Method Article

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הומאוסטזיס של חלבונים in vivo היא המפתח לדעת כיצד התאים פועלים הן במצב פיזיולוגי והן במצב של מחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג in vivo וטיהור לאחר מכן של חלבונים מסונתזים חדשים באמצעות קו עכברים מהונדס כדי לכוון את תיוג החלבונים לאוכלוסיות תאיות ספציפיות. זהו קו אינדוקטיבי על ידי ביטוי Cre recombinase של L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*), המאפשר שילוב אזידונורלאוצין (ANL) לחלבונים, אשר אחרת לא יתרחש. באמצעות השיטה המתוארת כאן, ניתן לטהר פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo ולזהות שינויים עדינים בתכולת החלבון עקב הפחתת מורכבות הדגימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הומאוסטזיס של חלבון Aberrant נגרמת על ידי חוסר איזון בסינתזת חלבונים והשפלה. מספר מחלות קשורות לשינויים בהומאוסטזיס חלבונים. סימן ההיכר של מחלות מסוימות הוא נוכחות של אגרגטים במקומות תת-תאיים שונים ובאזורי מוח. הומאוסטזיס של חלבונים לא רק חשוב במחלות, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתפקוד תקין של איברים ותאים1. לדוגמה, סינתזת חלבונים נחוצה לצורות רבות של פלסטיות עצבית2,3, כפי שנקבע על ידי שימוש במעכבים כימיים החוסמים את סינתזת החלבון4. עם זאת, לא ברור באילו סוגי תאים הפרוטאום משתנה כדי לתמוך בלמידה ובזיכרון, וגם לא מובן אילו חלבונים ספציפיים בכל סוג תא מגבירים או יורדים בסינתזה או בהתפרקות שלהם. לפיכך, מחקר מקיף של הומאוסטזיס חלבונים דורש את היכולת להבדיל פרוטאומים המגיעים מסוגי תאים ספציפיים. ואכן, זיהוי פרוטאומים ספציפיים לסוג התא כדי לחקור תהליכים תאיים המתרחשים בסביבה רב-תאית היה מכשול חשוב בפרוטאומיקה. מסיבה זו, פיתחנו טכניקה המשתמשת בביטוי MetRS* בשילוב עם שיטות ביו-אורתוגונליות שהוכחה כדרך יעילה לזהות ולטהר פרוטאומים ספציפיים מסוג תא, ולמלא את הפער הזה 5,6,7.

הביטוי של MetRS* מוטנטי (MetRS L274G) מאפשר טעינה של ה-ANL האנלוגי הלא-קנוני מתיונין לתוך ה-tRNA 8,9 המתאים ושילובו לאחר מכן בחלבונים. כאשר ביטוי MetRS* מווסת על ידי מקדם ספציפי לסוג התא, חומצת האמינו הלא-קנונית תשולב בחלבונים באופן סלקטיבי של התא. ברגע ש-ANL משולב בחלבונים, הוא יכול לתפקד באופן סלקטיבי על ידי כימיה של קליקים ולאחר מכן על ידי הדמיה (FUNCAT) או על ידי Western Immunoblot (BONCAT). לחלופין, חלבונים יכולים להיות מטוהרים באופן סלקטיבי ומזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). באמצעות טכנולוגיה זו, יצרנו קו עכבר המבטא את החלבון MetRS* תחת שליטה של רקומבינאז Cre. בהתחשב במספר ההולך וגדל של קווי Cre-mouse הזמינים, ניתן להשתמש במערכת MetRS* בכל תחום כדי לחקור כל סוג תא מכל רקמה שעבורה קיים קו Cre. תיוג חלבונים עם ANL אפשרי במבחנה או in vivo, ואינו משנה את התנהגות העכבר או את שלמות החלבון6. ניתן להתאים את זמן התיוג לשאלה המדעית של כל חוקר, לתייג חלבונים מסונתזים חדשים (זמני תיוג