מאמר שיטה

ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

DOI:

10.3791/63623

⸱

2 במאי 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למיקרוביוטה של המעיים יש תפקיד חשוב בחינוך מערכת החיסון. קשר זה חשוב ביותר להבנת מחלות אוטואימוניות שאינן מונעות רק על ידי גורמים גנטיים, אלא גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את הופעת המחלה ו/או להחמיר אותה. מחקר שפורסם בעבר על הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים אצל נקבות MRL/lpr המועדות לזאבת הראה כיצד שינויים במיקרוביוטה של המעיים יכולים לשנות את התקדמות המחלה. כאן מתואר פרוטוקול לחילוץ דגימות מייצגות מהמיקרוביוטה של המעיים למחקרים על אוטואימוניות. דגימות מיקרוביוטה נאספות מפי הטבעת ומעובדות, מהן מופק הדנ"א בשיטת פנול-כלורופורם ומטוהר על ידי משקעי אלכוהול. לאחר ביצוע PCR, אמפליקונים מטוהרים מרוצפים באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא במעבדה הלאומית ארגון. לבסוף, נתוני ריצוף הגנים של RNA ריבוזומלי 16S מנותחים. לדוגמה, מוצגים נתונים שהתקבלו מהשוואות מיקרוביוטה של המעיים של עכברי MRL/lpr עם או בלי CX3CR1. התוצאות הראו הבדלים משמעותיים בסוגים המכילים חיידקים פתוגניים כמו אלה שבגוף הפרוטאובקטריה, כמו גם בסוג ביפידובקטריום, שנחשב לחלק מהמיקרוביוטה הבריאה. לסיכום, שיטת בידוד הדנ"א הפשוטה והחסכונית הזו אמינה ויכולה לסייע בחקר שינויים במיקרוביוטה של המעיים הקשורים למחלות אוטואימוניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בני אדם וחיידקים התקיימו בדו-קיום במשך זמן רב. הם יצרו מערכת יחסים של תלות הדדית עם השפעות מועילות הדדיות המשפיעות על תגובות החיסון של המארח בדרכים כמותיות ואיכותיות1. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין הרכב המיקרוביוטה של המעיים לבין הפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות הכוללות טרשת נפוצה 2, דלקת מפרקים שגרונית3, סוכרת מסוג2 4, מחלות מעי דלקתיות5 וזאבת אדמנתית מערכתית (SLE)6. עם זאת,עדיין לא ברור אם המיקרוביוטה של המעיים היא הגורם העיקרי או ההשפעה המשנית של המחלות האוטואימוניות הללו. באופן פוטנציאלי, מיקרוביוטה של המעיים עלולה להחמיר את המחלה במהלך שלב ההשפעה של הפרעות אוטואימוניות או למלא תפקיד בוויסות האינדוקציה של מחלות אלה8.

דווח על דיסביוזיס במעיים אצל נקבות הנוטות לזאבת MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr),ונצפו שינויים במיקרוביוטה של המעיים עם דלדול משמעותי של לקטובצילי 9. כאשר תערובת של חמישה זני לקטובצילוס ניתנה דרך הפה, תסמינים דמויי זאבת נחלשו במידה רבה בעכברים אלה, מה שמרמז על תפקיד חיוני של מיקרוביוטה בוויסות פתוגנזה של SLE.

הטכניקה הבאה של מיצוי DNA מאפשרת לעקוב אחר תנודות מיקרוביוטה ולנתח אותם איכותית וכמותית במהלך מחלת מורין SLE בעכברים נוטים זאבת. בין אם לבחון את המיקרוביוטה הבריאה של המעיים או להגדיר דיסביוזיס, חשוב לבחון באופן ביקורתי כיצד הנתונים נאספים והאם הם מדויקים וניתנים לשחזור10. כל שלב הוא קריטי בתהליך זה. יש להשתמש במתודולוגיה מתאימה כדי לחלץ דנ"א מיקרוביאלי, שכן כל בעיה אפשרית בהטיות במהלך תהליך מיצוי הדנ"א עלולה לגרום לייצוג מיקרוביאלי לא מדויק. בעוד ששיטת הפנול-כלורופורם מתוארת כאן, ישנן ערכות זמינות מסחרית לחילוץ דנ"א מחיידקים שעובדות היטב במקרים מסוימים11. עם זאת, השימושיות שלהם מוגבלת על ידי העלות וכמות המדגם הנדרשת.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני ודורש רק כמות קטנה של דגימה. הוא עובד מצוין עם כל סוג של דגימת צואה, והוא שימושי בחקר הדינמיקה של המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן, כמו גם בהשוואות בין קבוצות. הדנ"א מבודד בשיטה של טיהור אלכוהול, המשתמשת בפנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל. מיצוי על בסיס אלכוהול מסייע לנקות ולהסיר את הדגימה של חלבונים ושומנים, שם DNA הוא זירז בשלב האחרון. השיטה המוצעת היא בעלת יעילות ואיכות גבוהות משמעותית והוכחה כמדויקת בזיהוי אוכלוסיות חיידקים. הערה קריטית אחת במהלך ההליך היא שזיהום DNA יכול להתרחש, ולכן נדרש טיפול מתאים בדגימה12.

