מאמר שיטה

קליטת מינון של חשיפת תרכובות מבוססות פלטינה ורותניום בדגי זברה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית עם יישומים רחבים יותר

DOI:

10.3791/63587

⸱

21 באפריל 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Department of Biochemistry and Microbiology, Rutgers University, 3Centro de Química Estrutural and Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקצב המוגבר של ניתוחים פרמקו וטוקסיקוקינטיים של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת בדגי זברה יכול להוות יתרון למחקרי תרגום סביבתיים וקליניים. ההגבלה של ספיגת חשיפה לא ידועה הנישאת במים התגברה על ידי ביצוע ניתוח עקבות של מתכות על רקמת דגי זברה מעוכלים באמצעות ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתכות ותרכובות מבוססות מתכת מרכיבות קסנוביוטיקה פרמקו-אקטיבית וטוקסיקולוגית רב-תכליתית. מרעילות מתכות כבדות ועד כימותרפיה, לטוקסיקוקינטיקה של תרכובות אלה יש רלוונטיות היסטורית ומודרנית כאחד. דגי זברה הפכו לאורגניזם מודל אטרקטיבי בהבהרת פרמקו וטוקסיקוקינטיקה במחקרי חשיפה סביבתית ותרגום קליני. למרות שלמחקרים של דגי זברה יש יתרון בכך שהם בעלי תפוקה גבוהה יותר ממודלים של מכרסמים, ישנם מספר אילוצים משמעותיים למודל.

מגבלה אחת כזו טבועה במשטר המינון הנישא במים. לא ניתן לבצע אקסטרפולציה של ריכוזי מים ממחקרים אלה כדי לספק מינונים פנימיים אמינים. מדידות ישירות של התרכובות מבוססות המתכת מאפשרות מתאם טוב יותר עם תגובות מולקולריות וביולוגיות הקשורות לתרכובות. כדי להתגבר על מגבלה זו עבור מתכות ותרכובות מבוססות מתכת, פותחה טכניקה לעיכול רקמת זחל דגי זברה לאחר חשיפה ולכמת ריכוזי מתכות בתוך דגימות רקמה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICPMS).

שיטות ICPMS שימשו לקביעת ריכוזי המתכת של פלטינה (Pt) מציספלטין ורותניום (Ru) ממספר כימותרפיות חדשניות המבוססות על Ru ברקמת דגי זברה. בנוסף, פרוטוקול זה הבחין בריכוזים של Pt שהיו מצומדים במקהלת הזחל בהשוואה לרקמת דגי הזברה. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן ליישם שיטה זו כדי לנפח את מינון המתכת הקיים ברקמות הזחל. יתר על כן, שיטה זו עשויה להיות מותאמת לזיהוי מתכות ספציפיות או תרכובות מבוססות מתכת במגוון רחב של מחקרי חשיפה ומינון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתכות ותרכובות מבוססות מתכת ממשיכות להיות בעלות רלוונטיות פרמקולוגית וטוקסיקולוגית. השכיחות של חשיפה למתכות כבדות והשפעתה על הבריאות הגדילו באופן אקספוננציאלי את המחקר המדעי מאז שנות ה-60 והגיעו לשיא של כל הזמנים ב-2021. הריכוזים של מתכות כבדות במי שתייה, זיהום אוויר וחשיפה תעסוקתית חורגים מגבולות הרגולציה ברחבי העולם ונותרים בעיה עבור ארסן, קדמיום, כספית, כרום, עופרת ומתכות אחרות. שיטות חדשניות לכימות חשיפה סביבתית ולניתוח התפתחות פתולוגית ממשיכות להיות מבוקשות 1,2,3.