קצרים יותר) או פרוטאומים שלמים (זמני תיוג ארוכים יותר). השימוש בטכניקה זו מוגבל על ידי מספר התאים מהסוג שהחוקר מוכן ללמוד; מכאן שבידוד חלבונים מסוגי תאים עם מספרים נמוכים או קצבי חילוף חומרים נמוכים אינו אפשרי בשיטה זו. מטרת השיטה המוצגת היא לזהות חלבונים/פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo. בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לתייג פרוטאומים ספציפיים לתאים עם ANL בעכברים חיים ולטהר את החלבונים המסומנים. לאחר הטיהור, ניתן לזהות חלבונים על ידי פרוטוקולים שגרתיים של ספקטרומטריית מסה 5,10. הפחתת מורכבות הדגימה המושגת בשיטה זו על ידי טיהור סלקטיבי של חלבונים מאוכלוסיות תאים ספציפיות מאפשרת לנסיין לזהות שינויים עדינים בפרוטאומים, למשל, בתגובה לשינויים סביבתיים. טיהור החלבונים המסומנים יכול להיות מושג תוך ~ 10 ימים, לא כולל ניתוח הטרשת הנפוצה או תקופת התיוג. במאמר זה נתאר שתי שיטות למתן ANL ל-MetRS* המבטאות עכברים, כלומר (1) הוספת חומצת האמינו במי השתייה, ו-(2) החדרת ANL באמצעות זריקות תוך-צפקיות. ללא קשר לשיטה שנבחרה לניהול NAL, שלבי הבידוד והטיהור זהים (משלב 2 ואילך).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור משרדי הממשלה המקומיים בגרמניה (RP Darmstadt; פרוטוקולים: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) או ספרד (הוועדה לניסויים בבעלי חיים ב- UCM וייעוץ סביבתי של Comunidad de Madrid, מספר פרוטוקול: PROEX 005.0/21) והם תואמים לכללי אגודת מקס פלנק ולתקנות הספרדיות ופועלים לפי הנחיות האיחוד האירופי לרווחת בעלי חיים.

1. תיוג מטבולי in vivo עם ANL

  1. שתייה:
    1. ממיסים ANL ומלטוז במי השתייה הרגילים של העכברים. ריכוז המלטוז המומלץ הוא 0.7% (wt/vol). הכמות המרבית של ANL שמוסיפים למי השתייה היא 1% (wt/vol). לאחר שהתערובת מוכנה, עקרו אותה על ידי סינון ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. ספק את התערובת שהוכנה בשלב 1.1 לעכברים. החליפו בקבוקים לעתים קרובות (למשל, כל 3 ימים) כדי למנוע זיהומים, ובדקו אותם מדי יום כדי לחפש זיהום או סתימה אפשריים. עקוב אחר כמות המים השיכורים מדי יום על ידי שקילתם, כדי לדעת את צריכת ה- ANL של העכברים.
      הערה: תקופת הסימון המקסימלית המוערכת כאן היא 3 שבועות באמצעות ריכוז ANL של 1% במי השתייה, מה שהביא לתיוג הניתן לזיהוי היטב במוח. תיוג טוב יכול להיות מושגת גם בתוך 2 שבועות. לא זמני תיוג קצרים יותר, לא נקודות זמן ארוכות יותר, ולא כמויות ANL אחרות נחקרו על ידינו באמצעות שיטת ניהול זו, אשר אינו אומר כי האמור לעיל לא יעבוד. שיעורי השילוב של ANL עשויים להשתנות בהתאם לרקמה הנחקרת או לסוג התא. זמן התיוג יכול להשתנות בהתאם לשאלה המדעית; לדוגמה, אם יש לסמן פרוטאומים, יש לחשב את זמן התיוג בפונקציה של זמן מחצית החיים הממוצע של החלבונים ברקמה הנחקרת. אם האינטרס הוא רק לזהות חלבונים מסונתזים חדשים, ניתן לקצר את הזמנים. תקופות התיוג ומינוני ה-ANL צריכים להיבדק אמפירית עבור כל מצב ניסיוני וסוג תא של עניין.
