מאמר שיטה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63733

⸱

6 באפריל 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

במאמר זה

סיכום

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

תקציר

הדמיה תוך-ורידית של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל מציעה תובנות חשובות על מחלות בתיווך מערכת החיסון בבעלי חיים. המחקר של פגיעה חריפה בריאות (ALI)/תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופתולוגיות נשימתיות אחרות in vivo הוא קשה בשל הנגישות המוגבלת וממצאי התנועה המובנים של הריאות. עם זאת, פותחו גישות שונות כדי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל בזמן אמת במיקרו-סירקולציה ריאתית במודל ניסיוני של ALI. מערכת הדמיית ריאות in vivo ופלטפורמת מיקרוסקופיה תוך-ורידית מודפסת בתלת-ממד משמשות לאבטחת העכבר המרדים ולייצב את הריאה תוך מזעור פגיעה מבלבלת של הריאות. לאחר ההכנה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב משמשת לחקר הידבקות לויקוציטים, גלגול לויקוציטים ותפקוד נימי. בעוד שהפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בהדמיה במודל אקוטי של מחלת ריאות דלקתית, הוא עשוי להיות מותאם גם לחקר תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים אחרים בריאה.

מבוא

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) היא כלי הדמיה שימושי להדמיה וחקר של תהליכים ביופיזיים שונים in vivo. הריאה מאתגרת מאוד לצילום in vivo בשל מיקומה הסגור, האופי השברירי של הרקמה שלה וממצאי תנועה המושרים על ידי נשימה ודופק 1,2. תצורות מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) שונות פותחו להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-סירקולציה ריאתית כדי להתגבר על אתגרים אלה. גישות כאלה מבוססות על חשיפה כירורגית וייצוב של הריאה לצורך הדמיה.

בעלי חיים מוכנים בדרך כלל להפריה חוץ גופית של הריאות בהליכים כירורגיים. ראשית, בעלי חיים הם intubated ומאוורר, אשר מאפשר כריתה כירורגית של חלון בית החזה והתערבויות לאחר מכן כדי לייצב את הריאה להדמיה. טכניקה אחת כוללת הדבקת הפרנצ'ימה על כיסוי זכוכית3, הליך המסתכן בטראומה פיזית משמעותית לרקמה המצולמת. מתקדם יותר הוא השימוש במערכת ואקום לייצוב הריאה מתחת לחלון זכוכית4. מערך זה מאפשר היצמדות רופפת של פני הריאה לכיסוי באמצעות ואקום הפיך המתפשט על פני שטח מקומי גדול ומרחיב את הריאה תוך הגבלת התנועה בממדים x, y ו-z4. הוואקום מוחל באופן שווה דרך תעלה המקיפה את אזור ההדמיה של המערך ומושך את הרקמה לאזור חרוטי רדוד הפונה לכיסוי ברמת הדמיה4. דרך חלון צפייה זה, ניתן לחקור את המיקרו-סירקולציה של הריאות באמצעות שיטות הדמיה אופטיות שונות.

Lung IVM מאפשר הדמיה כמותית של מספר רב של פרמטרים מיקרו-מעגליים. אלה כוללים מדידות כגון מהירות ואורך מסלול לויקוציטים5, מהירות זרימת תאי דם אדומים6 וחמצון7, גרורות גידול8, הבחנה בין תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון 9,10,11, הדמיה של מיקרו-חלקיקים12, דינמיקה של נאדיות13,14, חדירות כלי דם15 ותפקוד נימי16 . ההתמקדות כאן היא בגיוס לויקוציטים ותפקוד נימי. התחלת גיוס לויקוציטים במיקרו-סירקולציה ריאתית כוללת אינטראקציות גלגול חולפות ואינטראקציות דבקות מוצקות בין לויקוציטים לתאי אנדותל, שניהם מוגברים בתנאים דלקתיים16,17. בדרך כלל, גלגול הוא כימות על ידי מספר לויקוציטים העוברים קו ייחוס המוגדר על ידי מפעיל, בעוד הידבקות מכמתת על ידי מספר לויקוציטים שאינם תנועה על האנדותל16. תפקוד נימי עשוי להיות מושפע גם במצבים דלקתיים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך ירידה בזלוף. ניתן לייחס זאת למספר גורמים, כולל הפחתה של עיוות תאי דם אדומים18 וביטוי מגוון של NO synthase inducible על ידי תאי אנדותל וכתוצאה מכך shunting פתולוגי19. בדרך כלל, האורך המצטבר של נימים מחוררים לכל אזור נמדד ומדווח כצפיפות נימי תפקודית (FCD).