לאחר מכן, הדנ"א מנותח על ידי פלטפורמות הריצוף של הדור הבא עבור הגן 16S rRNA, כגון Illumina MiSeq. בפרט, אזור ההיפר-משתנה V4 מנותח כדי לספק כימות טוב יותר עבור טקסהבדרגה גבוהה 13. ניתוח הביואינפורמטיקה שלאחר מכן הוא במיקור חוץ, ואחריו ניתוח פנימי בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ישנן תוכנות ביואינפורמטיקה רבות בקוד פתוח הזמינות לריצוף במורד הזרם, וסוג הניתוחים המבוצעים תלוי במידה רבה בשאלה הביולוגית הספציפית המעניינת14. פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשלבי הניסוי לפני הריצוף ומספק שיטה רב-תכליתית, חסכונית, דומה ויעילה יותר להשגת דנ"א מדגימות צואה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לוקוס Cx3cr1 gfp/gfp של עכברי B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J הוחזר לעכברי MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) במשך 10 דורות כדי ליצור עכברי MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp. בדיקת גנום באמצעות לוחות פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) אישרה כי הרקע הגנטי של עכברים חדשים שנוצרו היה זהה ביותר מ-97% לזה של MRL/lpr. לאחר מכן, עכברים גודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם לדרישות הספציפיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק.

1. איסוף דגימות מיקרוביוטה מעכברים

  1. הוציאו כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו. לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים.
    הערה: ניתן להשתמש במכל (לדוגמה,) כדי למקם את העכבר בזמן ההמתנה לדגימת הצואה. נקו את המיכל עם אתנול לפני ואחרי כל עכבר.
  2. הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל 2 מ"ל ששקל מראש. להקליט את משקל הצואה בגרמים, אשר צריך להיות בין 0.02-0.05 גרם לכל גלולה צואה.
  3. הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מ"מ, 500 מיקרון ליטר של חיץ ליזה (50 mM NaCl, 5 mM Tris ו-50 mM EDTA), ו-200 μL של 20% SDS.
  4. חרוז-להכות את הצינור במשך 4 דקות הומוגנייזר (בעוצמה מקסימלית), ואחריו 3-5 דקות של מערבולת.
  5. סובבו לזמן קצר כדי לחסל את הבועות והקצף (לחצו על הכפתור בצנטריפוגה עד שהיא מגיעה ל-1,000-1,200 x גרם, ואז שחררו).

2. מיצוי דנ"א

  1. העבר 350 μL של supernatant שהושגו בשלב 1.5 (תוך הקפדה שלא לשאת פסולת) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. הוסיפו 500 μL של תערובת פנול-כלורופורם-איזואמיל אלכוהול (PCI; 25:24:1, v/v) ומערבולת למשך דקה אחת.
    הערה: מעתה והלאה, יש לטפל בדגימות בתוך מכסה מנוע כימי. PCI הוא רעיל.
  2. סובב ב- 6,000 x g למשך 3 דקות ב- 4 °C. העבר 180 μL מהפאזה המימית (השכבה העליונה) לצינור חדש של מכסה הצמדה של 1.5 מ"ל. מוסיפים 180 μL (1:1) של כלורופורם, היפוך וערבוב.
    הערה: צמצם את הזיהום מהשכבה התחתונה בעת העברת השכבה העליונה.
  3. סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבר 180 μL של הפאזה המימית לתוך צינור מכסה הצמדה חדש.
    הערה: לאחר השלכת PCI וכלורופורם, ניתן לבצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי.
  4. הוסיפו 180 μL של איזופרופנול קר ו-36 μL של 5M NH4Ac. הפוך כמה פעמים כדי לערבב, והניחו את הצינור על קרח למשך 20 דקות.
  5. סובב ב 18,400 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C. יוצקים כדי להשליך את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור מספר פעמים עם 500 μL של קר 70% אתנול תוך היפוך.
    הערה: אתנול צריך להיות מדולל עם מים סטריליים דה-יוניזציה כפולה.
  6. סובבו ב-18,400 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר אתנול שיורי.
  7. יש לייבש באוויר את הצינור במהופך על נייר טישו למשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. להשעות את הכדור ב 50 μL של מים ברמה מולקולרית. מחממים את הנוזל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי DNA גדולים.
  8. סובבו צינורות לאחר חימום כדי לשחזר טיפות עיבוי על המכסה (3,400 x גרם למשך דקה אחת).
  9. מדוד את הריכוז וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במים ברמה מולקולרית כריק. דנ"א באיכות טובה צריך להיות בעל יחסים של 260/280 הנעים בין 1.8 ל-2.
    הערה: תפוקת הדנ"א הצפויה היא לפחות 0.03 גרם לכל כדור צואה.