  2. ניהול תוך-צפקי:
    1. יש להמיס ANL בתמיסת NaCl פיזיולוגית ל-400 מ"מ, חיץ מלח פוספט (PBS) או מים.
    2. ודא כי האוסמולריות של התמיסה נמצאת בטווח הפיזיולוגי. כאן, 10 מ"ל / ק"ג משקל גוף של תמיסת ANL מנוהל לעכברים.
      הערה: תיוג טוב בנוירונים המעוררים של המוח מתקבל בהצלחה על ידי זריקה תוך-צפקית יומית אחת (IP) עם 400 mM ANL למשך שבוע אחד. לא ריכוזי ANL נמוכים יותר ולא תקופות תיוג אחרות על ידי זריקות IP נבדקו במחקר זה, מה שלא אומר שהם לא יעבדו. ANL מסופק כמו הידרוכלוריד על ידי כמה חברות. במקרה זה, יש להתאים את ה- pH של הפתרונות ל- pH המתאים (בהתאם למסלול הניהול). ANL יכול גם להיות מסונתז בעקבות השיטה שפורסמה על ידי Link et al.11 עם כמה שינויים5. ניתן לבצע תיוג ANL באמצעות ריכוזי ANL אחרים, לוחות זמנים ונתיבי ניהול. עבור רקמות/סוגי תאים עם קצב חילוף חומרים נמוך, ניתן להשתמש בדיאטת מתיונין בעלת תוכן נמוך, תמיד החל משבוע אחד לפני מתן ANL. כאשר 400 mM ANL משמש, זה יכול לזרז בזמן מאוחסן ב 4 °C (60 °F); חימום של עד 37 מעלות צלזיוס מחזיר את ANL לתמיסה. תנו לו להגיע לטמפרטורת החדר לפני ההזרקה. ברוב אזורי העולם, מתן ANL לעכברים הוא ניסוי בבעלי חיים וצריך להיות מאושר על ידי הרשויות הרלוונטיות.

2. קצירת רקמות, תזה ומיצוי חלבונים

  1. דיסקציה של רקמה: נתחו את אזור הרקמה המכיל את סוג התא המעניין ושימו לב למשקל של פיסת הרקמה שנאספה.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים (נקודת עצירה). בפרוטוקול הנוכחי נותחו קליפת המוח של העכברים וההיפוקמפוס.
  2. תזה של רקמות: הומוגניזציה של הרקמה בטמפרטורת החדר על ידי הוספת נפח של פי 12-15 מהמשקל הרטוב של הרקמה של מאגר הליזיס (PBS pH 7.4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), מעכב פרוטאז (PI) (EDTA חינם 1:4000)). לדוגמה, עבור חתיכת רקמה 20 מ"ג, להוסיף 240-300 μL של מאגר ליזה. Triturate את הרקמה עד שהוא הומוגני.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים (נקודת עצירה). עבור הומוגניזציה ישירה בצינורות 1.5 מ"ל, מומלץ להשתמש בהומוגנייזר כף יד, המופעל באמצעות סוללה, במיוחד כאשר מעובדים פיסות רקמה קטנות. עבור חתיכות גדולות יותר, ניתן להשתמש בהומוגנייזר של Dounce. לכל מאגר שבו כלולים מעכבי פרוטאז (PI), יש להוסיף אותם מיד לפני השימוש ולא קודם לכן.
  3. דנטורציה של חלבונים: מחממים את ההומוגנט ל-75°C למשך 15 דקות וצנטריפוגה ב-17,000 x g למשך 15 דקות ב-10°C. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור חדש.
  4. מדידת תכולת חלבון: מדוד את ריכוז החלבון של כל דגימה, והתאם את כל הדגימות כך שיושוו לאותו ריכוז חלבון; התאם את הריכוז על-ידי הוספת מאגר תזה. טווח ריכוז אופטימלי הוא בין 2-4 מיקרוגרם/μL.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים (נקודת עצירה).
  5. אלקילציה
    1. דלל את הדגימות ההומוגניות פי 2-3 ב- PBS (pH 7.8) + PI (EDTA חינם 1:4000).
