מאמר שיטה

גיבוש ואפיון מערכת נשאי דופמין מבוססת אקסוזום

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 באפריל 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, שאפנו להשיג ניסוח על ידי העמסת דופמין של האקסוזומים המבודדים של תאי גזע מתאי גזע מזנכימליים ג'לי של וורטון. בידוד ואפיון אקסוזום, העמסת תרופות לתוך האקסוזומים המתקבלים, והפעילות ציטוטוקסית של הפורמולציה המפותחת מתוארים בפרוטוקול זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים בגודל של 40 עד 200 ננומטר מהווים את תת-הקבוצה הקטנה ביותר של שלפוחיות חוץ-תאיות. שלפוחיות ביו-אקטיביות אלה המופרשות על ידי תאים ממלאות תפקיד פעיל במטען ובתקשורת בין-תאיים. אקסוזומים נמצאים בעיקר בנוזלי גוף כגון פלזמה, נוזל מוחי שדרתי, שתן, רוק, מי שפיר, קולוסטרום, חלב אם, נוזל מפרקים, זרע וחומצה פלאורלית. בהתחשב בגודל של אקסוזומים, הוא חשב כי הם עשויים לשחק תפקיד חשוב במחלות מערכת העצבים המרכזית כי הם יכולים לעבור דרך מחסום הדם-מוח (BBB). לפיכך, מחקר זה נועד לפתח מערכת ננו-נשאית מבוססת אקסוזום על ידי עטיפת דופמין לתוך אקסוזומים שבודדו מתאי גזע מזנכימליים ג'לי של וורטון (WJ-MSCs). אקסוזומים שעברו את תהליך האפיון הודגרו עם דופמין. האקסוזומים טעוני הדופמין אופיינו מחדש בסוף הדגירה. אקסוזומים עמוסי דופמין נחקרו במבחני שחרור תרופות וציטוטוקסיות. התוצאות הראו כי ניתן לעטוף בהצלחה דופמין בתוך האקסוזומים וכי האקסוזומים העמוסים בדופמין לא השפיעו על יכולת הקיום של פיברובלסטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים, בועיות ביו-אקטיביות בעלות תכונות משמעותיות, נעים בין 40 ננומטר ל-200 ננומטר. אקסוזומים מקורם בקרום התא והם נוצרים בגלל שחרור האנדוזומים1. מבנים אלה משמשים כמתקשרים בין תאים ומתקשרים עם תאים שכנים כדי להקל על העברת מולקולות פעילות. אקסוזומים יכולים להיות מבודדים ממקורות רבים ושונים. אלה כוללים נוזלי גוף כגון פלזמה, שתן, נוזל מוחי שדרתי, רוק, כמו גם קווי תאים בתרבית בתנאי מבחנה . לאקסוזומים יש תפקיד חשוב בסילוק נזק עצבי, הודות לביו-מקרומולקולות שהם מכילים, כגון שומנים, חלבונים וחומצות גרעין2. גליה, שהם התאים התומכים של מערכת העצבים3, מעבירים חלבונים ומיקרו-רנ"א לאקסונים של נוירונים באמצעות אקסוזומים4.

שומנים המרכיבים את מעטפת המיאלין, שהם תכונה אופיינית בהולכה עצבית, משתחררים גם מאוליגודנדרוציטים באמצעות אקסוזומים 4,5. אקסוזומים מעורבים גם בתהליכים כגון פלסטיות סינפטית, תגובת לחץ עצבי, תקשורת תא-תא ויצירת תאי עצב במוח 6,7. העובדה שלאקסוזומים יש ננו-ממד מאפשרת להם לעבור דרך ה-BBB. יש מסלול מעבר מיוחד מהנוזל הבין-תאי לנוזל השדרה לאחר חדירה לקרום זה8. הודות לתכונות פני השטח שלהם, אקסוזומים יכולים לתקשר ביעילות עם תאי המטרה כמערכת אספקת תרופות ולהעביר באופן פעיל את התרופות הטעונות.

