Method Article

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הומאוסטזיס של חלבונים in vivo היא המפתח לדעת כיצד התאים פועלים הן במצב פיזיולוגי והן במצב של מחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג in vivo וטיהור לאחר מכן של חלבונים מסונתזים חדשים באמצעות קו עכברים מהונדס כדי לכוון את תיוג החלבונים לאוכלוסיות תאיות ספציפיות. זהו קו אינדוקטיבי על ידי ביטוי Cre recombinase של L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*), המאפשר שילוב אזידונורלאוצין (ANL) לחלבונים, אשר אחרת לא יתרחש. באמצעות השיטה המתוארת כאן, ניתן לטהר פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo ולזהות שינויים עדינים בתכולת החלבון עקב הפחתת מורכבות הדגימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הומאוסטזיס של חלבון Aberrant נגרמת על ידי חוסר איזון בסינתזת חלבונים והשפלה. מספר מחלות קשורות לשינויים בהומאוסטזיס חלבונים. סימן ההיכר של מחלות מסוימות הוא נוכחות של אגרגטים במקומות תת-תאיים שונים ובאזורי מוח. הומאוסטזיס של חלבונים לא רק חשוב במחלות, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתפקוד תקין של איברים ותאים1. לדוגמה, סינתזת חלבונים נחוצה לצורות רבות של פלסטיות עצבית2,3, כפי שנקבע על ידי שימוש במעכבים כימיים החוסמים את סינתזת החלבון4. עם זאת, לא ברור באילו סוגי תאים הפרוטאום משתנה כדי לתמוך בלמידה ובזיכרון, וגם לא מובן אילו חלבונים ספציפיים בכל סוג תא מגבירים או יורדים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור משרדי הממשלה המקומיים בגרמניה (RP Darmstadt; פרוטוקולים: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) או ספרד (הוועדה לניסויים בבעלי חיים ב- UCM וייעוץ סביבתי של Comunidad de Madrid, מספר פרוטוקול: PROEX 005.0/21) והם תואמים לכללי אגודת מקס פלנק ולתקנות הספרדיות ופועלים לפי הנחיות האיחוד האירופי לרווחת בעלי חיים.

1. תיוג מטבולי in vivo עם ANL

  1. שתייה:
    1. ממיסים ANL ומלטוז במי השתייה הרגילים של העכברים. ריכוז המלטוז המומלץ הוא 0.7% (wt/vol). הכמות המרבית של ANL שמוסיפים למי השתייה היא 1% (wt/vol). לאחר שהתערובת מוכנה, עקרו אותה על ידי סינון ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול המתואר (המסוכם באיור 1), ANL ניתן לעכברים על ידי זריקות תוך-צפקיות יומיות (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) במשך 7 ימים, או באמצעות מי שתייה (0.7% מלטוז, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) במשך 21 יום. לאחר התיוג, אזורי המוח המתאימים נותחו, שכבו, הושאלו ונלחצו. תגובות הקליק נותחו על ידי SDS-PAGE ו-Western Immunoblot. תמונות מייצגות של הניסויים מוצגות באיור 2 עבור ניהול ANL באמצעות הזרקת IP ובאיור 3 עבור מתן ANL באמצע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול הם; הכללת בקרות שליליות, שיש מספיק שכפולים ביולוגיים, מסלול ניהול ANL, כמות ומשך, אלקילציה של הדגימות, ריכוז אלקין, וחיסול β-מרקפטואתנול בעת שימוש ב- DST-alkyne.

המפתח הוא לכלול דגימות בקרה שליליות הנובעות מבעלי חיים המסומנים ב-ANL ללא נהג Cre ולכן ללא ביטוי MetRS*. דגימות אלה חייבות להיות כפופות לכל שלב המתואר בפרוטוקול במקביל לדגימות מעכברי MetRS* המושרים על-ידי CRL עם תווית CLE. דוגמאות שלא נלחצו אינן פקדים חוקיים, מכיוון שכל תוצאה שהושגה באמצעות פקד זה בלבד עש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C ממומן על ידי מענקי משרד המדע והחדשנות הספרדי (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057), ומענקי MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P ממומן על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. ממומן על ידי אגודת מקס פלנק, פרס חוקר מתקדם מטעם המועצה האירופית למחקר (מענק 743216), DFG CRC 1080: מנגנונים מולקולריים ותאיים של הומאוסטזיס עצבי, ו- DFG CRC 902: עקרונות מולקולריים של ויסות מבוסס RNA. אנו מודים ל- D.C Dieterich ו- P. Landgraf על הייעוץ הטכני שלהם ועל הסינתזה של שעון הקיץ-אלקין. אנו מודים ל- E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast, ולמתקן החיות של MPI לחקר המוח על ת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% ג'ל אקרילאמידGenScriptSurePAGE, ביס-טריס, 10 x 8, 12%
β-מרקפטואתנולסיגמאM6250רעיל; השתמש בחלוק מעבדה, כפפות ומכסה אדים.
אמוניום ביקרבונטסיגמא9830רעיל; השתמש במעיל מעבדה, כפפות וקולט
ANLמסונתז כמתואר קודם לכן עבור AHA (ראה הפניות 5 ו-11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
ביוטין אלקיןתרמו,B10185
נוגדן עוף אנטי-GFPAves1020
מעכב פרוטאז מלא ללא EDTARoche4693132001Toxic; השתמש בחלוק מעבדה וכפפות.
נחושת (I) ברומידסיגמא25418599.999% (משקל/משקל)
תג דיסולפיד (DST)-אלקיןמסונתז כפי שדווח באסמכתא מספר 15, בו הוא מכונה בדיקה 20
DMSOSigma276855
מסנניםMerkSCGP00525
Iodo Acetamide (IAA)SigmaI1149
IR anti chicken 800LI-CORIRDye 800CWחמור נגד עוף נוגדן משני
IR נגד רביט 680LI-CORIRDye 680RDעז נגד ארנב IgG נוגדן משני מלטוז
סיגמאM9171
מיקסר ידניBioSpec מוצרים1083
NaClSigmaS9888
N-ethylmaleimideSigma4259רעיל; השתמש במעיל מעבדה, כפפות ומכסה אדים.
חרוזי NeutrAvidinפירס29200
קרום ניטרוצלולוזהBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8הכנה המתוארת במספר הפניה 5
PD SpinTrap G-25 עמודותGE HealthcareBuffer חילופי חיץ
פירס BCA ערכת בדיקת חלבוןתרמו,23225ריאגנטים בערכת בדיקת החלבון של פירס BCA רעילים לחיים במים.
ארנב פוליקלונלי אנטי ביוטין נוגדןאיתות תאים5597
PVDF ממברנהMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  מאגר ריצה MOPSGenScriptM00138
SYPRO כתם רוביסיגמאS4942
שולחן אוטומטי מערבולתאפנדורף Mixmate
טריאזול ליגנדסיגמא678937
טריטון X-100סיגמאT9284
מיםסיגמאW4502כיתה ביולוגיה מולקולרית
אדים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles