטים לאחר הסרת הרקע שישמשו לזיהוי חלקיקים וקישור מסלול (על-ידי הגדרת הפרמטר save_processed_movies ל-True).
         הערה: התאם את גודל החלון (window_length) לערכים שבין 101 ל- 2001 בהתאם לצפיפות החלקיקים על הממברנה, מקדם הדיפוזיה הצפוי, קצב פריימים של רכישה ומהירות העיבוד הנדרשת.
         אזהרה: אסטרטגיית הסרת הרקע פועלת היטב אם הממברנה אינה צפופה מדי ואם הדיפוזיה של החלקיקים מהירה מספיק (כלומר, כל פיקסל הוא רוב הזמן לא עסוק בחלקיק). אחרת, הניגודיות של החלקיקים תזלזל באופן שיטתי מכיוון שלא ניתן להבחין ביניהם כראוי לבין אות הרקע. ניתן לפצות על כך על ידי הגדלת גודל החלון החציוני בעלות המהירות החישובית. עם זאת, שים לב שהגדרת גודל החלון גדול מדי עלולה להשפיע לרעה על הפלט עקב סחף הדגימה. בדיקה חזותית של הסרטונים המעובדים היא חיונית.
   2. זהה את החלקיקים ואת מיקומם המתאים לאורך הסרט באמצעות הפונקציה particle_fitting.particle_fitr (ראה סעיף מחברת B.2).
      1. כוונן את הרגישות של זיהוי חלקיקים עם פרמטר הסף (דיש; ראה מקטע מחברת B.1), המשמש להדגשת כתמים מועמדים על ידי בינאריזציה של תמונה. ניתן לבחון את ההשפעה של פרמטרי סף משתנים על רגישות לזיהוי ספוט במחברת נפרדת (הדמיית סרטים.ipynb). התוצאות של זיהוי חלקיקים נשמרות באופן אוטומטי בקבצי CSV בספריית משנה של קובץ הסרט.
         הערה: הגדרת פרמטר הסף נמוך באופן שרירותי (לדוגמה, עבור סרטים שצולמו עם פוטומטר המסה המשומש, פרמטר סף מתחת ל- 0.0005) אינה מומלצת מכיוון שנקודות מועמדות יישלטו על ידי רעש מופרך ולכן יאריכו את זמן העיבוד.
2. קשרו חלקיקים בפריימים עוקבים למסלולים באמצעות חבילת Python trackpy (v.0.5.0)²⁹.
   הערה: קישור המסלול מתבצע תוך כדי תנועה לאחר זיהוי נקודתי. כתוצאה מכך, קובץ CSV נוסף המכיל את פרטי המסלול מאוחסן בתת-ספרייה של קובץ ה- CSV לזיהוי חלקיקים.
   1. הסר מסלולים עם מעט מדי נקודות באמצעות הפרמטר minimum_trajectory_length (ראה סעיף מחברת B.1) כדי לאפשר קביעה חזקה של מקדמי דיפוזיה. לקבלת הסברים מפורטים לגבי הפרמטרים האחרים של פונקציות trackpy , עיין בתיעוד של trackpy .
3. ניתוח מסלולים
   1. במחברת מקטע C.1, ציין את קצב הפריימים (frame_rate) ואת גודל הפיקסלים ב- nm (pixel_size), ששימשו לרכישת סרטים. צור רשימה של קבצי CSV המכילים את פרטי המסלול המוחזרים על-ידי trackpy (ראה שלב 9.2) עם הפונקציה trajectory_analysis.get_csv_files (מקטע מחברת C.2).
   2. בנוסף, ציין שם קובץ פלט עבור הגורם המכיל HDF5, המשמש לאחסון תוצאות ההתאמה בדיסק (מקטע מחברת C.3). נתח את כל המסלולים באמצעות פונקציית trajectory_analysis.fit_trackjectories במקטע מחברת C.4, החוזר דרך רשימת קבצי ה- CSV. פונקציה זו משתמשת בהתפלגות מרחק הקפיצה (JDD)³⁰ ובאנליזה ממוצעת של תזוזה בריבוע (MSD)³¹ כדי להעריך את מקדם הדיפוזיה של כל מסלול.
   3. המרת הניגודיות החציונית של כל מסלול למסה המתאימה לו על-ידי שימוש ביחסי הניגודיות-מסה המתקבלים מכיול MSPT (ראו סעיף 7). ציין את השיפוע (שיפוע) ואת y-יירוט (היסט) של קו הכיול, המתייחס לניגודיות iSCAT למסה מולקולרית (פונקציה trajectory_analysis.apply_calibration; ראה סעיף מחברת C.5). פונקציה זו מוסיפה עמודה עם המסה החציונית של המסלול לכל מסגרת נתונים.
   4. הערך את צפיפות החלקיקים הנראית לעין על הממברנה עם הפונקציה trajectory_analysis.membrane_density, המחזירה את ערך הצפיפות החציוני במונחים של חלקיקים שזוהו ומציגה מסלולים במהלך כל פריים (ראה סעיף מחברת C.6) כעמודות נוספות במסגרת הנתונים.
      הערה: מכיוון שחלק מהחלקיקים יאבדו הן במהלך תהליך הגילוי והן בתהליך קישור המסלול, צפיפות החלקיקים בפועל עשויה להיות גבוהה יותר. לקבלת תוצאות מהימנות לגבי צפיפויות חלקיקים, כמו גם היסטוגרמות של מסה, בדקו באופן חזותי תצלומי סרטים מייצגים כדי לוודא שתנאי המדידה מתקבלים על הדעת למעקב אחר חלקיקים בודדים (ראו שלב 9.1.1).