בשל הביטוי של חלבוני דבק שונים (טטרספנינים ואינטגרינים) על פני השטח של אקסוזומים, שלפוחיות חוץ-תאיות אלה יכולות בקלות לתקשר ולהתמזג עם קרום התא המארח9. הוא חשב כי אקסוזומים יכולים לשמש כמערכת העברת תרופות, במיוחד בטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית בשל יכולתם לחדור BBB ואת תכונות פני השטח שלהם. אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים (MSC) הם בעלי סיכון נמוך יותר לדחייה חיסונית בהשוואה לטיפולים תאיים אלוגניים, ומבחינה זו, הם יכולים להיות מרכיב חשוב ביישומי טיפול ללא תאים10.

דופמין הוא מולקולה שמחסור במוח הוא המאפיין האופייני של מחלת פרקינסון (PD), המחמיר מיום ליום11,12,13. ידוע כי מחלת פרקינסון קשורה לניוון של נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור של המזנצפלון ולאובדן תפקודי נוירונים מוטוריים14,15. המוות של נוירונים דופמינרגיים מונע את אספקת המוליך העצבי דופמין לסטריאטום המוח. זה, בתורו, מביא את הופעתם של סימפטומים ספציפיים PD16. תסמינים אלה של פרקינסון הם ברדיקינזיה, חוסר יציבות יציבה, נוקשות, ובמיוחד רעד במנוחה12,13. למרות שמחלת פרקינסון תוארה לראשונה לפני יותר ממאתיים שנה, מחקרים להבנת הפתולוגיה והאטיולוגיה של המחלה עדיין נמשכים וכיום מקובל כי פרקינסון היא מחלה מערכתית מורכבת17. זה צפוי כי מחסור בדופמין מתרחש, ותסמינים קליניים PD נצפים כאשר יותר מ 80% של נוירונים מתנוונים18. בטיפול במחלה, תוספת דופמין חלקית עדיפה כדי להפחית את הסימפטומים המוטוריים. מחקרי In vivo הראו כי עירוי ישיר של דופמין למוח מפחית באופן משמעותי את הסימפטומים אצל בעלי חיים19. מבשרי דופמין כגון L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) ותרופות קולטן דופמין משמשים במרפאה מכיוון שעירוי ישיר של דופמין למוח אינו אפשרי בבני אדם ודופמין הנכנס למערכת אינו יכול לחצות את BBB20. תרופות מסוג זה מאבדות את יעילותן עם הזמן. עם זאת, עדיין אין גישה טיפולית מרפאת לפרקינסון. לפיכך, יש צורך עצום לפתח אסטרטגיות טיפוליות ושיטות טיפול חדשות כדי לחשוף את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהפחית את ההשפעה של פרקינסון על החולים.

מחקרים מבוססי אקסוזום משכו לאחרונה תשומת לב לאיסוף מידע הן על גישות טיפוליות והן על פתולוגיות של מחלות מערכת העצבים. אקסוזומים שמקורם ב-MSC הוכחו כמפחיתים דלקת בנזק עצבי ותורמים להתחדשות עצבית21,22,23. בנוסף, דווח כי הפרשות אקסוזום שמקורן ב- MSC מפחיתות אפופטוזיס על ידי הצגת השפעות נוירוטרופיות ונוירופרוטקטיביות, במיוחד על נוירונים דופמינרגיים24,25. המחקר על פלטפורמות שבהן אקסוזומים משמשים כמערכות מתן תרופות טיפוליות הואץ באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות. במחקרים רבים, נצפה כי תרופות רלוונטיות יכולות להיעטף בקלות לאקסוזומים ולהעביר בבטחה לתאי מטרה, רקמות ואיברים26,27. שיטות שונות כגון דגירה, מחזורי הקפאה/הפשרה, סוניקציה ושחול יכולות לשמש להעמסת תרופות לתוך אקסוזומים28.

דגירה עם אקסוזומים או שלפוחיות דמויות אקסוזום מאפשרת למולקולות קטנות ליפופיליות להיות עטופות באופן פסיבי במערכות העברה אלה28,29,30. בפרט, מולקולות שונות כגון כורכומין 31, קטלאז 30, דוקסורוביצין32 ופקליטקסל33 הועמסו ביעילות לתוך אקסוזומים. נצפה כי אקסוזומים המכילים קטלאז, בעלי פעילות נוגדת חמצון, צברו ביעילות בנוירונים ובתאי מיקרוגליאה במוח והפגינו פעילות נוירופרוטקטורית חזקה30. באותו מחקר, סאפונין, שנוסף למתחם כדי להגביר את יעילות ההעמסה, נמצא כמגדיל את אחוז העמסת התרופה במהלך הדגירה30,34. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע את הסטנדרטים להעמסת תרופות לתוך אקסוזומים.

מאמר זה מתאר את התפתחותה של מערכת ננו-נשאית על ידי אנקפסולציה של דופמין לתוך אקסוזומים שבודדו מ-WJ-MSCs. כל השלבים, כולל טיפוח WJ-MSCs, בידוד ואפיון אקסוזומים, ניסויי העמסת תרופות, אפיון אקסוזומים טעוני דופמין בטכניקות שונות, וניתוח ציטוטוקסיות חוץ גופית מוסברים בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. טיפוח ושימור בהקפאה של תאי גזע מזנכימליים ג'לי של וורטון

  1. הוציאו את WJ-MSCs (מ-ATCC) מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C. זרעו את התאים לתוך בקבוק המכיל DMEM-F12 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). לדגור אותם ב 37 ° C באינקובטור המכיל 5% CO2.
  2. שנה את מדיום התרבות כל יומיים. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 80%. לשטוף את התאים כדי לעבור עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS).
    הערה: שטיפה עם PBS לפני הוספת טריפסין מבטיחה הפרדה קלה של תאים מפני השטח של הבקבוקון.
  3. הסר את PBS והוסף 5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לצלוחית. יש לדגור על הבקבוק במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור המכיל 5%CO2.
  4. אספו את הסופרנאטנט לתוך הצינור והצנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM-F12 + 10% FBS לצינור על ידי pipetting.
  5. מעבירים את התאים לבקבוק גדול יותר וממשיכים את התרבית על ידי הוספת DMEM-F12 + 10% FBS עד לקבלת אקסוזומים מספיקים35.
    הערה: תאים בתרבית מוקפאים בצפיפות של 1 מיליון / מ"ל עם 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) ומאוחסנים ב -80 ° C.

2. ייצור אקסוזומים מתאי גזע מזנכימליים של Wharton's Jelly

הערה: אקסוזומים מבודדים מתאי WJ-MSC בתרבית. בידוד אקסוזום מתבצע כאשר התאים מכסים את משטח הבקבוק ומגיעים לצפיפות של כ-80%.