לעומת זאת, התחום הרפואי רתם את התכונות הפיזיוכימיות של מתכות שונות לטיפול קליני. לתרופות מבוססות מתכת או מטאלודרוגים יש היסטוריה עשירה של מטרות רפואיות והן הראו פעילות נגד מגוון מחלות, עם ההצלחה הגבוהה ביותר ככימותרפיה4. המפורסמת ביותר של metallodrugs, cisplatin, היא תרופה נגד סרטן מבוססת Pt הנחשבת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כאחת התרופות החיוניות בעולם5. בשנת 2010, ציספלטין ונגזרותיו Pt היו בעלי שיעור הצלחה של עד 90% במספר סוגי סרטן והיו בשימוש בכ-50% ממשטרי הכימותרפיה 6,7,8. אף על פי שכימותרפיה מבוססת Pt זכתה להצלחה בלתי ניתנת לערעור, הרעילות המגבילה את המינון הניעה חקירות של תרופות חלופיות מבוססות מתכת עם אספקה ופעילות ביולוגית מזוקקת. מבין החלופות הללו, תרכובות מבוססות Ru הפכו ל-9,10,11,12 הפופולריות ביותר.

מודלים ומתודולוגיות חדשניים נדרשים כדי לעמוד בקצב הצורך במחקרים פרמקו-פרמקו-מתכתיים וטוקסיקוקינטיים. מודל דג הזברה נמצא בצומת של מורכבות ותפוקה, בהיותו בעל חוליות בעל נקבה גבוהה עם הומולוגיה גנטית שמורה של 70%13. מודל זה היה נכס בפרמקולוגיה ובטוקסיקולוגיה, עם בדיקות מקיפות לתרכובות שונות לגילוי עופרת, זיהוי מטרות ופעילות מכניסטית 14,15,16,17. עם זאת, סינון בתפוקה גבוהה של כימיקלים מסתמך בדרך כלל על חשיפות הנישאות במים. בהתחשב בכך שספיגה יכולה להיות משתנה בהתבסס על התכונות הפיזיקוכימיות של התרכובת בתמיסה (כלומר, פוטו-פירוק, מסיסות), זו יכולה להיות מגבלה עיקרית של קורלציה בין מתן מינון לתגובה.

כדי להתגבר על מגבלה זו לצורך השוואת המינון לבעלי חוליות גבוהים יותר, תוכננה מתודולוגיה לניתוח ריכוזי מתכות קורט ברקמת הזחל של דגי הזברה. כאן הוערכו עקומות מינון-תגובה של נקודות קצה קטלניות וסובלתליות עבור ציספלטין ותרכובות אנטי-סרטניות חדשניות המבוססות על Ru. קטלניות ועיכוב בבקיעה הוערכו בריכוזים נומינליים של 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ו-60 מ"ג/ל' ציספלטין. הצטברות Pt ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS, וספיגת אורגניזמים של מינונים בהתאמה הייתה 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם (Pt) לאורגניזם. בנוסף, זחלי דגי זברה נחשפו ל-0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 מ"ג/ל' של PMC79. ריכוזים אלה נקבעו באופן אנליטי כמכילים 0, 0.17, 0.44, 0.66 ו-0.76 מ"ג/ל' של Ru. פרוטוקול זה גם איפשר הבחנה בין ריכוזים של Pt sequestered בכוריון של הזחלים לעומת רקמת דגי הזברה. מתודולוגיה זו הצליחה לספק נתונים אמינים וחזקים להשוואות של פעילות פרמקו וטוקסיקוקינטית בין כימותרפיה מבוססת היטב לבין תרכובת חדשנית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגי הזברה מזן AB (Danio rerio) שימשו לכל הניסויים (ראו טבלת החומרים), ופרוטוקול הגידול (#08-025) אושר על ידי ועדת הטיפול והמתקנים לבעלי חיים באוניברסיטת ראטגרס.

1. גידול דגי זברה

  1. לגדל ולתחזק את דגי הזברה במערכת בתי גידול מימיים המשחזרת במחזור חושך של 14 שעות אור:10 שעות.
    1. טהרו את מי הברז העירוניים באמצעות סינון חול ופחמן כדי להשיג מי מערכת דגים. שמור על מי המערכת הימית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, <0.05 ppm ניטריט, <0.2 ppm אמוניה ו- pH בין 7.2 ל-7.7.
    2. האכילו את דגי הזברה בתזונה של ציסטות ארטמיה בקעו, שרימפס תמלחת ומזון פתיתי דיאטת דגים.