    2. הוסף יודואצטמיד (IAA) לריכוז סופי של 20 mM (תמיסת מלאי 500 mM).
    3. השאירו את הדגימות למשך 1-2 שעות ב-20 מעלות צלזיוס בחושך. בצע את שלבים 2.5.2-2.5.3 פעמיים.
      הערה: עבור רקמות מסוימות, אם הקליק הלא ספציפי בבקרה השלילית נשאר גבוה, ייתכן שיהיה צורך לבצע שלב הפחתה לפני אלקילציה12. הכינו את מלאי רשות העתיקות טרי רגע לפני הוספתו לדוגמאות. דגימות ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים (נקודת עצירה).
  6. חילופי מאגרים: המרת עמודות חילופי מאגר שיווי משקל באמצעות מאגר חילופי הכימיה של הלחיצה (PBS pH 7.8, 0.04% (wt/vol) SDS, 0.08% (vol/vol) Triton X-100 ו- PI (1:4000)). בצע את הוראות היצרן. החלף את כל הדוגמאות האלקיליות.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות מוגבהות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים (נקודת עצירה). בשלב זה, רשות העתיקות מתבטלת, והמאגר מוחלף על ידי מאגר הכימיה של הלחיצה. ניתן למדוד חלבון שוב לאחר שלב החלפת המאגרים כדי לוודא שהחלבונים לא אבדו במהלך תהליך החלפת המאגר. בהתאם לסוג העמודות המשמשות להחלפת חיץ, חלבון יכול ללכת לאיבוד באופן מסיבי. השתמש בעמודות המומלצות כדי למנוע אובדן חלבון. עבור אחסון מדגם, מומלץ להכין aliquots.
  7. לחץ על התגובה כדי להעריך את שילוב ANL בניסוי
    1. קח 40 μL של דגימות eluted בשלב 2.6 והוסף PBS (pH 7.8) לנפח סופי של 120 μL.
    2. כדי להגדיר את תגובת הכימיה של הלחיצה, הוסף את הריאגנטים הבאים בסדר הנתון ובמערבולת במשך 20 שניות לאחר כל תוספת: 1.5 μL של ליגנד טריאזול (מלאי 40 mM), 1.5 μL של ביוטין אלקין (מלאי 5 mM) ו-1 μL של Cu(I) ברומיד (מלאי 10 מ"ג/מ"ל, מומס ב-DMSO על ידי צנרת זהירה למעלה ולמטה, אל תערבבו). הוסף את הריאגנטים מהר ככל האפשר.
    3. דגירה של הדגימות למשך הלילה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף.
    4. צנטריפוגה את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ב 17,000 x גרם. כדור מעט טורקיז יהיה גלוי. מעבירים את הסופר-נטנט לצינור חדש.
      הערה: יש להכין ציר ברומיד של Cu (I) מיד לפני השימוש כדי למנוע חמצון נחושת. שמירה על יחס נפחים בין הדגימה המוזנחת לבין PBS קבוע בין דגימות היא חיונית כדי להבטיח את אותו ריכוז דטרגנט סופי בכל צינור. כדי להאיץ את ההרכבה של תגובת הכימיה של הלחיצה, מומלץ מערבולת שולחן עם מדפים לצינורות. אחסן את הדגימות שנלחצו ב- -80 °C למשך מספר חודשים, או ב- -20 °C למשך מספר שבועות עד לעיבוד נוסף (נקודת עצירה).
  8. ניתוח כתמים מערביים להערכת שילוב ANL בניסוי
    1. הפעל SDS-PAGE עם 20-40 μL של הסופרנטנט מתגובת הכימיה של הלחיצה (שלב 2.7). יש להשתמש ב-12% ג'לים לאקרילאמיד, להפעיל ב-1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM גליצין. רוצו עד שהחזית יוצאת מהג'ל.
    2. מעבירים את החלבונים לממברנת ניטרוצלולוז או PVDF13.