10. תצוגה חזותית של נתונים

1. המחש את המתאם של מקדם מסה ודיפוזיה עם אומדן צפיפות גרעין דו-ממדי (KDE), המבוסס על חבילת פייתון fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
2. כדי ליצור את העלילה, ציין את קובץ HDF5 המכיל את תוצאות MSPT (ראה שלב 9.3.2 ומקטע המחברת D.1) ובחר יחיד (מקטע מחברת D.2) או מסגרת נתונים משורשרת (מקטע מחברת D.3) כנתוני קלט עבור פונקציית plotting.generate_2D_KDE (מקטע מחברת D.4).
   הערה: כל מערך נתונים משורטט צריך להכיל באופן אידיאלי יותר מ- 1,000 מסלולים עבור 2D-KDE אמין.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול המפורט כאן להכנת דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs) בתאי זרימה (איור 1), ניתן לזהות בבירור תבנית דמוית כתם בתצוגה המקורית של כל התנאים המוצגים (איור 2). השפעה זו נגרמת על ידי חספוס פני השטח של הזכוכית, אשר בדרך כלל שולט באות הפיזור ומוביל לתנאים שאינם ניתנים להבחנה חזותית (זכוכית, זכוכית עם SLB, או זכוכית עם SLB וחלבונים מחוברים). עם זאת, נוכחותן של שלפוחיות נבדלת בבירור בשל חתך הפיזור הגדול של הבועיות ומאפשרת תצפית על קרע שלפוחית ואיחוי לתוך ממברנות הומוגניות (איור 2B וסרט משלים 1). כאשר מסירים את אות הפיזור הסטטי של משטח הזכוכית בגישה יחסית המדגישה את האלמנטים הדינמיים בשדה הראייה^24,25, ניתן לחשוף חלבונים ללא תווית המתפזרים על הממברנה (איור 2D) בעוד ש-SLB ריק (איור 2C) או הזכוכית עצמה (איור 2A) מופיעים כתמונה רועשת.

ניתן להעריך באופן מקומי את הרקע האינהרנטי של מדידות MSPT על-ידי חלוקת כל ערך פיקסלים בחציון של n הפיקסלים הקודמים והפיקסלים הבאים של הסרט באותו מיקום תמונה (איור 3). כתוצאה מכך, מקרומולקולות מופיעות כפונקציות איזוטרופיות של התפשטות נקודתית (PSFs) שאת תנועתן על הממברנה ניתן לראות, לעקוב ולכמת. למעשה, הזמינות של ניגודיות והתנהגות דינמית מאפשרת את הקשר הישיר בין הגודל המולקולרי של החלקיק להתנהגותו המפוזרת בהתאמה, כל זאת ללא צורך בתיוג החלקיק. עם זאת, כדי לפרש את הניגודיות iSCAT שנקבעה במהלך ניסויי MSPT, חיוני לבצע כיול המתרגם את משרעת האותות למסה מולקולרית. ניתן להשיג זאת על-ידי הצמדת ביו-מולקולות בעלות מסה ידועה ל-SLB באמצעות קומפלקס ביוטין-סטרפטווידין-ביוטין-ביוטין (איור 4A). כאסטרטגיה למופת, ניתן להשתמש בגרסאות ביוטינילציה של אלבומין בסרום בקר (BSA), חלבון A (prA), פוספטאז אלקליין (AP) ופיברונקטין (FN), הנקשרים לסטרפטווידין (STP) שבעצמו קשור לשומנים המכילים ביוטין (Biotinyl Cap PE) בממברנה. כפי שהוצג באיור 4A, הניגודיות ההולכת ומובהקת של המקרומולקולות המופתיות האלה משקפת את המשקל המולקולרי הגובר של התקנים הביוטינילטיביים המתאימים. על ידי הקצאת כל שיא של היסטוגרמות הניגודיות (איור 4B) למסה המקבילה של מצב האוליגומר של החלבון הסטנדרטי, מתגלה קשר ליניארי בין ניגודיות למסה^21,22 ולאחר מכן ניתן להשתמש בו לניתוח של מערכות מקרומולקולות לא ידועות (איור 4C).

דוגמה טובה המדגימה את הישימות והיכולות של MSPT לנתח משקלים מולקולריים ומכאן לחקור מצבי אוליגומרים ואירועי אוליגומריזציה היא השיקול של אלדולאז ביוטינילציה ו-IgG ביוטינילציה (איור 5). בדרך כלל מדווחים כי אלדולאז הוא הומוטרמר³². עם זאת, התפלגות המסה שנפתרה על ידי MSPT כוללת ארבע פסגות נפרדות, מה שמדגיש את הנוכחות של אוכלוסיות מרובות (איור 5A). בעוד שהשיא המינורי הראשון מתאים לסטרפטווידין לא מאוכלס וניתן לצפות לו בשל התצורה בניסוי מסוג זה, ניתן לזהות גם קומפלקסים של אלדולאז עם שתי תת-יחידות בלבד (2SU) או שש תת-יחידות (6SU) (איור 5B). באופן מעניין, קומפלקסים של אלדולאז-סטרפטווידין טטרה והקסמרית מציגים מקדם דיפוזיה מופחת בהשוואה לאלדולאז דימרי וסטרפטווידין בלבד, מה שמעיד על גרירה צמיגית מוגברת , למשל באמצעות חיבור של ליפיד ביוטינילציה שני לסטרפטווידין. באופן דומה, IgG שעבר ביוטינילציה מציג שלוש פסגות בהתפלגות המסה, כאשר הפסגה הראשונה שוב תואמת את המסה של סטרפטווידין יחיד. המסה של הפסגה הנפוצה ביותר תואמת את המסה של שרשרת קלה אחת ושרשרת כבדה אחת (1SU), כלומר מחצית מנוגדן IgG. הנוגדן המלא עם שני חצאים זהים (2SU) מזוהה בכ-11% מהמקרים. הירידה של מקדם הדיפוזיה עם גדלים מורכבים הולכים וגדלים מצביעה על אינטראקציות של הסטרפטווידין עם יותר מליפיד אחד שעבר ביוטינילציה או גרר נוסף שנגרם על ידי ה- IgG המצורף, או שניהם.