  1. הסר את המדיום supernatant המכיל 10% FBS מן הבקבוק ולשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS. הוסף מדיום DMEM-F12 ללא סרום לתאים לאחר שטיפה עם PBS. דגרו צלוחיות במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2. לאחר הדגירה, יש לאסוף את התווך נטול הסרום בצינור ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: בשלב 2.1, 180 מ"ל של מדיום ללא סרום נאסף ומאוחסן ב -20 ° C. לאחר ההפשרה, מתחיל תהליך צנטריפוגה אצווה, כמתואר להלן.
  2. בידוד אקסוזומים
    1. צנטריפוגה את התווך ללא סרום שנאסף ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב +4 ° C. בזהירות למשוך את supernatant ולהעביר אותו צינור אחר.
    2. צנטריפוגה הסופרנטנט שנאסף ב 2,000 × גרם במשך 10 דקות ב +4 ° C. בזהירות למשוך את supernatant ולהעביר אותו צינור אחר.
    3. צנטריפוגה את supernatant שנאסף ב 10,000 × גרם במשך 30 דקות ב +4 ° C. בזהירות למשוך את supernatant ולהעביר אותו צינור אחר.
    4. העבירו את הסופרנאטנט שנאסף לצינורות אולטרה-צנטריפוגות ולאולטרה-צנטריפוגות ב-110,000 × גרם למשך 130 דקות. מוציאים לאט את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ"ל PBS לכדורית.
    5. סובבו את הגלולה והאולטרה-צנטריפוגה ב-110,000 × גרם במשך 70 דקות ב-+4°C36 (איור 1). מוציאים לאט את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ"ל PBS לכדורית.
      הערה: לאחר השלמת שלבי האולטרה-צנטריפוגה, ניתן לאחסן את האקסוזומים המתקבלים ב-80°C-. הגלולה המתקבלת מוכנה כעת לאפיון.

figure-protocol-1
איור 1: בידוד אקסוזום. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אפיון אקסוזומים

  1. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    הערה: ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים מבוצע כדי לקבוע את הגודל והריכוז של האקסוזומים המבודדים. טבליות המשמשות לפתרון PBS 1x חייבות להיות בטווח של pH 7.3-7.5. 1x PBS Solution מכיל 10 mM פוספט buffer, 137 mM נתרן כלורי, ו 2.7 mM אשלגן כלורי. הפתרון מוכן על ידי הוספת 1 טבליה PBS ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. פתרון מוכן זה מעוקר על ידי autoclaving.
    1. דללו את האקסוזומים פי 100 על ידי הוספת 990 μL של PBS ל-10 μL של אקסוזומים. לוקחים את המתלה המדולל לתוך מזרק חד פעמי.
    2. הפעל את התקן נת"ע וחבר את המחשב. פתח את התוכנה.
    3. הזריקו את הדגימה במזרק לתוך הצינורית באזור הקלטת של המכשיר. סגור את כיסוי הקלטת של המכשיר.
    4. בתוכנה שנפתחת, לחץ על כפתור התחל ניתוח . שמור את התוצאות שהתקבלו על ידי לחיצה על תקליט לחצן.
  2. ניתוח פיזור אור דינמי
    הערה: אקסוזומים שבודדו עבור פוטנציאל זטה ומדידת גודל מדוללים גם הם באותו אופן כמו עבור ניתוח נת"ע.
    1. הוסף 980 μL של PBS ל 20 μL של האקסוזומים.
    2. פתח את התקן גודל zeta ואת המחשב המחובר. פתח את התוכנה.
    3. הוסף את המתלה משלב 3.2.1 לקובט החד פעמי. פתח את מכסה המכשיר, הנח את הקובט בקלטת וסגור את המכסה.
    4. בחר את סוג הקובטה בתוכנת המכשיר. לחץ על כפתור התחל ניתוח עבור פוטנציאל zeta וניתוח ממדי.
      הערה: הניתוחים מבוצעים בנפרד עבור ניתוח ממדי ופוטנציאל zeta.

4. העמסת דופמין לתוך אקסוזומים

הערה: לאחר השלמת אפיון האקסוזומים של WJ-MSCs, התקבלו אקסוזומים טעוני דופמין כמערכת אספקת תרופות. העמסת תרופות לתוך אקסוזומים מתבצעת בשיטת הדגירה.