2. פרוטוקול תגובת מינון של דגי זברה (איור 1)

  1. הכינו תמיסת מי ביצים של דגי זברה, או מים בינוניים E3 או מי ביצים העשויים ממלח ים מלא בריכוז של 60 מיקרוגרם/מ"ל המומסים במים שעברו דה-יוניזציה18. הימנעו משימוש במתילן כחול.
    הערה: באמצעות ICPMS זוהתה הפרעה איזוברית של מי ביצת דגי זברה עבור תחמוצות סטרונציום, אשר חפפו לאיזוטופ של רותניום. שטיפה מדוקדקת של הזחלים לפני ניתוח במורד הזרם העלתה את הבעיה. מדיום E3 עשוי להיות בחירה קלה יותר עבור חלקם בשל ההרכב הקנייני של מלחי ים מסחריים.
  2. ממיסים את התרכובות מבוססות המתכת או המתכת במי E3 או במי הביצה. מערבולת לפירוק כל חומר צבירה והומוגניזציה של הפתרון.
    הערה: בניסוי המתואר להלן, PMC79 וציספלטין הומסו בריכוזים מרביים של 12.4 מ"ג/ל' ו-60 מ"ג/ל' עם ריכוז מרבי של 0.5% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לעמוד בפני משקעים.
    1. דילול מתכות כבדות או תרכובות על בסיס מתכת, כגון PMC79 וציספלטין, עם E3 או מי ביצים, תוך הכנת לפחות 5 מינוני ריכוז.
      1. התחילו עם ריכוזים נמוכים של תמיסות מלאי ברכב טהור (כלומר, DMSO), ואז דיללו עם E3 או מי ביצים. שקול היטב את ריכוזי הרכב הסופיים.
        הערה: תרכובות מסוימות המבוססות על מתכת, כגון ציספלטין, מתפרקות במהירות, והפתרונות שלהן חייבים להיות טריים מדי יום. אזהרה: טפלו במתכות כבדות ובכימותרפיה בזהירות. סקור את גיליון נתוני בטיחות החומר הספציפי (MSDS) עבור המתכת המעניינת. ציספלטין עלול לגרום לגירוי בעיניים ובעור, להיות קטלני אם הוא נבלע, ועלול לגרום לרעילות בכליות, בדם, באיברים יוצרי דם וברקמות העובר. יש להימנע מאדי נשימה וממגע עם העיניים, העור והבגדים. הרכיבו כפפות ובגדים אטומים, ומשקפי בטיחות או משקפי מגן19.
  3. הקימו מיכלי רבייה אחר הצהריים לפני הניסוי ביחס האידיאלי בין 2 נקבות לזכר אחד עם מחיצה בין המינים20.
    1. משכו את המחיצה כאשר האורות נדלקים למחזור הבוקר.
    2. אפשרו לדג הזברה להתרבות.
      הערה: משך הזמן לרבייה תלוי בשלב החשיפה הראשוני הנדרש. עבור 3 שעות לאחר פריטיליזציה, אפשר רבייה במשך כ 2 שעות. הביצים יגיעו ל-3 כ"ס לאחר ניקוי והפרדת ביצים.
    3. העבירו את דג הרבייה למיכל נקי.
    4. אספו את הביצים על ידי שפיכת מי המיכל דרך מסננת.
    5. הפכו את המסננת על צלחת פטרי והשתמשו בבקבוק השפריץ במילוי E3 או במי ביצים כדי לשטוף את הביצים לתוך התבשיל.
    6. נקו את המנה של מזון ופסולת לפני השימוש הניסיוני.
  4. יש לחלק באקראי כעשרים 3 עוברי HPF למנה לבקבוקוני זכוכית בודדים באמצעות פיפטת העברה וכמות קטנה של מים.
  5. לאחר שכל העוברים נמצאים בבקבוקונים, הסירו את כל מי הביציות והחליפו בתמיסת מינון מספקת כך שיהיה כ-1 ס"מ של תמיסה מעל גובה הביצית.
    הערה: יש לשקול היטב את הצורך בהתרת ההדחה. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים.
  6. התבונן בעוברים מדי יום עבור נגעים או קטלניות. בשל ההתפתחות המהירה של דגי זברה עובריים, קבל תמונות יומיות באמצעות כל מיקרוסקופ שדה בהיר / מערך מצלמה כדי לזהות נגעים קלים בין ימים.
  7. בסיום תגובת המינון (4-5 ימים לאחר ההפריה [dpf], לפי הנחיית הארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (OECD)21), שלבו 3-5 זחלים לפני המתת חסד לדגימה מרוכבת. המתת חסד על ידי קירור מהיר על ידי הקפאת הצמדה בחנקן נוזלי.
    הערה: המתת חסד באמצעות מנת יתר של MS-222 או טריקאין מתנסולפונט עלולה להפריע לניתוח ICPMS במורד הזרם. שיטות המתת חסד לקירור מהיר מעודדות עבור פרוטוקול זה כדי להפחית את האפשרות של הפרעה.
  8. לבצע 3 שטיפות של רקמות עם מים בטוהר גבוה (כגון אוסמוזה הפוכה) כדי להסיר את התרכובת העודפת מהחלק החיצוני של הרקמה.
  9. העבר את הדגימות לצינורות צנטריפוגת פוליפרופילן 15 מ"ל בטוחים למיקרוגל ובטוחים במיקרוגל. הקפידו להסיר את כל עודפי המים , שכן כל נוזל שנותר עלול לדלל את החומצה החנקתית, ולכן, את הפוטנציאל המחמצן של החומצה במהלך פירוק הרקמה.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן רקמה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) עד לניתוח נוסף. עבור מתכות שופעות באופן טבעי, ניקוי הצינורות באמבט חומצה חנקתית של 5% לפני השימוש ישפר את רמות הרקע הסביבתיות.