מלבד הניתוח הבלעדי של מצבי אוליגומר תלויי ממברנה, MSPT גם מקנה את היתרון המסוים של קורלציה בין ההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולה בעלת עניין לבין מצב האוליגומר שלה. תוצאות מייצגות עבור סוג זה של ניתוח מוצגות עבור נספחין V (AnV) ורעלן כולרה תת-יחידה B (CTxB), אשר נקשרים לדיאוילפוספטידיל-סרין (DOPS) או לגליקוזפינגוליפידים (GM1), בהתאמה, המשולבים בממברנה (איור 6A). שתי הערכות צפיפות הגרעינים (KDEs) כוללות התפלגויות חד-ממדיות של מסה ודיפוזיה, מה שמעיד על מין שופע יחיד עם התנהגות מפוזרת דומה. מיקום השיא של מסה מולקולרית ומקדם דיפוזיה נמצא כ-49.8 ± 2.2 kDa ו-1.4 ± 0.1 μm²/s, בהתאמה, עבור AnV וכן 62.7 ± 3.1 kDa ו-0.4 ± 0.1 μm²/s, בהתאמה, עבור CTxB. מקדמי הדיפוזיה הנמדדים דומים לערכים שדווחו בעבר שהתקבלו מ-AFM במהירות גבוהה ומ-FRAP^33,34. המסה המופחתת מעט בהשוואה למסה של המקרומולקולה הצפויה (52 kDa עבור טרימר AnV, 65 kDa עבור פנטמר CTxB) עשויה להצביע על נוכחותם של קומפלקסים קטנים יותר עם פחות תת-יחידות בהרכב. בעוד שהפרש המסה בין החלבונים קטן וקרוב לגבול הגילוי שצוין של המיקרוסקופ (≈50 kDa), מקדמי הדיפוזיה שלהם שונים במידה ניכרת. בתערובת שווה-צלעות, למשל, על-ידי השוואת הדיפוזיה של התערובת להתפלגות של AnV ו-CTxB בלבד, ניתן להסיק ש-AnV נפוץ יותר על הממברנה מאשר CTxB (איור 6B). עם זאת, אם הריכוז של CTxB מוכפל בהשוואה לריכוז של AnV, שיווי המשקל מוסט לכיוון CTxB כחלבון השולט על הממברנה. כפי שהודגם עבור תערובות של AnV ו- CTxB, MSPT לא רק מאפשר להבחין בין מקרומולקולות הקשורות לממברנה על פי משקלן המולקולרי, אלא גם מאפשר אפליה של אוכלוסיות מקרומולקולות שונות בהתאם להתנהגותן המפוזרת.

כמו בכל טכניקות המיקרוסקופיה, חלק מהדרישות הניסוייות הן קריטיות על מנת להשיג את איכות הנתונים הרצויה. דוגמה חשובה בהקשר זה היא כיסויים מנוקים ביסודיות. באופן כללי, זה נחשב כתנאי מוקדם לניסויים במולקולות בודדות הקשורות למיקרוסקופיה, אך MSPT רגיש במיוחד לזיהומים בדגימות. הפיזור המוגבר שמקורו במשטח הזכוכית של כיסויים לא נקיים מונע מדידה כמותית של iSCAT. יש לציין שאפילו שאריות לכלוך או חלקיקי אבק על זכוכית שאינה מנוקה מספיק יכולות לגרום לעיוותים בולטים בתמונה, הניתנים לזיהוי כנקודות בהירות במצב ההדמיה המקורי (איור 7A). למרות שפגמים אלה מוסרים על ידי הערכת הרקע בשל אופיים הסטטי, קביעה מדויקת של הניגודיות של חלקיק עלולה להיפגע ובכך להשפיע לרעה על הניתוח הכמותי שלו. בעיה נפוצה נוספת שנתקלים בה בניסויי MSPT היא הבועיות הנותרות שצפות (מוקפות בכתום) דרך שדה הראייה או בועיות לא מרוסקות שתקועות (מוקפות בכחול) במיקום מסוים על הממברנה ונראות כמפזרים פועמים גדולים (איור 7B). כדי למזער את התרחשותם ואת ההפרעה שלהם לרכישת סרט, מומלץ לשטוף ביסודיות את ה-SLB לפני הוספת החלבון ולהשתמש בתערובות טריות של שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (רכבי שטח) וקטיונים דיוולנטיים.