    3. דגירה של הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן GFP (1:500, חלבון GFP מתורגם במשותף עם MetRS*5), ונוגדן ביוטין (1:1000) לזיהוי אלקין בלחיצה, אשר מצומד לביוטין.
    4. יש לשטוף את הנוגדן הראשוני פעמיים למשך 10 דקות ולהוסיף את הנוגדן המשני למשך שעה וחצי.
    5. יש לשטוף את הנוגדן המשני פעמיים למשך 10 דקות ולסרוק (אם משתמשים בנוגדנים מצומדים לפלואורופור) או לחשוף לסרטים (אם משתמשים בנוגדנים מצומדים של פרוקסידאז חזרת).
    6. לכמת את אות הביוטין באמצעות ImageJ או תוכנה דומה, להעריך את התיוג הכללי של כל דגימה של הניסוי, ולזהות חריגות אפשריות. להעריך את יחס האות לרעש (תיוג דגימת ANL לרקע מהבקרות השליליות) של הניסוי ולזהות בעלי חיים אפשריים שלא הצליחו לקלוט/לשלב ANL.
      הערה: עבור דגימות עם שילוב ANL גבוה, טיהור חלבונים אפשרי באופן תיאורטי באמצעות אלקינים שאינם ניתנים לביקוע כמו זה המשמש בסעיף זה להערכת שילוב ANL. באמצעות דגימות מוח, הרקע המתקבל בבקרות השליליות על ידי טרשת נפוצה לאחר טיהור חלבונים באמצעות אלקינים שאינם ניתנים לביקוע הוא גבוה מדי14. לכן, רק האלקינים הקלים יותר לטיפול, שאינם ניתנים לביקוע, שימשו לדגימה כללית ראשונה ולהערכת ניסוי. ללא קשר לסוג האלקין המיועד לטיהור חלבון, מומלץ לבצע את השלבים לאופטימיזציה של מינון אלקין המתוארים בסעיף הבא (שלב 2.9).
  9. תגובת קליק לאופטימיזציה של מינון אלקין הניתן למחשוף
    1. הכן ארבע שפופרות עם 40 μL של מדגם מייצג אחד (המתקבל בשלב 2.6 ומוערך בשלב 2.8) והוסף PBS (pH 7.8) לנפח סופי של 120 μL.
    2. הגדר את תגובת הכימיה של הלחיצה כפי שמוסבר בשלב 2.7 אך הפעם, הוסף ארבע כמויות שונות של DST-alkyne. עבור אלקיין האמור, מומלץ לבדוק 5 μM, 15 μM, 30 μM ו- 60 μM.
    3. חזור על שלב 2.8 כדי להחליט מהו מינון האלקין המתאים ביותר לשאלה הניסויית הספציפית הנחקרת, בהתבסס על יעילות הסימון הגבוהה ביותר עם אות הרקע הנמוך ביותר.
      הערה: לפני חשיפת הדגימות הנותרות לתגובת קליק, יש לקבוע את הכמות האופטימלית של כל אלקין. ישנן מספר אפשרויות של אלקינים זמינים מסחרית שניתן להשתמש בהם. הם נבדלים זה מזה בדרך של מחשוף (למשל, אור או חומרים מחזרים). כימיה של קליקים ללא נחושת באמצעות ריאגנטים המקודמים על ידי זן (למשל, ריאגנטים DBCO) אפשרית גם כן. שינויים זעירים בכמות הריאגנטים של אלקינים או DBCO מגדילים לעתים קרובות את האות בבקרה השלילית (רקע) באופן משמעותי. כאן מתואר טיהור החלבון באמצעות אלקין עם גשר דיסולפיד הניתן לביקוע על ידי חומרים מחזרים (דיסולפיד ביוטין אלקיין או DST-אלקין15). בעת שימוש ב- DST-alkyne, להפעלת ה- SDS-PAGE (שלב 8.1), הימנע מטעינת מאגרים עם חומרי חיזוי חזקים כגון DTT או β-Mercaptoethanol כדי למנוע ביקוע אלקין. במחקר זה, חימום ב-72 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות, באמצעות 5 mM של N-ethylmaleimide (NEM) במאגר הטעינה אינו משפיע על יציבות שעון הקיץ-אלקיין. שלב 2.9.2 יכול לחזור על עצמו, לבדוק מינונים עדינים יותר בטווח של הטוב ביותר שנצפה.
  10. תגובת קליק מכינה לטיהור חלבונים
    1. לחץ על כל הדגימות שהתקבלו בשלב 2.6 עם מינון האלקין האופטימלי שנקבע בשלב 2.9 ונתח שבר על ידי SDS-PAGE וכתם מערבי (שלב 2.8).
      הערה: ודא שהפיפטות מכוילות כראוי כדי להבטיח דיוק של שדרוג הדגימה. דגימות שנלחצו ניתן לאחסן ב -80 °C במשך מספר חודשים (נקודת עצירה).

3. טיהור חלבון

  1. החלפת מאגרים
    1. הכפיף את כל הדגימות שנלחצו להליך חילופי מאגרים כמתואר בשלב 2.6, אך השתמש במאגר איגוד Neutravidin כמאגר שיווי משקל (PBS pH 7.4, 0.15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 ו- PI (1:2000)).
      הערה: ניתן לאחסן דגימות מוגבהות בטמפרטורה של -80°C למשך מספר חודשים (נקודת עצירה). בשלב זה, אלקין חינם ללא לחיצה הוא בוטל, ואת המאגר מוחלף על ידי מאגר מחייב Neutravidin.
  2. כריכה לחרוזי נויטרווידין
    1. לשטוף את החרוזים בעלי הקיבולת הגבוהה של Neutravidin עם מאגר הקשירה של Neutravidin (ראה שלב 3.1); מערבבים את החרוזים עם החיץ ומפעילים צנטריפוגה במשך 5 דקות ב-3000 x גרם, ומשליכים את הסופרנט. חזרו על הפעולה שלוש פעמים.
    2. הכינו 1:1 של חרוזי נויטרווידין על ידי הוספת אותו נפח של חרוזים יבשים ומאגר קשירה של נויטרווידין.
    3. מניחים בצד 20-40 μL מכל דגימה כמו ליזאט מטוהר מראש ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
    4. מדדו את ריכוז החלבון (ראו שלב 2.4), וערבבו 100 מיקרוגרם חלבון עם 4 מיקרון של חרוזי החרוזים שהתקבלו בשלב 3.2.2.
    5. דגירה של התערובת למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף, המאפשרת לחלבונים המסומנים להיקשר לחרוזים.
      הערה: באשר לתגובת הכימיה של הלחיצה, ניתן לשדרג את תגובת טיהור הזיקה הבסיסית המתוארת בשלב 3.2.4. לדוגמה, עבור טיהור של חלבונים מן הנוירונים המעוררים של ההיפוקמפוס, 1 מ"ג של חלבון ליזאט מעורבב עם 40 μL של חרוזי Neutravidin (1:1 slurry). ניתן להגדיל או להקטין את כמות חרוזי Neutravidin בהתאם לכמות החלבונים המסומנים למ"ג של סך החלבון, אשר תהיה תלויה בסוג התא הנבחר ובתקופת הסימון ויש לקבוע אותה באופן אמפירי.
  3. חרוזי נויטרווידין שוטפים וחלבון
    1. אסוף את הסופרנאטנטים על ידי צנטריפוגה (ראה שלב 3.2.1). מניחים 20-40 μl aliquot של כל supernatant בצד לניתוח מאוחר יותר ולהקפיא את השאר ב -80 מעלות צלזיוס.
    2. שטפו את החרוזים עם מאגר כביסה צונן Neutravidin 1 (PBS pH 7.4, 0.2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 ו-PI (1:2000)) על ידי הוספת המאגר, שקיעת החרוזים והשלכת הסופר-נטנט. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    3. לאחר מכן, הוסיפו את אותו חיץ ודגרו את החרוזים במשך 10 דקות תחת סיבוב רציף ב-4 מעלות צלזיוס לפני השלכת הסופר-נטנט. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    4. שטפו את החרוזים כפי שמוסבר בשלבים 3.3.2-3.3.3 אך השתמשו במאגר הכביסה של Neutravidin 2 (1x PBS, pH 7.4 ו-PI 1:2000).