חקר גיוס לויקוציטים בריאות בזמן אמת דורש תיוג מטרות ביולוגיות בצבעים פלואורסצנטיים או בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית20. לחלופין, ניתן להשתמש בזני עכברים מהונדסים שונים כגון lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) עכברים כדי לצלם תת-קבוצות ספציפיות של תאי מערכת החיסון כגון נויטרופילים21,22. לאחר מכן ניתן לדמיין את הלויקוציטים בעלי התווית הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב, מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית מולטיפוטונים. טכניקות אלה משיגות ניגודיות על ידי שימוש באורכי גל ספציפיים של עירור וגילוי פלואורסצנציה הנפלטת תוך חסימת זיהוי אורך הגל של העירור, ובכך מדגישות את האובייקט המסומן.

מחקרים קיימים הנוגעים לכימות גלגול לויקוציטים, הידבקות וצפיפות נימים תפקודית בריאת מורין הסתמכו בעיקר על ניתוח וידאו ידני. זה מתאפשר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגוןFiji 6,23, תוכנה קניינית כגון CapImage12, או מערכות עיבוד תמונה מותאמות אישית24. לעומת זאת, פלטפורמות תוכנה קנייניות שונות (למשל, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) מאפשרות מדידה אוטומטית של מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כולל רבים מאלה שהוזכרו כאן קודם לכן 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

נעשו תצפיות חשובות לגבי הפתולוגיה של פגיעה חריפה בריאה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות IVM ריאה. ARDS מאופיין בשורה של תהליכים פתופיזיולוגיים בריאה, כולל בצקת ריאות ונזק נאדי הנגרם על ידי תפקוד לקוי של מחסום האנדותל והאפיתל25. באמצעות מודל מורין, נמצא כי ALI המושרה על ידי אלח דם קשור לשינויים מזיקים משמעותיים בסחר בתאי מערכת החיסון בסביבת הריאות26. נויטרופילים שגויסו לנימים של עכברים עם ALI המושרה על ידי אלח דם נמצאו כמעכבים מיקרו-סירקולציה, ובכך מגבירים את ההיפוקסיה ב-ALI26. בנוסף, IVM שימש כדי לקבל תובנות לגבי המנגנון הבסיסי של תיקון לאחר הופעת ARDS27. Lung IVM היה גם כלי רב ערך בהבנת שינויים פתופיזיולוגיים במחלות ריאה חסימתיות שונות. לדוגמה, הדמיה של הובלת ריר במחלות כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) אפשרה את המחקר של טיפולים חדשניים וקיימים לפינוי ריריות28. סחר בלוקוציטים בתנאים אלה נותח גםכן 17.