3. עיכול רקמות והערכת ICPMS (איור 2)

  1. הוסיפו כ-0.25 מ"ל לצינורות הצנטריפוגה של פוליפרופילן 15 מ"ל עבור עד 10 זחלים (כ-100 מיקרוגרם) של חומצה חנקתית בטוהר גבוה (69%). Ultrasonicate במשך 1 שעה כדי predigest את הדגימות באמצעות ההגדרות הבאות: פלט אמבטיה קולי: 85 W; 42 קילוהרץ ± 6%; טווח טמפרטורות: 19-27 מעלות צלזיוס.
    אזהרה: ללבוש הגנה על האוזן במהלך sonication. חומצה חנקתית גורמת לכוויות חמורות בדרכי הנשימה, בעין ובעור. לבשו ציוד מגן מלא ועבדו במכסה המנוע של האדים או במקומות עם אוורור הולם. זה יכול להיות דליק עם חומרים אחרים. יש לטפל בחומצה חנקתית אך ורק במכסה אדים כדי למנוע חשיפה לאדים המיוצרים במהלך העיכול. אין לשאוף או לבלוע.
    1. בצע מחזורים קצרים של עיכול רקמות (מרווחים של 5 דקות) במעכל מיקרוגל בטוח לחומצה עד שכל הרקמה מתחמצנת בעליל (כלומר, תמיסה אחידה וצהובה בהירה).
      הערה: מומלץ לבצע את פרוטוקול המיקרוגל בטבלה 1 שלוש פעמים והוא כולל מרווח קירור של 5 דקות בין כל שלב חימום.
    2. עקוב אחר שלמות הצינורות בזהירות כדי למנוע קרע ולבצע סיבובים קצרים בצנטריפוגה (313 × גרם במשך דקה אחת) בין מחזורים כדי להזיז את עיבוי החומצה לתחתית הצינור.
      הערה: אם הרקמה קשה לעיכול (במיוחד כוריונים), ניתן להשתמש במי חמצן בטוהר גבוה של 30% לאחר עיכול חומצי. השתמשו במי חמצן (6.75 מ"ל) כדי לדלל את ריכוז החומצה ל-3.5%, ולאפשר לדגימות לשבת למשך הלילה במכסה אדים. מי חמצן יתפרק ל-H2O ויתאים לניתוח ICPMS. יתר על כן, מתכות חלופיות עשויות להתמוסס טוב יותר בחומצה הידרוכלורית או בתערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה חנקתית (כלומר, אקווה רג'יה). מי חמצן מזיקים אם נבלעים וגורמים לנזק חמור לעיניים. ללבוש עור והגנה על העיניים22,23.
  2. ברגע שהרקמה מחומצנת באופן נראה לעין (כלומר, תמיסה אחידה וצהובה שקופה), מדללים את הדגימות במכסה אדים ל-3.5% חומצה חנקתית באמצעות 6.75 מ"ל של מים ומערבולת בטוהר גבוה כדי לערבב היטב.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר. שלב זה אינו נחוץ אם מי חמצן נוספו כדי לסייע לעיכול בשלב 3.1.
  3. נהלו עקומת כיול תואמת מטריצה של 7 נקודות (טווח ריכוז של 0.001-10 ppb) באמצעות תקן יסודי מאושר (כלומר, Pt או Ru, בהתאם לבדיקה) עם המתכת המעניינת והאיזוטופים האופטימליים כדי להסביר הפרעות איזובריות פוטנציאליות.