  1. הוסף 3 מ"ל PBS למתלה האקזוזום משלב 2.2.5. יש לעקר את המתלה המדולל על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. מעבירים 500 μL של המתלה האקזוזום המעוקר לצינור אחר.
  2. הכינו תמיסת דופמין (0.5 מ"ג/מ"ל) עם מים מזוקקים. הוסף 500 μL של תמיסת דופמין לתוך צינורות המכילים את exosomes.
  3. הוסף ספונין להשעיה בשלב 4.2. לדגור את תרחיף exosome-dopamine מוכן במשך 24 שעות ב 37 ° C.
    הערה: ריכוז הסאפונין לא יעלה על 0.002% מהתמיסה הכוללת.
  4. אולטרה-צנטריפוגה של המתלה ב-90,000 × גרם למשך 70 דקות כדי להסיר דופמין וסאפונין חופשיים מהמדיום. יש לאחסן את האקסוזומים המבודדים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש לניתוח נוסף37.
    הערה: הוסף 0.02% חומצה אסקורבית ליציבות תמיסת הדופמין המוכנה.

5. אפיון אקסוזומים טעוני דופמין

  1. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    הערה: ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים מבוצע כדי לקבוע את הגודל והריכוז של אקסוזומים מבודדים.
    1. בצע את השלבים 3.1.1-3.1.4 כדי לדלל את האקסוזומים ולבצע NTA.
  2. ניתוח פיזור אור דינמי
    הערה: אקסוזומים שבודדו עבור פוטנציאל זטה ומדידת גודל מדוללים גם הם בדומה לניתוח נת"ע.
    1. בצע את שלבים 3.2.1-3.2.4 כדי לדלל את האקסוזומים ולבצע ניתוח פיזור אור דינמי.
      הערה: גודל ופוטנציאלי זטה עבור כל תמיסה (ספונין, דופמין, אקסוזום-דופמין) מנותחים בנפרד.

6. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)

הערה: כמויות הדופמין המועמסות באקסוזומים נמדדות בשיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC). כדי לזהות את נוכחותו של דופמין בתוך הניסוח המתקבל, אקסוזומים מפוצצים בתהליך מיוחד.

  1. הכניסו את הנוסחה לתנור חימום של 75°C כדי להתאדות. הוסף אצטוניטריל (יחס 50:50) למתלה ולמערבולת. סוניק את התמיסה למשך 10 דקות.
  2. צנטריפוגה התמיסה למשך 10 דקות ב 10,000 × גרם. סננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
  3. נתח את כל האנליטות באמצעות עמודת C18 ב- 30 ° C בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה (השלב הנייד H2O/acetonitrile). מדוד את הספיגה ב 230 ננומטר38.

7. מדידת קיבולת העמסת תרופות (DL) וקינטיקה של שחרור תרופות במבחנה

  1. קיבולת העמסת תרופות (DL)
    הערה: כמות הדופמין המוטענת לתוך אקסוזומים מכומתת באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis. הספיגה נקראת ב 280 ננומטר. הסופרנאטנטים שנאספו במהלך הסינתזה משמשים למדידת כמות התרופה שנפרקה. ריכוז הדופמין בסופרנאטנט נקבע באמצעות עקומת כיול סטנדרטית לדופמין.
    1. הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל דופמין. הכינו ריכוזים של 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ו-0.5 מ"ג/מ"ל מתמיסת הציר באמצעות מים מזוקקים.
      הערה: הוסף 0.02% חומצה אסקורבית ליציבות תמיסת הדופמין המוכנה.
    2. צור עקומת כיול סטנדרטית על ידי מדידת הספיגה של כל דילול של דופמין ב 280 ננומטר בספקטרופוטומטר UV.
    3. למדוד את הספיגה של supernatant ב 280 ננומטר.
    4. חשב את קיבולת טעינת התרופה עבור דופמין באמצעות Eq (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      הערה: הניתוח מתבצע בשלשה.
  2. קינטיקה לשחרור תרופות במבחנה
    הערה: קינטיקה של שחרור תרופות של אקסוזומים עמוסי דופמין מבוצעת באמצעות קרום דיאליזה. PBS, pH 7.4, משמש כמדיום שחרור כדי לדמות מיקרו-סביבה פיזיולוגית.
    1. הוסף 1 מ"ל של אקסוזומים טעונים בדופמין לקרום הדיאליזה. מניחים את הממברנה בתוך כד. הוסף 15 מ"ל PBS לכד.
    2. דגימה של 1 מ"ל של מדיום שחרור בכד במהירות 0.5, 1, 2, 4, 6 ו-8 שעות. בכל נקודת זמן, החלף את נפח הדגימה ב- PBS טרי. נתח את הדגימות שנלקחו במרווחי זמן מוגדרים ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרומטר UV-Vis.
    3. חשב את התוצאות באמצעות Eq (2)40.
      שחרור (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      הערה: עקומת כיול מוכנה לקביעת קינטיקה של שחרור תרופות חוץ גופיות . תמיסת דופמין מוכנה בריכוזים של 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ו-5.0 מ"ג/מ"ל. ערך ספיגת UV של כל ריכוז נקבע על 280 ננומטר עם ספקטרופוטומטר UV-Vis.