גורם אחד שיש לקחת בחשבון לתכנון ניסויי מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה הוא צפיפות המקרומולקולות הקשורות לממשק הממברנה. צפיפויות חלקיקים גבוהות על הממברנה יכולות למעשה לגרום לבעיות משתי סיבות: 1) הקישור של גילויי חלקיקים ממסגרות עוקבות למסלולים הופך להיות מעורפל ומכאן מגביר את הסבירות לטעויות ולמקדמי דיפוזיה מוטעים. ii) מסת החלקיקים, המופקת מהמשרעת של התאמת ה-PSF המתאימה להם, הופכת להיות מוערכת באופן שיטתי בחסר ופסגות המסה מתרחבות מכיוון שההפרדה של אות הרקע הסטטי מאות החלקיקים הדינמיים קשה יותר ויותר (איור 7C). נכון לעכשיו, הערכה חזותית של איכות הנתונים בתהליך רכישת סרטוני MSPT קשה במיקרוסקופים המסחריים הזמינים מכיוון שהתצוגה היחסית המיושמת בתוכנת הרכישה משתמשת בהסרת הרקע שנקבעה עבור פוטומטריית מסה²¹ במקום באלגוריתם מבוסס החציון המתואר כאן ובהפניות ^24,25 (איור 7D ). הסרת הרקע הרציפה המבוססת על ממוצעים המשמשת להדמיית מולקולות נחיתה בפוטומטריית מסה גורמת לחלקיקים מתפזרים להופיע כחזיתות כהות עם זנבות בהירים, מה שגורם לכתמים להיראות אניזוטרופיים מאוד ומפריע להתאמת PSF במהלך הליך הגילוי. לפיכך, השימוש בעיבוד תמונה מבוסס ממוצע מיושם בתוכנת הרכישה אינו מתאים לניתוח של ביומולקולות מתפזרות על ממברנות.

איור 1: דיאגרמת זרימת תהליכים של השלבים הבודדים הנדרשים לניתוח אינטראקציות בין חלבונים לממברנה עם מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה (MSPT). כדי להכין דגימות למדידות MSPT, יש לנקות ביסודיות את מגלשות כיסוי הזכוכית ולהפעילן באמצעות פלזמת חמצן. לאחר הרכבתם לתאי זרימה לדוגמה, בועיות חד-שכבתיות קטנות (רכבי שטח) מוכנות להיווצרות דו-שכבתית נתמכת של שומנים (SLB) וכל מאגרי התגובה מסוננים כדי להפחית את פיזור הרקע. רכבי שטח מתווספים ליצירת דו-תאי ליפידים בתאי הזרימה. לחלופין, ניתן להוסיף לרכבי השטח קטיונים מסוג Divalent כגון יונים מסוג Ca²⁺ כדי לקדם קרע בשלפוחית. לבסוף, ריכוזים נמוכים של חלבון העניין נשטפים לתוך תא התגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תצוגה מקורית ויחסית של משטחים למופת הרלוונטיים למדידות MSPT. תמונות מייצגות של חספוס פני השטח של שקופית כיסוי זכוכית (A), במהלך היווצרות של דו-שכבת שומנים נתמכת (B), עם דו-שכבת שומנים נתמכת שלמה (C) ושל חלבונים מופתיים המשוחזרים על SLB (D). כל ארבע הדוגמאות מוצגות במצב המקורי, שניתן לגשת אליו במהלך המדידה עצמה, וכתמונות יחסמטריות מעובדות לאחר הסרת רקע מבוססת חציון. סרגלי קנה מידה מייצגים 1 מיקרומטר. לצורך ניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter נלווית; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: דיאגרמה שלב אחר שלב של השלבים הנדרשים לאיסוף וניתוח נתוני MSPT. לאחר רכישת נתונים עבור מדגם העניין על פוטומטר המסה, הסרטים מעובדים כדי להסיר את הרקע הסטטי באמצעות גישת חציון הזזה חכמה פיקסלים. לאחר מכן, חלקיקים מועמדים מזוהים ומותאמים על ידי פונקציית התפשטות נקודתית (PSF) לפני שהם מתחברים למסלולי חלקיקים. כדי לאפשר את קביעת מקדם הדיפוזיה עבור כל חלקיק, נעשה שימוש בניתוח תזוזה ממוצעת בריבוע (MSD) או התפלגות מרחק קפיצה (JDD). בשלב זה, ניתן להפוך ערכי ניגודיות למסות מולקולריות על פי יחס הניגודיות-מסה הנקבע באמצעות אסטרטגיית הכיול. כצעד אחרון, ניתן לסנן מסלולים על סמך אורכם או צפיפות חלקיקי הממברנה שלהם ולהמחיש אותם על ידי הערכת צפיפות גרעינים דו-ממדית (2D-KDE). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: כיול של יחס מסה לניגודיות עבור מדידות MSPT. (A) מסגרות יחס מייצגות המתקבלות עבור קומפלקסים חלבוניים סטנדרטיים של סטרפטווידין מופתי המתפזרים על דו-שכבת שומנים נתמכת המכילה אחוז קטן של שומנים ביולוגיים (DOPC:DOPG:יחס Biotinyl Cap PE של 70:29.99:0.01 מול%). כפי שמוצגים תקני משקל מולקולריים לדוגמה, מוצג סטרפטווידין^{מונו-ואלנטי 28} (STP בלבד) או סטרפטווידין דיוולנטי²⁸ בקומפלקס עם אלבומין סרום בקר ביוטינילציה (BSA), חלבון ביולוגי A (prA), פוספטאז אלקליין ביוטינילטי (AP) או פיברונקטין ביוטינילציה (FN). כתמים מועמדים מודגשים בכתום (עיגולים מקווקוויים) וזיהויים מוצלחים של חלקיקים מודגשים באדום (עיגולים מוצקים). סרגלי קנה המידה מייצגים 1 μm. (B) התפלגויות צפיפות הסתברות של ערכי ניגודיות שהתקבלו עבור חמשת החלבונים הסטנדרטיים של המודל. כל הנתונים המוצגים מייצגים התפלגויות