    1. באמצעות ריכוז מלאי של תקן היסודי המיימי והמאושר (Ru, Pt = 1000 ppb), קח אליקוט 0.1 מ"ל ופיפט לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. דיללו עם 3.5% חומצה חנקתית לנפח סופי של 10 מ"ל כדי לייצר פתרון סטנדרטי של 10 ppb.
    2. באמצעות מלאי 10 ppb, בצע את הדילולים הטוריים הבאים: 0.1, 1.0, ו- 5.0 ppb פתרונות סטנדרטיים של 3.5% חומצה חנקתית.
    3. באמצעות מלאי 0.1, בצע את הדילולים הטוריים הבאים: 0.001, 0.005 ו- 0.01 ppb פתרונות סטנדרטיים ב- 3.5% חומצה חנקתית.
  4. הכן את מכשיר ה- ICPMS (ראה את טבלת חומרים) לניתוח מדגם כדלקמן:
    1. לפני הפעלת המכשיר, יש לוודא כי שסתום הגז ארגון פתוח, כל הצינורות מחוברים היטב, וחומצה חנקתית נקייה של 5% פתוחה לשטיפת צינורות וכלי זכוכית בין ניתוחים לדוגמה.
    2. בדקו את מצב הלפיד והאצטרובלים, וודאו שתיבת הלפיד נעולה היטב ושצינור הניקוז של תא הריסוס מחובר כראוי לפריפאמפ.
    3. פתח את התוכנה (ראה טבלת החומרים).
    4. בדקו את קריאות הוואקום וודאו שכל משאבות הטורבו פועלות ב-100%.
    5. לחץ על התחל בחלון מצב מערכת בקרת הפלזמה כדי להתחיל את רצף ההתחלה, הפעל את משאבת הפלזמה, צ'ילר הפלזמה, נקה את הנבולייזר והדלק את הפלזמה. המתן עד שהפלזמה תהיה מוארת ויציבה כאשר חלון המצב יציין שרצף האתחול הושלם. בשלב זה, שים לב לנקודות הירוקות בחלון מצב המערכת המציינות שכל ספקי הכוח פועלים.
    6. בשורת התפריטים, לחץ על שליטה | דגימה אוטומטית בתפריט הנפתח. הזן את מיקום המדף האוטומטי עבור הצינור המכיל 5% חומצה חנקתית. אפשר לחומצה להיכנס לפלזמה.
    7. בשורת התפריטים, לחץ על סריקות | מגנט בתפריט הנפתח. בחלון MagnetScan, הקלד 115 במיקום מסת הסמן ולחץ על Enter. אפשרו למגנט לסרוק את טווח המסה של 115אינץ' (114.6083 עד 115.3749) במשך 30 דקות בזמן שהמכשיר מתחמם.
    8. לאחר 30 דקות, השתמש בבקרת ה-autosampler כדי לעבור למיקום של פתרון כוונון רב-שכבתי של 1 ppb. שאפו לפתרון הכוונון וכיוונו את המכשיר כדי למטב את קריאת האות. התאם את מיקום הלפיד (X, Y, Z) כך שהלפיד יהיה מיושר עם מרכז המדוכים וקצב זרימת הנבולייזר (~ 30 psi) בחלון הבקרה של Plasma . בצע את ההתאמות הדרושות בחלון כוונון יון אופטיקה עבור המקור, הגלאי והמנתח.