    5. לשטוף את החרוזים כפי שהוסבר בשלב 3.3.2-3.3.3 אבל באמצעות חיץ כביסה Neutravidin 3 (50 mM אמוניום ביקרבונט ו PI 1:2000).
    6. אלוקים את החלבונים שנלחצו על ידי דגירה של החרוזים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עם נפח של מאגר אלוטיון Neutravidin (5% (vol/vol) β-mercaptoethanol ו-0.03% (wt/vol) SDS) המתאים לנפח אחד של החרוזים היבשים שבהם נעשה שימוש.
    7. שמרו על החרוזים במתלים במהלך התסיסה המתמשכת (1000 סל"ד) בשייקר תרמובלוק. אלוטה פעמיים ומשלבת את שני האלואטים.
      הערה: הצנטריפוגה המוגדרת להפרדת החלק המוצק של הסלורי (חרוזים) והפאזה המימית (סופרנטנט), כפי שמוסבר בשלב 3.2.1, חלה על שלבים 3.3.1-3.3.7. ניתן להגדיל את כמות ה-SDS אם החלבון לא הושלם. עם זאת, עם כמויות מעל 0.08%-0.1% של SDS, חלבונים שאינם קשורים באופן ספציפי לחרוזים מתחילים להיות eluted. β-מרקפטואתנול הוא נדיף ורעיל; מומלץ להשתמש במכסה המנוע לשלבים 3.3.6-3.3.7. הדגימות שנאספו בשלבים 3.2.3 ו- 3.3.1 צריכות להיות מופעלות על ידי SDS-PAGE ולהעריך אותן על ידי כתם מערבי (ראה שלב 2.8) להערכת היעילות של טיהור הזיקה (שלב 3.3).
  4. הערכה של חלבונים אלוטים
    1. טען 1/3 מהדגימות המועלות ל- SDS-PAGE (ראה שלב 2.8.1).
    2. הכתימו את הג'ל כדי לדמיין חלבונים בשיטה בעלת רגישות גבוהה, כגון צביעת כסף או שיטה פלואורסצנטית.
    3. אם לדגימות יש את האיכות הצפויה, כלומר יש פי 3-4 יותר חלבון בדגימות המסומנות ב-ANL בהשוואה לבקרה השלילית, ניתן לזהות את החלבונים האלוטים על ידי שיטות ספקטרומטריית מסות שגרתיות כמו זו שהוסברה בהתייחסות5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול המתואר (המסוכם באיור 1), ANL ניתן לעכברים על ידי זריקות תוך-צפקיות יומיות (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) במשך 7 ימים, או באמצעות מי שתייה (0.7% מלטוז, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) במשך 21 יום. לאחר התיוג, אזורי המוח המתאימים נותחו, שכבו, הושאלו ונלחצו. תגובות הקליק נותחו על ידי SDS-PAGE ו-Western Immunoblot. תמונות מייצגות של הניסויים מוצגות באיור 2 עבור ניהול ANL באמצעות הזרקת IP ובאיור 3 עבור מתן ANL באמצע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול הם; הכללת בקרות שליליות, שיש מספיק שכפולים ביולוגיים, מסלול ניהול ANL, כמות ומשך, אלקילציה של הדגימות, ריכוז אלקין, וחיסול β-מרקפטואתנול בעת שימוש ב- DST-alkyne.