8. בדיקת ציטוטוקסיות חוץ גופית

  1. התחדשות ותרבות של פיברובלסטים
    1. מוציאים את הפיברובלסטים מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C. זרעו את התאים לתוך בקבוק המכיל DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. לדגור על התאים ב 37 ° C באינקובטור המכיל 5% CO2. שנה את מדיום התרבות כל יומיים.
    3. עוברים את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80%. בצע את שלבים 1.3-1.5. לאחר צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של DMEM-F12 + 10% FBS, וזרע 10,000 תאים לכל באר בצלחת 96 באר.
      1. הוסף DMEM-F12 בינוני + 10% FBS ודגר על התאים ב 37 ° C במשך 18 שעות באינקובטור המכיל 5% CO2. שנה את התווך של הבארות בסוף הדגירה.
    4. הכינו את מלאי ההשעיה האקזוזום טעון הדופמין. דללו את הנוסחה האקזוזום העמוסה בדופמין בתווך כדי לקבל ריכוזים של 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL ו-1,000 μL/mL.
    5. מוסיפים את הריכוזים המוכנים על התאים בתוך כל באר של צלחת 96 בארות. לדגור על הצלחות ב 37 ° C במשך 18 שעות באינקובטור המכיל 5% CO241.
  2. בדיקת כדאיות תא MTT
    הערה: בסוף הדגירה, יחסי הכדאיות של התאים נקבעים על ידי בדיקת MTT.
    1. הכן את תמיסת MTT (5 מ"ג / מ"ל) עם PBS. הוסף 10 μL של תמיסת MTT לכל באר. לדגור במשך 4 שעות ב 37 ° C.
    2. בסוף הדגירה, להוסיף 100 μL של DMSO לכל באר. דוגרים על הצלחות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. מדוד את ערכי הספיגה בקורא ELISA ב- 570 ננומטר42,43.
      הערה: בדיקת הכדאיות MTT מבוצעת במשולש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד ואפיון אקסוזום
תאי גזע של ג'לי וורטון מתורבתים ומודגרים בתווך ללא סרום במשך 48 שעות כאשר התרבית מגיעה לצפיפות מספקת. לאחר סיום הדגירה, supernatant מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הסופרנאטנטים שנאספו מדוללים באמצעות PBS ונתונים לאולטרה-צנטריפוגה (איור 1). הפתרון המתקבל מנותח על ידי ניתוחי נת"ע ו-DLS. האקסוזומים עוברים עיקור על ידי מעבר דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. הגודל הממוצע של האקסוזומים המתקבלים נקבע כ-98 ננומטר (וידאו 1). כ-10 מיליארד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים הם בועיות קרום קטנות עם ממדים של 40-200 ננומטר המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, למשל, MSCs1. אקסוזומים מסוגלים לאפשר תקשורת בין תאים, ויכולים להיכנס לתאים בדרכים שונות כגון אנדוציטוזה, פאגוציטוזה, מיקרופינוציטוזה, הפנמה בתיווך שומנים ואיחוי33,44. בהשוואה למערכות ננו-נשאיות אחרות, השומנים והכולסטרול הנמצאים על פני השטח האקזוזום מקנים את היכולת לשאת מולקולות הידרופיליות והידרופוביות כאחד, כאשר קשר המימן של קצות הכולסטרול מאפשר אריזה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה בעיקר על ידי מימון מחקר שסופק על ידי Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; מסנן ממברנה מAisimoמשמש לתהליך העיקור