    9. לאחר אופטימיזציה של קריאת האותות (~1.2 × 106 ספירות לשנייה עבור 1 ppb ב - 115In), לחץ על עצור בחלון סריקת מגנט .
      1. לחץ על כיול מגנט ובחר רזולוציה נמוכה בחלון הקופץ.
      2. לחץ על אישור ופתח את הקובץ "כיול מסה (רזולוציה נמוכה).smc" כדי לכייל את המגנט.
        הערה: כיול המגנטים ימדוד את הספירות/שניות ויתאים לעקומה דרך טווח המסה הבא: 7Li עד 238U.
      3. לחץ על שמור | השתמש כדי להחיל את כיול המגנט הנוכחי על הניתוחים. אם מודדים דגימות לא ידועות עם טווח עצום של ריכוזים, בצע כיול גלאי כדי להשוות בין אותות ספירת יונים בריכוזים נמוכים לאותות יונים מוחלשים המיוצרים בריכוזים גבוהים יותר. נתח את הדגימות לאחר השלמת הכוונון והכיול.
    10. בשורת התפריטים, לחץ על רכישת נתונים.
      1. לחץ על הגדרת השיטה בתפריט הנפתח. השתמש בשיטה קיימת המסופקת על ידי היצרן, או צור שיטה המבוססת על האלמנטים המעניינים. במידת הצורך, התאם את מצב הניתוח, זמן השהייה, השהיית המתג, מספר הטאטואים/מחזורים, הרזולוציה, מצב הזיהוי ומסת הפארק להגדרות הסטייה.
      2. לחץ על שמור כדי להקליט את הגדרות השיטה. מטב את הפרמטרים עבור כל מתכת ואיזוטופ. ראה טבלה 2 עבור פרמטרי הפעולה הספציפיים המשמשים במחקר זה.
    11. בשורת התפריטים, לחץ על רכישת נתונים.
      1. לחץ על Batch Run בתפריט הנפתח. לחלופין, לחץ על סמל BATCH מתחת לשורת התפריטים. ייבא את פרמטרי האצווה מגיליון אלקטרוני, או צור רצף בחלון Batch Run . הזן את סוג הדגימה, את מיקום ארון התקשורת של הדגימה האוטומטית, זמן ההעברה, זמן הכביסה, המשכפלים, מזהה הדגימה וקובץ השיטה.
    12. ארגן את הרצת האצווה בסדר הבא: פתרונות סטנדרטיים לעקומת הכיול (0.001-10 ppb Pt או Ru), ולאחר מכן תקן בקרת איכות, ולאחר מכן דגימות לא ידועות.
      הערה: פתרונות סטנדרטיים נמדדים כספירה/שנייה ב-ICPMS, ורגרסיה ליניארית מותאמת דרך התקנים עם סטיית תקן יחסית (RSD) > 0.999. לא ידועים נמדדים גם כספרות/s ונפתרים לריכוז ב-ppb באמצעות הרגרסיה הליניארית של עקומת הכיול, y = mx + b. ניתן גם להשלים את עיבוד הנתונים באמצעות התוכנה המופנית.
    13. עקוב אחר סחיפת מכשירים ושכפול דגימות על ידי הכללת תקן בקרת איכות של 0.5 ppb כל 5-10 דגימות.
      הערה: תקני בקרת איכות מתאימים צריכים להיות חומר ייחוס סטנדרטי מוסמך השונה מהתקן המשמש בעקומת הכיול.
וואטכחדקות
30050%5
30075%5
3000%5
30075%5