המפתח הוא לכלול דגימות בקרה שליליות הנובעות מבעלי חיים המסומנים ב-ANL ללא נהג Cre ולכן ללא ביטוי MetRS*. דגימות אלה חייבות להיות כפופות לכל שלב המתואר בפרוטוקול במקביל לדגימות מעכברי MetRS* המושרים על-ידי CRL עם תווית CLE. דוגמאות שלא נלחצו אינן פקדים חוקיים, מכיוון שכל תוצאה שהושגה באמצעות פקד זה בלבד עש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C ממומן על ידי מענקי משרד המדע והחדשנות הספרדי (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057), ומענקי MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P ממומן על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. ממומן על ידי אגודת מקס פלנק, פרס חוקר מתקדם מטעם המועצה האירופית למחקר (מענק 743216), DFG CRC 1080: מנגנונים מולקולריים ותאיים של הומאוסטזיס עצבי, ו- DFG CRC 902: עקרונות מולקולריים של ויסות מבוסס RNA. אנו מודים ל- D.C Dieterich ו- P. Landgraf על הייעוץ הטכני שלהם ועל הסינתזה של שעון הקיץ-אלקין. אנו מודים ל- E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast, ולמתקן החיות של MPI לחקר המוח על תמיכתם המצוינת. אנו מודים לסנדרה גבלס על שיתוף קו העכבר Nex-Cre. אנו מודים לאנטוניו ג 'קרוג'יו על עזרתו בעריכה באנגלית. B.A-C. תכננו, ערכו ונותחו ניסויים. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., ו- S. t. ד. ערך וניתח ניסויים. B.A-C ו-E.M.S. תכננו ניסויים, ופיקחו על הפרויקט, B.A-C כתבו את המאמר. כל המחברים ערכו את המאמר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% ג'ל אקרילאמידGenScriptSurePAGE, ביס-טריס, 10 x 8, 12%
β-מרקפטואתנולסיגמאM6250רעיל; השתמש בחלוק מעבדה, כפפות ומכסה אדים.
אמוניום ביקרבונטסיגמא9830רעיל; השתמש במעיל מעבדה, כפפות וקולט
ANLמסונתז כמתואר קודם לכן עבור AHA (ראה הפניות 5 ו-11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
ביוטין אלקיןתרמו,B10185
נוגדן עוף אנטי-GFPAves1020
מעכב פרוטאז מלא ללא EDTARoche4693132001Toxic; השתמש בחלוק מעבדה וכפפות.
נחושת (I) ברומידסיגמא25418599.999% (משקל/משקל)
תג דיסולפיד (DST)-אלקיןמסונתז כפי שדווח באסמכתא מספר 15, בו הוא מכונה בדיקה 20
DMSOSigma276855
מסנניםMerkSCGP00525
Iodo Acetamide (IAA)SigmaI1149
IR anti chicken 800LI-CORIRDye 800CWחמור נגד עוף נוגדן משני
IR נגד רביט 680LI-CORIRDye 680RDעז נגד ארנב IgG נוגדן משני מלטוז
סיגמאM9171
מיקסר ידניBioSpec מוצרים1083
NaClSigmaS9888
N-ethylmaleimideSigma4259רעיל; השתמש במעיל מעבדה, כפפות ומכסה אדים.
חרוזי NeutrAvidinפירס29200
קרום ניטרוצלולוזהBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8הכנה המתוארת במספר הפניה 5
PD SpinTrap G-25 עמודותGE HealthcareBuffer חילופי חיץ
פירס BCA ערכת בדיקת חלבוןתרמו,23225ריאגנטים בערכת בדיקת החלבון של פירס BCA רעילים לחיים במים.
ארנב פוליקלונלי אנטי ביוטין נוגדןאיתות תאים5597
PVDF ממברנהMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  מאגר ריצה MOPSGenScriptM00138
SYPRO כתם רוביסיגמאS4942
שולחן אוטומטי מערבולתאפנדורף Mixmate
טריאזול ליגנדסיגמא678937
טריטון X-100סיגמאT9284
מיםסיגמאW4502כיתה ביולוגיה מולקולרית
אדים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
  3. Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939(2020).
  4. Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
  5. Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
  6. Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
  7. Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
  8. Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
  9. Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
  10. Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
  11. Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
  12. Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
  13. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  14. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  15. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
  16. Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
  17. van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
  18. O'Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).
  19. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  20. Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
  21. tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
  22. McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
  23. Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377(2016).
  24. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
  25. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  26. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles