MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ"א ו/או דנ"א.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF
במאמר זה
סיכום
תקציר
רנ"א הוא ביופולימר הנמצא בכל תחומי החיים, והאינטראקציות שלו עם מולקולות אחרות ו/או מינים תגובתיים אחרים, למשל דנ"א, חלבונים, יונים, תרופות ורדיקלים חופשיים, נמצאות בכל מקום. כתוצאה מכך, הרנ"א עובר תגובות שונות הכוללות את הבקיעה, ההתפרקות או השינוי שלו, מה שמוביל למינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם פונקציות והשלכות שונות. דוגמה אחת היא חמצון של גואנין ל-7,8-דיהידרו-8-אוקסוגואנין (8-oxoG), שעשוי להתרחש בנוכחות מיני חמצן תגובתי (ROS). באופן כללי, נהלים המאפיינים מוצרים ותמורות כאלה הם בעלי ערך רב לקהילה המדעית. לשם כך, ספקטרומטריית מסה של יינון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF) היא שיטה נפוצה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לאפיין שברי RNA שנוצרו לאחר טיפול אנזימטי. המודל שנבחר משתמש בתגובה בין RNA לבין exoribonuclease Xrn-1, שבו העיכול האנזימטי נעצר באתרים מחומצנים. שני רצפי RNA באורך 20 נוקלאוטידים [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה, כומתו על ידי ספקטרוסקופיית UV-vis, ואופיינו באמצעות MALDI-TOF. הגדילים שהתקבלו היו אז (1) 5'-זרחן ואופיינו באמצעות MALDI-TOF; (2) מטופל ב-Xrn-1; (3) מסונן ומתופל; (4) נותח באמצעות MALDI-TOF. מערך ניסוי זה הוביל לזיהוי חד משמעי של השברים הקשורים לעיכוב של Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. הניסויים המתוארים בוצעו עם 200 פיקומולים של RNA (20 pmol המשמשים לניתוחי MALDI); עם זאת, כמויות נמוכות יותר עשויות לגרום לשיאים הניתנים לזיהוי עם ספקטרומטרים המשתמשים במקורות לייזר עם יותר כוח מזה המשמש בעבודה זו. חשוב לציין כי ניתן להכליל את המתודולוגיה המתוארת ולהרחיב אותה באופן פוטנציאלי לזיהוי מוצרים עבור תהליכים אחרים המערבים רנ"א ודנ"א, ועשויה לסייע באפיון/הבהרה של מסלולים ביוכימיים אחרים.
מבוא
MALDI-TOF 1,2,3 היא טכניקה נפוצה לאפיון ו/או זיהוי של מולקולות בגדלים ומאפיינים שונים. חלק מהשימושים בו כוללים יישומים מגוונים כגון איתור טאנינים ממשאבי טבע4, מטבוליטים של הדמיה במזון5, גילוי או ניטור של מטרות או סמנים של תרופות תאיות6, ואבחון קליני7, אם להזכיר כמה. הרלוונטיות לעבודה הנוכחית היא השימוש ב-MALDI-TOF עם DNA או RNA, כאשר השימוש בו על אוליגונוקלאוטידים מתוארך ליותר משלושה עשורים8, שם צוינו מספר מגבלות. טכניקה זו התפתחה כעת לאמצעי אמין ונפוץ לאפיו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מים טהורים במיוחד ללא RNase (טבלה 1) שימשו למחקר הנוכחי.
1. קביעת ריכוז של תמיסת RNA
- הכן את דגימת ה- RNA בהתאם לשלבים הבאים.
- השתמש בצינור microcentrifuge (0.6 מ"ל) כדי להכין תמיסה של RNA על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי (המתקבלת באמצעות סינתזה בפאזה מוצקה)19 לתוך 159 μL של H2O ללא RNase. ערבב את התמיסה על ידי צנרת התערובת למעלה ולמטה שוב ושוב (10x).
הערה: מכיוון שמגוון רחב של cuvettes זמינים באופן מסחרי, הכרכים הדרושים עשויים להיות שונים. בעבודה זו נעשה שימוש בקובטות עם אורך נתיב של 1 ס"מ ונפח מופחת (150 μL). - יש לשטוף את ה-UV-vis cuv....
- השתמש בצינור microcentrifuge (0.6 מ"ל) כדי להכין תמיסה של RNA על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי (המתקבלת באמצעות סינתזה בפאזה מוצקה)19 לתוך 159 μL של H2O ללא RNase. ערבב את התמיסה על ידי צנרת התערובת למעלה ולמטה שוב ושוב (10x).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האוליגונוקלאוטידים ששימשו בעבודה זו סונתזו, אופיינו וכימתו לפני השימוש. הריכוז של כל האוליגונוקלאוטידים נקבע באמצעות ספקטרוסקופיה UV-vis שנרשמה ב-90 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות שגויות הנובעות מההיווצרות הפוטנציאלית של המבנים המשניים. איור 3 מציג את הספקטרום של המודל אוליגונוקלאוטידים של רנ"א המשמשים בעבודה זו, שצולמו בטמפרטורת החדר ולאחר הפעלת חום.