פרוטוקול זה מרחיב את הגישה שתוארה לראשונה על ידי Lamm et al.29 לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. הפרוצדורות המתוארות משתמשות במערכת הדמיית ריאות in vivo, הכוללת בסיס מתכת בגודל 16.5 ס"מ על 12.7 ס"מ, מיקרומניפולטור וחלון הדמיית ואקום (איור 1). המערכת מותקנת על פלטפורמה מודפסת תלת-ממדית בגודל 20 ס"מ על 23.5 ס"מ (קובץ משלים 1) כדי לספק חיבור מאובטח לצינורות האוורור ולמשטח החימום. שיטה זו מציעה הדמיה ניתנת לשחזור ולכימות של מיקרו-סירקולציה ריאתית של מורין in vivo. היבטים חשובים של ההכנה הכירורגית, כמו גם ניצול נכון של מערכת הדמיית ריאות מיוצבת ואקום מוסברים בפירוט. לבסוף, מודל ניסיוני של ALI משמש כדי לספק הדמיה ייצוגית וניתוח של גלגול לויקוציטים שהשתנה, הידבקות לויקוציטים וזלוף נימי הקשור לדלקת. השימוש בפרוטוקול זה אמור להקל על חקירות חשובות נוספות של שינויים פתופיזיולוגיים במיקרו-סירקולציה ריאתית במהלך מצבי מחלה חריפים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו באישור מראש של הוועדה של אוניברסיטת דלהאוזי למען חיות מעבדה (UCLA).

1. הכנה

  1. מערכת הדמיית ריאות: כדי להכין את החלון, תנו שכבה דקה של שומן ואקום לחלק העליון של הטבעת החיצונית תוך הימנעות מזיהום של תעלת הוואקום. מניחים כיסוי זכוכית נקי בקוטר 8 מ"מ על החלון ולוחצים בעדינות כלפי מטה כדי ליצור אטם.
  2. מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה: בצע הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי רחב שדה המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך של 20x/0.40 ובמצלמת התקן מצומדת מטען בשחור-לבן (CCD) עם קצב פריימים של 25 FPS. החל מסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר כדי להעיר את Rhodamine-6G ומסנן פס פס של 460-490 ננומטר כדי להעיר פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC).
  3. מערכת ואקום: חברו את חלון ההדמיה למשאבת ואקום המצוידת במד לחץ דיגיטלי המסוגל לספק יניקה קבועה של 50-60 מ"מ כספית, כפי שמוצג בתרשים משלים 1. בקיצור, חברו את חלון ההדמיה למשאבה באמצעות צינורות פוליאתילן I.D. בקוטר 1.0 מ"מ, צינורות פוליאתילן I.0 ס"מ בקוטר 1.0 ס"מ, בקבוקון ואקום ומסנן 0.2 מיקרומטר מוטבע.
  4. מכונת הנשמה: הגדר מכונת הנשמה קטנה למכרסמים כדי לספק אוורור מבוקר לחץ בקצב ובנפח המחושבים על סמך משקל העכבר. ספק לחץ קצה-תפוגה חיובי (PEEP) ב-5 ס"מH2O למשך הניסוי, והגדר את לחץ המטרה ל-20 סמ"ק2O.
  5. חומר הרדמה: באמצעות מערכת העברת הרדמה בזרימה נמוכה, הכינו מזרק 5.0 מ"ל עם 99.9% איזופלורן. השתמש במערכת חיטוי גז פסולת כדי למזער את הסיכון לשאיפה על ידי המנתח.

2. הרדמה

  1. מקם עכבר C57Bl/6 זכר בן 20-25 גרם בן 12 שבועות בתא האינדוקציה להרדמה. כאשר התא סגור היטב, התחילו באינדוקציה עם גז איזופלורן בריכוז של 3% ובקצב זרימה של 500 מ"ל לדקה.
  2. לאחר שהעכבר מורדם (דמיינו על ידי האטה בקצב הנשימה), העבירו אותו למעמד האינטובציה והצמידו את החותכים העליונים לתפר התלוי.
  3. הידקו את התפר כדי לאבטח את החוטם בתוך חרוט האף. התחילו את זרימת הגז דרך חרוט האף בריכוז של 2.5%.
  4. אשרו עומק הרדמה הולם באמצעות צביטה בבוהן לפני שתעברו לשלב הבא.