מאגר של שלושה ניסויים בלתי תלויים לכל תנאי: STP רק n = 82,719; BSA n = 9,034; prA n = 22,204; AP n = 69,065, ו- FN n = 71,759 מסלולים. בהשוואה למספרי החלקיקים שנקבעו עבור ממברנות עם חלבונים, מספר החלקיקים שזוהו על דו-שכבת ריק הוא זניח בצפיפות ממברנה מתונה (איור משלים 1). פסגות ניגודיות הנחשבות לכיול מסה מסומנות באמצעות קווים רציפים בעוד שפסגות מקווקו מייצגות מצבי אוליגומר שאינם נחשבים. (C) עקומת כיול ניגודיות למסה הנגזרת מניגודי שיא בלוח D ומסות הרצף המתאימות של הקומפלקסים. פסי שגיאה מציגים את שגיאת התקן של מיקומי השיא הנאמדים על-ידי bootstrapping (100 דגימות מחדש עם 1,000 מסלולים כל אחד). עבור ניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1,001 מסגרות, סף זיהוי (דיש) = 0.00055, טווח חיפוש (dmax) = 4 פיקסלים, זיכרון (max_frames_to_vanish) = 0 מסגרות, אורך מסלול מינימלי (minimum_trajectory_length) = 7 מסגרות (STP בלבד), 9 מסגרות (BSA/FN), 15 מסגרות (prA), 10 מסגרות (AP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: פענוח מצבי אוליגומר של חלבונים הקשורים לממברנה. (A) אומדני צפיפות גרעינים דו-ממדיים הן של מסה והן של מקדם דיפוזיה של סטרפטווידין טטרוולנטי בקומפלקס עם אלדולאז ביוטינילציה (פאנל שמאלי) או עם נוגדן IgG נגד ארנב עזים שעבר שינוי ביוטין (פאנל ימני). שחזור של שני הקומפלקסים בוצע על דו-שכבת שומנים נתמכת המכילה DOPC, DOPG וביוטיניל קאפ PE ביחס של 70:29.99:0.01 מול%, בהתאמה. בסך הכל, 116,787 מסלולים של שלושה שכפולים בלתי תלויים נכללו עבור קומפלקס סטרפטווידין-אלדולאז (צפיפות חלקיקים של 0.1 ^μm-2) ו-348,405 עבור מרוכב streptavidin-IgG (צפיפות חלקיקים של 0.1 ^μm-2). רק חלקיקים עם אורך מסלול של לפחות חמש מסגרות נכללו. מוצגות התפלגויות הסתברות שוליות הן של מסה מולקולרית (למעלה) והן של מקדם דיפוזיה (מימין). ה-x השחור בשני הלוחות מסמן את המקסימום המקומי של ה-KDE בהתאמה. (B) השוואה של מסות אוליגומרים נחושות עבור הקומפלקס של סטרפטווידין טטרוולנטי עם אלדולאז שעבר שינוי ביוטין (פאנל שמאלי) או IgG (פאנל ימני) שעבר ביוטינילציה עם משקלים מולקולריים צפויים, על פי מסות הרצף. הקיצור SU מוצג מטעם תת-היחידה של החלבון של האינטרסים. פסי שגיאה מציגים את שגיאת התקן של מיקומי השיא הנאמדים על-ידי bootstrapping (100 דגימות מחדש עם 1,000 מסלולים כל אחד). לצורך ניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter מלווה; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1,001 מסגרות, סף זיהוי (דיש) = 0.00055, טווח חיפוש (dmax) = 4 פיקסלים, זיכרון (max_frames_to_vanish) = 0 מסגרות, אורך מסלול מינימלי (minimum_trajectory_length) = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: המסת ההתנהגות המפוזרת של החלבונים המקומיים המתקשרים עם הממברנה נספחין V (AnV) ורעלן כולרה תת-יחידה B (CTxB). (A) הערכות צפיפות גרעיניות דו-ממדיות של מקדם מסה ודיפוזיה של נספחין V (לוח שמאלי) ותת-יחידה של רעלן כולרה B (לוח ימני). עבור שחזור ממברנת AnV ו- CTxB, נעשה שימוש בהרכבי שומנים של 80:20 mol% DOPC ל- DOPS ו- 99.99:0.01 mol% DOPC ל- GM1, בהתאמה. בסך הכל נכללו 206,819 מסלולים של שלושה שכפולים בלתי תלויים עבור AnV (צפיפות חלקיקים של 0.1 ^μm-2) ו-142,895 מסלולים עבור CTxB (צפיפות חלקיקים של 0.2 ^μm-2). (B) אומדני צפיפות גרעינים דו-ממדיים של תערובות CTxB ו-AnV ביחס של 1:1 (לוח שמאלי) או 2:1 (לוח ימני), בהתאמה. שחזור של תערובות חלבונים בוצע על דו-שכבת שומנים נתמכת המכילה שומנים DOPC, DOPS ו-GM1 ביחס של 80:19.99:0.01 mol%. בסך הכל נכללו 42,696 מסלולים של שלושה שכפולים בלתי תלויים עבור תערובת 1:1 (צפיפות חלקיקים של 0.1 ^μm-2) ו-264,561 מסלולים עבור היחס 2:1 (צפיפות חלקיקים של 0.3 ^μm-2). גם עבור (A) וגם עבור (B), נכללו רק חלקיקים בעלי אורך מסלול של חמש מסגרות לפחות. מוצגות התפלגויות הסתברות שוליות הן של מסה מולקולרית (למעלה) והן של מקדם דיפוזיה (מימין). ה-x הלבן בכל לוח מסמן את המקסימום הגלובלי המתאים של ה-KDE. לצורך ניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter מלווה; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1,001 מסגרות, סף זיהוי (דיש) = 0.00055, טווח חיפוש (dmax) = 4 פיקסלים, זיכרון (max_frames_to_vanish) = 0 מסגרות, אורך מסלול מינימלי (minimum_trajectory_length) = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: סיבוכים פוטנציאליים במהלך מדידות MSPT או במהלך ניתוח נתונים. (A) תמונות מייצגות של חספוס פני השטח המוצגות הן בראייה היחסית המקורית והן בראייה היחסית המעובדת (הסרת רקע חציונית) של שקופית זכוכית מכוסה לא נקייה. בשני המקרים, נקודות בהירות מהוות זיהומים שיוריים על פני השטח המעכבים מדידות נטולות ממצאים. (B) תמונות מופתיות של שאריות בועיות בשדה הראייה לאחר שטיפת ממברנה לא מספקת. גם שלפוחיות סטטיות (מודגשות בכחול) וגם מתפזרות (מודגשות בכתום) יפגעו באיכות המדידה בשל פעימות וניידות או בשל תנועת הכיוון שלהן, בהתאמה. (C) כטכניקה של חלקיק יחיד, MSPT דורש צפיפות חלקיקים נמוכה (תמונה מייצגת, לוח עליון) כדי לאפשר קישור וקביעת מסה תקינים של כל חלקיק. במקרה של צפיפות גבוהה של חלקיקי ממברנה (לוח אמצעי), התאמת החלקיקים נפגעת, מה שמשפיע על קביעת המסה (ראו לוח תחתון). (D) תמונות יחסיות מייצגות של חלקיקים המתפזרים בממשק ממברנה לאחר הסרת רקע מבוססת ממוצע (פאנל עליון) או מבוססת חציון. עבור פיזור חלקיקים, אסטרטגיית הסרת הרקע המבוססת על ממוצעים מייצרת תמונות מעוותות של ה-PSF של החלקיק, כפי שניתן לראות בכניסות הקטנות שבין הלוח העליון לאמצעי. לעומת זאת, ניתן לקבל PSFs של חלקיקים לא ממוינים באמצעות הגישה החציונית המבוססת על חציון. פאנל תחתון: השוואה של פרופילי שורות דרך מרכז ה-PSF המתקבלת לאחר הסרת רקע מבוססת ממוצעת או חציונית. עבור כל התמונות המקוריות והיחסיות המוצגות באיור זה, סרגלי קנה המידה מייצגים 1 מיקרומטר. לצורך ניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter מלווה; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1,001 מסגרות, סף זיהוי (דיש) = 0.00055, טווח חיפוש (dmax) = 4 פיקסלים, זיכרון (max_frames_to_vanish) = 0 מסגרות, אורך מסלול מינימלי (minimum_trajectory_length) = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: השוואה בין ממברנות נטולות חלבון וממברנות תפוסות. תמונות מייצגות של דו-שכבת שומנים נתמכת שלמה לפני (A) ואחרי (B) תוספת של סטרפטווידין מטוהר (STP). נקודות מועמדים שהיו מתאימות בהצלחה לדגם PSF מוקפות באדום. (C) התפלגויות הסתברות ניגודיות של חלקיקים שהתגלו על קרום ריק (רקע ממברנה, אפור) ועל דו-שכבתי עם חלקיקי סטרפטווידין מתפזרים (כחולים). שתי התפלגויות ההסתברות מייצגות את הנתונים המאוגדים של שלושה ניסויים בלתי תלויים עם פרמטרים זהים של רכישה וניתוח של סרטים. לניתוח נתונים (ראה מחברת Jupyter מלווה; שלב 9), נעשה שימוש בפרמטרים הבאים: גודל חלון חציוני (window_length) = 1,001 מסגרות, סף זיהוי (דיש) = 0.00055, טווח חיפוש (dmax) = 4 פיקסלים, זיכרון (max_frames_to_vanish) = 0 מסגרות, אורך מסלול מינימלי (minimum_trajectory_length) = 7 מסגרות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 1: סרט למופת המציג את הקרע והמיזוג של שלפוחיות לתוך קרום הומוגני שנרשם עם פוטומטר המסה. גודל חלון חציון לעיבוד תמונה (window_length) = 1,001 מסגרות. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. טווח ספירות המצלמה: שחור = 16,892; לבן = 65,408. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 2: סרטים למופת המציגים את הדיפוזיה של קומפלקסים של נספחין V (למעלה) ואלדולאז (למטה) על דו-שכבתי כפי שהתקבלו ממדידות MSPT. גודל חלון חציון לעיבוד תמונה (window_length) = 1,001 מסגרות. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. טווח ניגודיות פיזור אינטרפרומטרי: שחור = -0.0075; לבן = 0.0075. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

דיון

הפרוטוקול המוצג מרחיב את פוטומטריית המסה²¹, טכניקה המנתחת את המסה של ביו-מולקולות בודדות הסופחות על זכוכית, לכלי רב-תכליתי עוד יותר המסוגל למדוד בו-זמנית את המסה והדיפוזיה של ביו-מולקולות המתקשרות עם ממברנה ללא תווית. הרחבת ניתוח זו מושגת באמצעות יישום אסטרטגיית הסרת רקע שונה המותאמת לתנועה לרוחב של מולקולות^24,25. באופן כללי, הסרת הרקע היא בעלת חשיבות עליונה עבור גישות מבוססות iSCAT, שכן הפיזור החזק של חספוס פני השטח של הזכוכית מייצג את מכשול הניתוח העיקרי, והקביעה המדויקת של הרקע המקומי של כל פיקסל חיונית לכימות מסת החלקיק ומיקומו. מלבד ניתוח התמונה המותאם לתנועת החלקיקים, זיהוי החלקיקים הבאים, קישור מסלול וניתוח נתונים משלימים את ההרחבה החדשנית של MP למעקב אחר חלקיקים רגישים למסה (MSPT).