ההליך הכולל, יחד עם המבנה של הנגע החמצוני שגורם לעיכוב Xrn-1, מודגם באיור 4........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
האתגר העיקרי בתהליך עבודה זה התעורר בין השלמת הניסויים לבין ביצוע הניתוחים הספקטרומטריים של המסות. הניסויים בוצעו והושלמו באוניברסיטת קולורדו דנבר ונשלחו (בן לילה) למתקני אוניברסיטת המדינה של קולורדו. איסוף הנתונים בוצע עם קבלתו, לפי הנוחות. מספר נסיבות בלתי צפויות הובילו לעיכובים בזמן בתהליך. במקרה אחד, תקלות בלתי צפויות במכשירים דרשו את הקפאת הדגימות (חד פעמית למשך 21 יום) לפני איתור ורכישה; עם זאת, נראה כי העיכוב הפעם לא השפיע על תוצאת הניסוי, אם כי לא ניתן לשלול השפלה של הרנ"א (מה שהוביל לירידה בעוצמות האות).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
חשוב לציין שעבודה זו הייתה מאמץ משותף בין שלושה מוסדות, שתי קבוצות מחקר ומתקן ליבה אחד. ההפצה ועומס העבודה בוצעו כדלקמן: ביטוי חלבון (Xrn-1) בוצע באוניברסיטת דנבר (דנבר, קולורדו). סינתזה, כימות וניסויים של אוליגונוקלאוטידים (בעיקר השפלה אנזימטית) נערכו באוניברסיטת קולורדו דנבר (דנבר, קולורדו). כמו כן בוצע שם אופטימיזציה. איתור, רכישה וניתוח של MALDI-TOF בוצעו במתקן הליבה של המשאבים האנליטיים באוניברסיטת המדינה של קולורדו. (פורט קולינס, קולורדו). SS רוצה להודות על פרס UROP (CU דנבר) ומענקי Eureca (CU דנבר) לתמיכה. E. G.C. מכיר בתמיכה של NIGMS, באמצעות R00GM115757. MJER מאשרת תמיכה מ- NIGMS, באמצעות 1R15GM132816. K.B. מכיר במזהה משאב: SCR_021758. העבוד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.6 מ"ל MCT בוגר ויולט | פישר סיינטיפיק | 05-408-127 | |
| 6'-טריהידרוקסיאצטופנון מונוהידראט 98% | סיגמא אולדריץ' | 480-66-0 | |
| אצטוניטריל 99.9%, HPLC כיתה | פישר סיינטיפיק | 75-05-8 | |
| אדנוזין טריפוספט, 10 מ"מ | New Englang Bioscience | P0756S | |
| אמוניום ציטראט, דו-בסיסי 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| אמוניום פלואוריד 98.0%, ACS כיתה | אלפא Aesar | 12125-01-8 | |
| תקן בדיקת חיידקים Bruker | Daltonics | 8255343 | |
| מקור מסחרי של Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| דיאתיל פירוקרבונט, 97% | ניתוח ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex תוכנה | Bruker daltonics | FlexAnalysis תוכנה גרסה 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 ספקטרופוטומטר UV-vis | Perkin Elmer | ||
| צלחת MALDI: MSP 96 יעד פלדה טחונה | Bruker Daltonics | 280799 | |
| ספקטרומטר מסה | Bruker | Microflex LRFTOF ספקטרומטר מסה (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | מערכת Milipore Sigma | A Mili-Q שימשה לטיהור כל המים המשמשים בעבודה זו | |
| התקנים צנטריפוגליים Nanosep עם ממברנת OmegaTM 10 K, כחול (24 / חבילה) | Pall Corporation | OD010C33 | אמצעי סינון, אומגה (פוליאתרסולפון שונה) 10 K גודל נקבוביות |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | זהו פתרון B |
| כלי מנתח אוליגו | IDT-DNA | ||
| https://www.idtdna.com/calc/analyzer טיפים לפיפטה P10 | פישר סיינטיפיק | 02-707-441 | |
| טיפים לפיפטה P200 | פישר סיינטיפיק | 02-707-419 | |
| RNase Away | מוצרים ביולוגיים מולקולריים | 7005-11 | |
| T4 פולינוקלאוטיד קינאז | ניו אינגלנד BioLabs | M0201S | |
| T4 מאגר תגובה פולינוקלאוטיד קינאז | חדש England BioLabs | B0201S | זוהי תמיסה A |
| חומצה טריפלואורואצטית | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | המתבטא בבית | ראה ref. 20 | |
| טיפים לפיפטה ZipTip להכנת דגימה | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µ קצות פיפטה L טעונים בתקן C18 0.6 ומיקרו; מיטה L |
מקורות
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