3. אינטובציה

  1. סובבו את המעמד כך שגב המעמד והצד הגבי של העכבר יפנו לכיוון המנתח.
  2. מעבירים את קצהו של כבל סיבים אופטיים באורך 20 ס"מ דרך צינורית אנדוטרכאלית של 20 גרם ומטביעים את הקצה בלידוקאין HCl (1%) כדי להקל על מעבר הכבל דרך הגרון.
  3. באמצעות מלקחיים קהים, הרימו את הלסת התחתונה והזיזו את הלשון כדי לספק מעבר ברור לתוך דרכי הנשימה.
  4. הכנס אוטוסקופ שונה (~60° מהיקף הספקולום הוסר) כך שהחותכות העליונות יתאימו לרווח בספקולום. התאימו את ההיקף ואת מיקום הלשון עד שהאפיגלוטיס, ומיתרי הקול נראים בבירור.
  5. הכנס את כבל הסיבים האופטיים הטעון בצינורית האנדו-טרכאלית דרך הרווח בספקולום ולתוך הגרון. באמצעות תנועות מעגליות קטנות, מעבירים את הכבל דרך מיתרי הקול ולתוך קנה הנשימה.
  6. דוחפים את הצינורית לאורך כבל הסיבים האופטיים, ועוברים בין מיתרי הקול לקנה הנשימה.

4. אוורור

  1. שלף את העכבר מעמדת האינטובציה והנח אותו על כרית חימום במצב דקוביטוס לרוחב ימין.
  2. חברו את הצינורית לצינורות הנשמה והפעילו את מכונת ההנשמה. הפחיתו את ריכוז ההרדמה ל-1.5% ונטרו את העומק על ידי בדיקת רפלקס הדוושה. אם הרפלקס נמשך, הגדל את הריכוז בהדרגה עד לרמה של עד 2%.
  3. מניחים ג'ל דמעות בעיני העכבר כדי למנוע ייבוש.
  4. באמצעות סרט רפואי, אבטח את הצינורית לחוטם. באמצעות סרט תיוג, הדק את המצח הימני למשטח החימום בערך, במיקום השעה 9. הרחיבו את הכפה האחורית השמאלית באופן קשוח ובטוחו בערך בשעה 6.
  5. באמצעות סרט בד, מתחו קלות את המצח השמאלי למצב השעה 12 והצמידו את הקצה השני של הקלטת לחלק העליון של פלטפורמת ה-IVM כפי שמוצג באיור 2A (שמירה על מתח קל כאן מקלה על כריתת החזה שלאחר מכן).
  6. הכנס בדיקת טמפרטורה רקטלית ואבטח את הגשושית על ידי הצמדתה למשטח החימום. מניחים אוקסימטר דופק על הכפה האחורית הימנית ומהדקים את כרית החימום, תוך הקפדה שלא לשבש את זרימת הדם.
  7. ברגע שהטמפרטורה יציבה ב 37°C ± 0.1 °C (66 °F), המשך לבצע את בית החזה.

5. תורקוטומיה

  1. לעקר את בית החזה והבטן עם 70% אלכוהול לנגב. יש למרוח שכבה בהירה של שמן מינרלי כדי להרטיב את השיער בצד שמאל של העכבר - מעצם החזה אל עמוד השדרה ומהכתף לתחתית הצלעות.
  2. עם מלקחיים קהים ומספריים ישרים, בצע חתך אורכי קטן ליד תחתית בית החזה כדי לחשוף את שכבת השריר הבסיסית.
  3. בתנועה גחונית, השתמש בדיסקציה קהה כדי להפריד בין רקמת האפיתל לרקמת השומן משכבת השריר. תזהו את כל כלי הדם החשופים. לאחר הפחתת הסיכון לאיבוד דם, האריכו את החתך המקורי בגחון עד לתהליך ה-xiphoid.
  4. חזור על תהליך זה באופן דורסני עד ~ 5 מ"מ רוחבי לעמוד החוליות.
  5. בתנועה מטורפת, השתמשו בניתוח קהה כדי לחשוף את כלוב הצלעות. צמצם את כל כלי הדם החשופים כדי לשמור על יציבות המודינמית.
  6. לאחר הפחתת הסיכון לאיבוד דם, הרחיבו את החתך מתהליך ה-xiphoid ועד לבית השחי.
  7. חזור על תהליך זה בצד הגבי של החתך עד כ-1 ס"מ נחות לאוזן שמאל.
  8. באמצעות מלקחיים המוסטטיים, תפסו את רקמת האפיתל והשומן המנותקת והתמקמו הרחק מהאזור הכירורגי (איור 2B).
  9. הזריקו תמיסה של רודמין-6G (0.5 מ"ג/מ"ל; 1.5 מ"ל/ק"ג) להדמיה של לויקוציטים ו-FITC-אלבומין בקר (50 מ"ג/מ"ל; 1 מ"ל/ק"ג) להדמיה של פרפוזיה נימית דרך וריד הזנב.
  10. באמצעות מלקחיים משוננים, תופסים את הצלע מיד נחותה ממיקום בסיס הריאה בהשראה הסופית ונסוגים מעט כדי למשוך את הצלע הרחק מהריאה. חותכים את הצלע כדי לגרום לפנאומוטורקס.
  11. יש להרחיב את החתך לרוחב לאורך השריר הבין-קוסטלי בשני הכיוונים, תוך הקפדה שלא לגעת במשטח הריאה החשוף.
  12. באמצעות מלקחיים קהים, תפסו את הצלע הגבוהה הבאה ונסוגו מעט כדי לאפשר לריאה ליפול מדופן בית החזה. אם הריאה אינה מתנתקת, לחץ קלות על דופן בית החזה כנגד הריאה כדי לגרום לריאה להיצמד לצדר הבסיסי ובכך ליפול בקלות רבה יותר.
  13. ממשיכים את החתך המקורי בגחון עד לעצם החזה ולקרונלי עד לחשיפת פסגת הריאה. השתמש באפליקטורים מכותנה ובגזה כדי להחליש כל דימום שעולה.
  14. הרם את בית החזה כדי לחשוף כלי דם בין-כוכביים על ההיבט הגבי של חלל בית החזה. תוך הקפדה שלא לפגוע בריאה, לצרוב את כלי הדם האינטרקוסטלי הנחות ביותר ליד עמוד השדרה, ולאחר מכן לחתוך את הצלע. בתנועה קרניאלית וגחונית, חזרו על הפעולה עד לכריתת חלק של כ-1 ס"מ על 1.5 ס"מ של הצלעות (איור 2C).
  15. הסר כל הצטברות נוזלים עודפת בחלל בית החזה באמצעות פעולה נימית באמצעות רצועות קטנות של גזה.
  16. תוך כדי המשך למיקרוסקופיה, אפשרו כ-5 דקות לפיזור הנוזל התוך-פלורלי לקבלת ממשק בטוח יותר בין הריאה לחלון ההדמיה.

6. מיקרוסקופיה

  1. הפעילו את משאבת הוואקום והתאימו את הלחץ ל-50-60 מ"מ כספית.
  2. העבר את פלטפורמת ה- IVM לשלב המיקרוסקופ. מקם את עמוד המתכת והמיקרומניפולטור כך שחלון ההדמיה יהיה ישירות מעל הריאה החשופה וזרוע החלון מתקרבת לריאה ממצב השעה 3 בערך.
  3. באמצעות המיקרומניפולטור, הנמיכו בזהירות את חלון ההדמיה עד שהוא נצמד למשטח הריאה ומייצב אותו (איור 3A).
  4. באמצעות המטרה 20x ומסנן העירור של פס פס 460-490 ננומטר, זהה זן ריאתי המבוסס על התבנית המתכנסת של זרימת הדם. מרכזים את כלי השיט בשדה הראייה ומקליטים 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על הצעד הקודם עד שצולמו חמישה זנים ריאתיים.
  5. באמצעות מסנן עירור פס פס של 460-490 ננומטר, זהה עורק ריאתי המבוסס על התבנית המסתעפת של זרימת הדם. מרכזים את כלי השיט בשדה הראייה ומקליטים 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על השלב הקודם עד שצולמו חמישה עורקי ריאות.
  6. באמצעות מסנן עירור פס פס 460-490 ננומטר, אתר אזור של נאדיות ונימים שאינם מצטלבים על ידי כלי שיט גדולים יותר ורושם 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על השלב הקודם עד להצטלם חמישה אזורים נימיים.