באופן כללי, שקופיות כיסוי זכוכית מנוקות ביסודיות וסביבת עבודה נקייה הן דרישות קריטיות לביצועים מוצלחים של ניסויי MSPT. בשל היעדר תיוג מקרומולקולה, האות הנרכש הוא לא סלקטיבי מטבעו. דגימות נקיות, כמו גם טיפול נכון בדגימות, הן אפוא חיוניות כדי להבטיח שלא ניתן יהיה לפרש את התצפיות באופן שגוי. בפרט, כאשר בוחנים מולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך, מדידות בקרה של ממברנות נטולות חלבונים מאושרות כדי להעריך את תרומת הרקע (איור משלים 1). מלבד הכללת מדידות בקרה, מומלץ אפוא לבצע את שלבי ההכנה המוצגים באיור 2 עבור כל תא זרימה. כאשר הם משולבים, אמצעי בטיחות אלה יבטיחו כי האות שזוהה מקורו בביו-מולקולות של עניין ולא, למשל, תא זרימה, חיץ או ממברנה מזוהמים.

מלבד אמצעי הזהירות בנוגע לתכנון הניסוי, יש לנקוט בזהירות גם במהלך עיבוד התמונה של MSPT. במהלך עיבוד וידאו, יש לבחור בקפידה את הערך עבור שלושה פרמטרים כדי להבטיח תוצאות נכונות: i) אורך החלון החציוני להסרת רקע, ii) הסף לזיהוי חלקיקים, ו- iii) רדיוס החיפוש המרבי במהלך משימת הקישור. חלון חציוני גדול יותר (i) מקל בדרך כלל על הפרדת חלקיקים מתפזרים מהרקע המעין קבוע. עם זאת, עבור גדלי חלונות גדולים מדי סחף המדגם יהפוך בסופו של דבר לבולט ויפחית את הדיוק של הערכת הרקע. הגדרות אופטימליות תלויות במידה רבה במאפייני המדגם ובתנאי המדידה. עם זאת, ערך של 1,001 יכול לשמש כנקודת התחלה חזקה. יש לכוונן את פרמטר הסף (ii) בהתאם למסה המולקולרית הנמוכה ביותר הצפויה במדגם. ערך מתחת ל- 0.0005 אינו מומלץ למדידות שצולמו עם פוטומטר המסה ששימש במחקר זה. כדי להאיץ את זמני הניתוח, ניתן לבחור ערכים גבוהים יותר אם צפויה דגימה עם משקל מולקולרי גבוה. רדיוס החיפוש בקישור המסלול (iii) מציין את המרחק הרדיאלי המרבי בפיקסלים שבהם יחפשו את מיקומו המוסט של החלקיק במסגרות עוקבות. יש להתאים אותו לחלקיק המהיר ביותר בדגימה, ואם הוא מועדף, טווח חיפוש אדפטיבי (ראה תיעוד של trackpy) יכול לשמש במקום זאת כדי לקצר את זמן החישוב. במיוחד בשלב הראשוני של הפרויקט, מומלץ לנתח מחדש את הסרטים עם פרמטרים משתנים כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו.

לאור האופי החד-מולקולתי של MSPT, יש להימנע מלהימדד בצפיפות חלקיקי ממברנה גבוהה, שכן אלה עלולים להפריע לניגודיות מדויקת ולקביעת מסה. הוכח כי צפיפויות מתחת לחלקיק אחד לכל מיקרומטר בריבוע הן חיוביות למדידות MSPT²⁴. שיקול נוסף הוא מקדמי הדיפוזיה הצפויים במדגם. למרות שהוא ישים למגוון רחב של מקדמי דיפוזיה, ל-MSPT יש גבול תחתון של מקדמי דיפוזיה נגישים. כליאה מקומית לאזור של פיקסלים בודדים במהלך חלק ניכר מתקופת החלון החציוני ממזגת את החלקיק עם הרקע הסטטי. עבור תנאי ההדמיה המשמשים בפרוטוקול זה, מדידת מקדמי דיפוזיה מתחת ל- 0.01 μm²/s אינה מומלצת. במהירות דיפוזיה זו, לדוגמה, התזוזה הריבועית הממוצעת של חלקיק במהלך חצי הגודל החציוני של החלון היא כ-4 פיקסלים ולכן בגודל דומה להיקף ה-PSF. כתוצאה מכך, הערכת הרקע הסטטית עשויה להכיל תרומות אותות מהחלקיק עצמו, מה שמביא לניגודיות מופחתת לכאורה של החלקיק עד שבסופו של דבר הוא מתקרב לרמת הרעש. עם זאת, מקדמי דיפוזיה מקרו-מולקולריים הנעים בין 0.05 ל-10 מיקרומטר²/s ניתנים לפתרון ברור.