0.45 ומיקרו; m מסנן מזרקAisimoמשמש לתהליך העיקור
15 מ"ל צינור פלקוןקןמשמש בתרבית תאים שלב
25 ס"מ2 צלוחיות תרבית תאים (פלקון, צלוחיות תרבית רקמות TPPקןמשמש בתרבית תאים
שלב 50 מ"ל צינור פלקוןקןמשמש בשלב תרבית
תאים75 ס"מ2 צלוחיות תרבית תאים (פלקון, צלוחיות תרבית רקמות TPPקןמשמש בתרבית תאים שלב
96 צלחות באר (פלקון, מיקרו-פלטות TPP)Merck Milliporeמשמש בשלב תרבית תאים
אצטוניטרילסיגמא271004-1Lמשמש לניתוח HPLC
אוטוקלאבNUVE-OT 90Lמשמש לתהליך העיקור
תא תא תרביתHera Safe KSמשמש לתהליך תרבית תאים
צנטריפוגליהיטאצ'יCF16RNמשמש
בחממת CO2 שלב בידוד האקסוזום עם תא בטוח UVPanasonicמשמש לתהליך תרבית התאים
דופמין הידרוכלוריד H8502-10GSigmaH8502-10Gמשמש בהעמסת
דופמין אקסוזוםDualbecco's Modified Eagle's Media/Blend Mix-F12SigmaRNBJ7249שימש כמדיום תרבית תאים
סרום בקר עוברי-FBSCapricornFBS-16Aהוא שימש על ידי הוספה למדיום תרבית התאים.
מקפיא -80 מעלות; CPanasonicMDF-U5386S-PEלאחסון תאים והאקסוזומים המתקבלים
מקררPanasonicMPR-215-PEמשמש לאחסון תרבית תאים וחומרים אחרים
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים-HPLCAgilent Technologiesנבדקה נוכחות של דופמין מתכולת הפורמולה המתקבלת.
מיקרוסקופ- PrimovertZeissמשמש לתצפית על תאים בתרבית תאים.
בדיקת MTTBiomatikמשמש למדידת כדאיות התא
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalמשמש לאפיון אקסוזומים
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman Coulterמשמש בשלב בידוד האקסוזום
טבליתPBS Biomatik43602בהכנת תמיסת PBS
Penicilin/ תמיסת סטרפטומיציןמזל גדיPB-Sהוא נוסף למדיום כדי למנוע זיהום בתרבית תאים.
Pipette AidIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMמשמש להכנת תמיסות
Q500 SonicatorQsonica, LLCמשמש לעיכול אקסוזומים בניתוח HPLC
SaponinSigma47036-50G-Fהוא שימש על ידי הוספתו לתמיסה הכוללת בתהליך העמסת הדופמין האקסוזום.
ספקטרוסטאר-ננו-ספקטרופוטומטריהBMG LABTECHמשמש לניתוח MTT ושחרור תרופות
החבילה הסטטיסטיתSPSS 22
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexמשמש לערבוב תמיסות באופן הומוגני
אמבט מים 37 ו-deg; C-SenovaSenovaבשימוש בשלב תרבית התאים
וורטון s ג'לי תאי גזע מזנכימלייםATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSמשמש לאפיון אקסוזומים
תוכנית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Exosome Carrier SystemDopamine EncapsulationExtracellular VesiclesBlood Brain BarrierWharton s Jelly ExosomesNanoparticle TrackingSerial CentrifugationDrug Release AssayCytotoxicity AssayMTT Assay

מאמרים קשורים