טבלה 1: פרוטוקול עיכול מיקרוגל למסת רקמת הזחל. דגימות הזחל של דגי הזברה עוכלו ב-0.25 מ"ל של חומצה חנקתית. טבלה זו שונתה מ- 24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות אלה פורסמו בעבר24. מחקרי ספיגת רקמות נערכו עם חשיפות המועברות במים של ציספלטין ותרכובת אנטי סרטנית חדשנית מבוססת Ru, PMC79. קטלניות ועיכוב בקיעה הוערכו עבור ריכוזים נומינליים של ציספלטין 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ו-60 מ"ג/ל' ציספלטין. הצטברות Pt ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS, ורקמת האורגניזם הכילה מינונים מתאימים של 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם (Pt) לאורגניזם (איור 3). קביעה אנליטית של הריכוזים הנומינליים ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן יושם כדי לקבוע את האספקה והקליטה של תרופות אנטי סרטניות מבוססות מתכת המכילות Pt או Ru. למרות ששיטות אלה כבר פורסמו, פרוטוקול זה דן בשיקולים ופרטים חשובים כדי להתאים מתודולוגיה זו למגוון תרכובות. פרוטוקול ה-OECD בשילוב עם עיכול רקמות וניתוח ICPMS אפשרו לנו לקבוע ש-PMC79 היה חזק יותר מציספלטין והביא להצטברות רקמות שונה, מה שמרמז על מנגנונים נפרדים. יתר על כן, מכיוון שהמינון שנמסר של ציספלטין כומת, תוצאות תגובת המינון היו אקסטרפולציה לאוכלוסיות המטופלים. מינונים תת-קרקעיים (למשל, LOAEL) היו דומים לריכוז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי עניינים שיש לחשוף על ידי אף אחד מהמחברים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון: NJAES-Rutgers NJ01201, מענק הכשרה של NIEHS T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. בנוסף, בריטני קאראס נתמכת על ידי מענק הכשרה T32NS115700 מ- NINDS, NIH. המחברים מכירים את אנדריאה ולנטה ואת הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) לאספקת PMC79.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AB זן דג זברה (Danio reri)מרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברהמסוג בר ABפרא AB דג זברה
ACS חומצה חנקתית בדרגהVWR BDH כימיקליםBDH3130-2.5LPחומצה חנקתית (68-70%); משמש לייצור 10% HNO3 תמיסת אמבט חומצה להשרייה/טרום צלן צינורות צנטריפוגה
Aquatox Fish Diet (פתיתים)האחים זיגלר, בע"ממזון פתיתים לערבב ביחס של 1:4 של דיאטת דגי Aquatox לפתיתים טרופיים של TetraMin ולהשתמש בו כציסטות ארטמיה להזנה
, ביצי שרימפס מלחPentairAESBS90מי מלח הנמכרות בפחיות 15 אוז, ארוזות בוואקום לבקוע ולהשתמש בהן כדגימה
אוטומטית להזנה ASX-510 עבור ICPMSTeledyne CETACדגימה אוטומטית עם תנועת XYZ ניתנת לצורה, תחנת שטיפה זורמת ובדיקה במימד פנימי של 0.3 מ"מ. תואם לתוכנת Nu AttoLab לניתוחי אצווה הניתנים לתכנות.   
צנטריפוגהThermo ScientificCL 2Thermo Scientific CL 2 צנטריפוגה קומפקטית עם טווח מהירות משתנה של עד 5200 סל"ד; משמש להבאת דגימה ועיבוי חומצה לתחתית צינור הצנטריפוגה במרווחי עיכול מיקרוגל; מסייע בשמירת דגימה
