פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של הזיהום או הנזק. נכון לעכשיו, המודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), קשירת צקל וניקוב (CLP) ומערכות מודל לזיהום חד-בקטריאלי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את תגובות המארח במהלך דלקת הצפק הספיגה הנגרמת על ידי זיהום סלמונלה טיפימוריום בעכברים. ב. טיפימוריום, פתוגן תוך-תאי גראם-שלילי, גורם למחלה דמוית טיפוס בעכברים.
פרוטוקול זה מפרט את הכנת התרבית, אינדוקציה של דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, ושיטות לחקר תגובות פונדקאיות סיסטמיות. יתר על כן, מוצגת הערכת נטל החיידקים באיברים שונים והניתוח הציטומטרי של הזרימה של מספרי נויטרופילים מוגברים בשטף הצפק. סלמונלה אלח דם הנגרם על ידי טיפימוריום בעכברים מוביל לעלייה בציטוקינים פרו-דלקתיים ולחדירה מהירה של נויטרופילים בחלל הצפק, מה שמוביל להישרדות נמוכה יותר.
כל שלב בפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה, וכתוצאה מכך שכפול גבוה של הפתוגנזה של דלקת הצפק הספיגה. מודל זה שימושי לחקר תגובות אימונולוגיות במהלך אלח דם חיידקי, את התפקידים של גנים שונים בהתקדמות המחלה, ואת ההשפעות של תרופות כדי להחליש אלח דם.
מבוא
אלח דם מוגדר כתגובה דלקתית מערכתית ומערכתית לא מווסתת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים המרוחקים ממקום ההדבקה או הנזק. הלם ספטי הוא תת-קבוצה של אלח דם המאופיינת בלחץ דם הנמשך במהלך החייאה נפחית, עם סיכון מוגבר באופן משמעותי לתמותה1. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו במהלך מגיפת COVID-19. למרות התמותה הגבוהה הקשורה אליו, נתונים אפידמיולוגיים מקיפים על הנטל העולמי של אלח דם חסרים בגלל המורכבות של האבחנה שלו. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מקרים של אלח דם ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים 19.7% מכלל מקרי המוות בעולם2. יתר על כן, מחקר על השכיחות המורחבת של זיהום ואלח דם קשור בחולי יחידות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום נערכו במתקני ביו בטיחות ברמה 2 (BSL-2). יש להקפיד על שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE), להבטיח בטיחות ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים, IISc. עכברים גודלו והוחזקו במתקן המרכזי לבעלי חיים של IISc (מספר רישום: 48/1999/CPCSEA, מיום 1/3/1999), שאושר על ידי המשרד לאיכות הסביבה והיער, ממשלת הודו. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה למטרה ובקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים עם מספר ההיתר המאושר CAF/Ethics/797/2020.
הגדרת BSL2: דירוג BSL2 מייצג כי הסוכנים הביו-האזרדיים מהווים איום מתון על הסביבה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אפיון מפורט של התגובה החיסונית של המארח באמצעות מודל מסוים זה מוצג בפרסומים קודמים 8,9. כמה תוצאות מייצגות של הפרוטוקול המתואר מתוארות בסעיף זה. מודל זה נועד לגרום לזיהום מערכתי של S. טיפימוריום על ידי הזרקה תוך-צפקית של תרבית החיידקים כדי לגרום לאלח דם. כדי לאשר את הזיהום, התפשטו הליזטים של הכבד והטחול מעכברים ספיגה על צלחות אגר של SS, ומספר המושבות נספר. באיור 1, התמונות של לוחות אגר SS מצביעות על נטל ה-CFU של האיברים בכבד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מתאר שיטה של גרימת צורה חמורה של אלח דם חיידקי על ידי הזרקה תוך צפקית של סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי, ולכן, פתוגני מאוד, מחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאיות הדלקתיות והקטלניות8 ואת ההשפעות של התערבות טיפולית בהחלשת אלח דם.
במער.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים למתקן המרכזי לבעלי חיים, IISc על שסיפק לנו עכברים למחקר. מחקר זה מומן על ידי מענקים ל- DpN מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומועצת מחקר מדע והנדסה, ממשלת הודו. התמיכה התשתיתית מתוכנית DBT-IISc ומענקי DST-FIST זוכה להכרה רבה. אנו מודים לכל החברים הקודמים והנוכחיים במעבדת DpN על תמיכתם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| 1 מ"ל מזרק סטרילי עם מחט 26 גרם | בקטון דיקינסון, סינגפור | 303060 | |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | טרסונס, ארה"ב | 500010 | |
| מזרק סטרילי 10 מ"ל עם מחט 21 גרם | בקטון דיקינסון, ספרד | 307758 | |
| 50 מ"ל בקבוק חרוטי | טרסונס, ארה"ב | 441150 | |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה מדורג | , ארה"ב | 546041 | |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה בוגר | טרסונס, ארה"ב | 546021 | |
| מפזר תאים | VWR, ארה"ב | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco' s פוספט חוצץ | מלח HiMedia, מומבאי, הודו | TS1006 | |
| אתנול | Merck | 100983 | |
| חוסם FcR | BD Biosciences | 553142 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10270-106 | |
| FITC חולדה נגד עכבר Ly6G (שיבוט 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | G9012 | |
| הומוגנייזר מבוסס יד | - | ||
| המוציטומטר (תא ספירת נויבאואר) | רוהם, הודו | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, מומבאי, הודו | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, ארה"ב | 460091 | |
| RPMI | Himedia, מומבאי, הודו | AT060-10X1L | |
| סלמונלה-שיגלה אגר | HiMedia, מומבאי, הודו | M108 | |
| נתרן אזיד | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| <חזק>ציוד | |||
| צנטריפוגה | ציטומטר | ||
| זרימה | BD FACSverse | ||
| חממה | N-biotek | ||
| ספקטרופוטומטר | Shimadzu | ||
| Sartorius |
מקורות
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