3. הכנת דגימה לריצוף גנים 16S rRNA

  1. שלח את דגימות הדנ"א למעבדה הלאומית ארגון, שם הן עוברות הכנה לספרייה ומרוצפות על האילומינה מיסק.
    1. שלח דגימות בלוחות 96 בארות מלאים, עם דגימות מסודרות בשורות (A1-A12, B1-B12 וכו '), ואטום עם אטמי לוחות נייר כסף.
    2. שלח נפח סופי של 20 μL לכל דגימה לכל באר, בריכוז הנע בין 1-50 ng/μL.
      הערה: דילולים צריכים להיעשות עם מים ברמה מולקולרית.
    3. לאחר הכנת הדגימות, סובבו ב-600 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני הקפאת הדגימות ב-80°C- למשך 24 שעות.
    4. יש לשלוח למשך הלילה על קרח יבש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות מהמעבדה הלאומית של ארגון מנותחות על ידי ביואינפורמטיקאי מוסמך, ולאחר מכן ניתוח פנימי של הנתונים בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ניתוחי מיקרוביום טיפוסיים כוללים אשכולות של רצפים דומים ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) או וריאנטים של רצפי אמפליקון (ASVs) כפרוקסי למיקרואורגניזמים שונים בדגימה. לאחר מכן ניתן להשתמש בספירות של OTUs או ASVs על פני דגימות כדי לבדוק אם יש שינויים במגוון בתוך הדגימה (אלפא) ובגיוון בין הדגימות (בטא). הם יכולים לשמש גם כדי לבדוק עבור taxa כי הם נפוצים באופן דיפרנציאלי על פני קטגוריות מטא נתונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוביוטה מאוזנת של המעיים יכולה להגן על גוף האדם מפני מחלות. ברגע שאיזון זה מופר על ידי טריגרים חיצוניים או פנימיים, התוצאות יכולות להיות הרסניות. שיטה זו מציגה דרך לנתח את הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של מורין. השיטה מתאימה לא רק להשוואות בין קבוצות, אלא גם למעקב אחר המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן כדי לזהות טוב יותר גורמים תלויי זמן המשבשים את המיקרוביוטה של המעיים.

כל העכברים בניסוי חייבים להיות מטופלים באותה סביבה. אחד הנושאים החיוניים שיש לקחת בחשבון בעת איסוף דגימות צואה הו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מעריכים את העזרה מהמעבדה הלאומית של ארגון ומהביואינפורמטיקאים המשתפים פעולה שלנו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חרוזי זכוכית 0.1 מ"מBioSpec מוצרים11079101
צינורות מכסה בורג 2 מ"לThermo Fisher Scientific3488
20% SDSFisherScientificBP1311-1SDS 20%
96% אתנול, ביולוגיה מולקולרית כיתהThermo Fisher ScientificT032021000CS
אמוניום אצטט (5 מ')Thermo Fisher ScientificAM9071NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/Jמעבדת ג'קסון005582
סערת בלנדר כדורים 24Next Advance4116-BBY24Mהומוגנייזר
כלורופורםFisherScientificC298-500
DEPC-Assisted מיםתרמו פישר מדעיAM9916
אתילנדיאמין חומצה טטראצטיתFisherScientificBP118-500EDTA
חותם צלחת נייר כסףFisherScientificNC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256FisherScientific06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) עכברימעבדת ג'קסון000485
ספקטרופוטומר Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
פנול: כלורופורם: isoamylalchohol (25:24:1)FisherScientificBP1752I-400סולם PCI
עם 4 עשרונייםמטלר טולדוMS205DU
צלחות 96 בארות ThermoFisher ScientificAB-0800
נתרן כלוריFisherScientific15528154NaCl
Tris HydrochlorideFisherScientificBP1757-100
וורטקסתעשיות מדעיותSI-0236

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
  2. Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
  3. Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).
  4. Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085(2010).
  5. Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
  6. Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
  7. Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).
  8. Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
  9. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73(2017).
  10. Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).
  11. Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).
  12. Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365(2016).
  13. Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).
  14. Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
  15. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

16S rRNAPCRProteobacteria

מאמרים קשורים