צינורות צנטריפוגהVWR21008-105צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן בעלי ביצועים גבוהים במיוחד עם מכסה שטוח; נפח 15 מ"ל; חסין דליפות עם תחתית
בקבוקוני הברגה מזכוכית שקופה Class AFisherbrand03-339-25Bבקבוקוני זכוכית בודדים לבלימת חשיפה
דימתיל סולפוקסידMillipore SigmaD8418ממס או רכב לתרכובות הידרופוביות
מערבל מערבולת במהירות קבועהVWR10153-834מערבל מערבולת; משמש להומוגניזציה של דגימה לאחר עיכול ודילול חומצה
חמצן בטוהר גבוהMerk KGaA, EDM Millipore1.07298.0250Suprapur מי חמצן (30%); משמש לעיכול דגימה
חומצה חנקתית בטוהר גבוהEDM MilliporeNX0408-2Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); משמש לעיכול דגימות
Instant Ocean SeaSalt Spectrum Brands, Inc.Instant Ocean® תמיסת מי ביצת מלח ים מכילה מלח ים באוקיינוס בריכוז סופי של 60 ומיקרו; גרם/מ"ל
מערכת עיכול מיקרוגל Mars XCEM, Matthews, NCמערכת עיכול חומצות מיקרוגל המשמשת לעיכול והומוגניזציה של דגימות בתנאים אחידים. עבור מתודולוגיה זו הושלמה שיטת העיכול של כלי פתוח באמצעות צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן חד פעמיים בהספק נמוך (300 וואט).
תמיסה מרובת אלמנטים 3SPEX CertiPREPCLMS-3מכיל 10 מ"ג/ליטר Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn ב-10% HCl/1% HNO3; משמש כתקן בקרת איכות לניתוחי Pt ו-Ru
ספקטרומטר מסת פלזמה ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה (HR-ICP-MS)Nu Instruments/Amatekמגזר מגנטי עם מיקוד כפול בשילוב אינדוקטיבי של ספקטרומטר מסת פלזמה עם מערכת חריצים גמישה ברזולוציה נמוכה עד גבוהה, ומערכת גלאי טווח דינמי. עיבוד וכימות הנתונים נעשה באמצעות תוכנה נלווית NuQuant.
תמיסה סטנדרטית פלטינה (Pt), NIST 3140המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה3140מוכן מאמפולה המכילה 9.996 מ"ג/גרם Pt ב-10% HCl; משמש כתקן בקרת איכות לאנליזות Pt
פתרון סטנדרטי פלטינה (Pt), תקניטוהר גבוה100040-2מכיל 1000 מ"ג/ליטר Pt בתמיסה סטנדרטית של 5% HCl
רותניום (Ru),תקניטוהר גבוהים של אלמנט יחיד100046-2מכיל 1000 מ"ג/ליטר Ru ב-2% HCl
TetraMin פתיתים טרופיים Tetra77101מזון פתיתים לערבוב ביחס של 1:4 של Aquatox Fish Diet ל-TetraMin Tropical Flakes ומשמש כמזון
עקבות מתכת חומצה חנקתית VWRBDH Chemicals87003-261Aristar Plus חומצה חנקתית (67-70%); משמש לתמיסת שטיפה באמבט מים אולטראסוני ASX-510 Autosampler
VWRB2500A-DTHאמבט מים אולטראסוני המשמש לסיוע בעיכול חומצה לפני עיכול מיקרוגל
מסוג חרוטית מי של אלמנט יחיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65(2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821(2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97(2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925(2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995(2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323(2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ICPMS

מאמרים קשורים