כדי להרחיב עוד יותר את טווח יישומי MSPT, ניתן לדמיין התקדמות של אלגוריתם הרקע המבוסס על חציון באמצעות חיסול פיקסלים המאוכלסים באופן זמני בחלקיק, או על ידי תיקון סחף דגימה המאפשר גדלי חלונות חציוניים גדולים יותר. שתי הגישות יקלו על הבעיות הנוגעות למדידות בצפיפות חלקיקים גבוהה ודיפוזיה איטית. שיפורים במונחים של רגישות מסה נמוכה יותר נמצאים באופק עם דור חדש של פוטומטרים בעלי מסה, שעשויים לספק גישה לביו-מולקולות הקטנות מ-50 kDa. לכן, ניסויי MSPT עתידיים יוכלו לחקור דינמיקה של מולקולה בודדת ואינטראקציות הקשורות לממברנה עבור מגוון רחב עוד יותר של חיקויים של ממברנות כגון דו-תאיים מרופדים ומערכות מקרומולקולריות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נספח V	סיגמא אולדריץ'	#SRP8026	בדיקת חלבון אינטראקציה עם ממברנה
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad Laboratories Inc.	#5000006	ערכת בדיקה של ברדפורד לקביעת ריכוזי מלאי חלבון
ביוטין עם תווית אלבומין בקר	סיגמא אולדריץ'	#A8549	חלבון נבחן שיכול לשמש כחלבון סטנדרטי עבור
תת-יחידה B של רעלן כולרה	סיגמא אולדריץ'	#SAE0069	משקפי כיסוי חלבון אינטראקציה עם הממברנה
, #1.5, 24 x 24 מ"מ	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102062
משקפי כיסוי, #1.5, 24 x 60 מ"מ	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102242
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	#850375	ליפיד - בצורת שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות שחולצו הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית נתמכת
של שומנים ביוטיניל dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap ביוטיניל (18:1 Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	#870273	ליפיד - בצורת שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות שחולצו הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית נתמכת
של שומנים dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)	Avanti Polar Lipids	#840475	ליפיד - בצורת שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות שחולצו הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית נתמכת
של שומנים dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)	Avanti Polar Lipids	#840035	ליפיד - בצורה של שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות שחולצו הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית של שומנים נתמכים
סרט דו צדדי	TESA	#57912-00000-02	הדרוש להרכבת תאי דגימת זכוכית
Extruder	Avanti Polar Lipids	#610023	מכבש ליפידים כדי לאפשר הפצת שלפוחית מונודיסטרית
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#A39261	ביוטין מותך Maileimid שניתן להשתמש בו לביוטינילאט חלבונים סטנדרטיים עבור MSPT
Fibronectin (Biotinylated)	Cytoskeleton Inc.	#FNR03-A	חלבון בדיקה שיכול לשמש כחלבון סטנדרטי עבור MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit	Cytiva	#28403842	חלבונים סטנדרטיים, למשל אלדולאז שניתן לביוטינילציה ולהשתמש בו כתקני משקל מולקולרי עבור MSPT
GM1 Ganglioside (מוח, מלח בקר-נתרן)	Avanti Polar Lipids	#860065	ליפיד - בצורה של שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות שחולצו הנדרשות להיווצרות דו-שכבתית נתמכת
של שומנים עז אנטי-ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, ביוטין	תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב)	#31820	חלבון בדיקה כדי להדגיש את קיומם של מצבי חלבון שונים
איזופרופנול, 99.5%, לספקטרוסקופיה	תרמו פישר מדעי	#10003643
שמן טבילה אוטופלואורסצנטי נמוך	אולימפוס ק.ק.	#IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive	Addgene	#20860	נדרש לבטא ולטהר סטרפטווידין דו-ערכי בשילוב זה עם זה
pET21a-Streptavidin-Dead	Addgene	#20859	נדרש לבטא ולטהר סטרפטווידין דו-ערכי בשילוב זה עם זה
פירס אלקליין פוספטאז, ביוטינילציה	תרמו פישר מדעי	#29339	חלבון בחינה שיכול לשמש כחלבון סטנדרטי עבור חלבון MSPT
Pierce A, חלבון בדיקה ביוטיניל	Thermo Fisher Scientific	#29989	שיכול לשמש כחלבון סטנדרטי עבור MSPT
Refeyn Acquire	Refeyn Ltd.		תוכנת בקרה עבור Refeyn OneMP
Refeyn One	Refeyn Ltd.	-	סטריליים של פוטומטר מסה
0.45 ומיקרו; m קרום אצטט תאית	VWR International	#514-0063	דרוש לסינון חלקיקים ממאגר העניין
סטרפטווידין טטרה-ערכי Thermo	Fisher Scientific	#SNN1001	סטרפטווידין טטרה-ערכי כדי לאפשר נוכחות של מספר אתרי קשירת ביוטין
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µ m גודל נקבוביות, 25 מ"מ מעגל	Cytiva	#110603	גודל נקבוביות של 50 ננומטר מומלץ להיווצרות דו-שכבתית של שומנים נתמכת בהקשר של MSPT
Zepto דגם 2 מנקה פלזמה	Diener אלקטרוני GmbH	-