7. המתת חסד ופרוטוקול ניקוי

  1. הסר את פלטפורמת ה- IVM משלב המיקרוסקופ והתאם את אספקת האיזופלורן ל -5% למשך 5 דקות כדי להרדים את העכבר.
  2. בזמן ההמתנה, השליכו את זכוכית הכיסוי ונתקו את חלון ההדמיה מהרציף. נקו את חלון ההדמיה עם מברשת קטנה והשתמשו במזרק 30 גרם המוחדר לתעלה כדי לשטוף אותו מספר פעמים במים מזוקקים. לאחר מכן, יש לשטוף עם 95% אתנול באמצעות משאבת הוואקום.
  3. לאחר שחלפו 5 דקות, עצרו את מכונת ההנשמה והבטיחו המתת חסד מלאה באמצעות פריקה של צוואר הרחם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להמחיש את התוצאות הניתנות להשגה באמצעות פרוטוקול זה, נגרמה פגיעה חריפה בריאה (ALI) 6 שעות לפני ההדמיה באמצעות מודל של החדרת ליפופוליסכריד חיידקי תוך-ורידי (LPS). בקצרה, עכברים (n = 3) הורדמו עם איזופלורן, וטיפות קטנות של LPS מ - Pseudomonas aeruginosa במי מלח סטריליים (10 מ"ג / מ"ל) הוכנסו לתוך הנריס השמאלי במינון של 5 מ"ג / ק"ג. זאת בהשוואה לעכברים תמימים (n = 3; ללא ניהול תוך-גולגולתי).

עם ההדמיה, הכנה כירורגית מוצלחת ניתנת לזיהוי על ידי מספר גורמים. הריאה צריכה להיות יציבה יחסי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן דורש תרגול ותשומת לב לכמה שלבים קריטיים. ראשית, חשוב להכין את חלון ההדמיה לפני תחילת האינטובינציה והניתוח. השתמשו בכמות מינימלית של שומן ואקום כדי לצפות את הטבעת החיצונית של חלון ההדמיה, למרוח את זכוכית הכיסוי ולבדוק את היניקה עם טיפת מים מזוקקים. הכנה זו מראש תמנע מהריאה החשופה להתייבש במהלך ההתקנה אחרת. אמנם ניתן לשטוף במי מלח חמים, אך פעולה זו עלולה להסתכן בפגיעה ברקמת הריאה השברירית.

לאחר אינטובציה, בעת העברת העכבר לפלטפורמת IVM, הצינורית עלולה להיעקר מדי פעם. כדי למנוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ד"ר קמאלה ד. פאטל היא הנשיאה והמייסדת השותפה של Luxidea, הארגון שממנו נרכש חלון ההדמיה ששימש בניסוי זה.

תודות

המחברים מבקשים להודות לד"ר פינה קולארוסו, שסיפקה מומחיות משמעותית בעריכה ובתיקון של כתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"ל BD Luer Slip Tip סטרילי, לשימוש חד פעמיBecton, Dickinson and Company3096591 מ"ל מזרק
ADSON מלקחיים, רוחב קצה 0.6 מ"מ, אורך שיניים 11.5 מ"מ, 12 ס"מRWD Life Science Co.F12002-12מלקחיים קהים
אלבומין-פלואורסצאין איזותיוציאנטסיגמא-אולדריץ'A9771-1GFITC-אלבומין
ספוגית אלכוהול איזופרופיל אלכוהול 70% v/vחברת אריזות מותאמות אישית קנדית80002455מגבון אלכוהול
AVDC110 ממיר וידאו דיגיטלי מתקדםCanopus00631069602029ממיר וידאו דיגיטלי
B/W - CCD -הדמיית צופר מצלמהBC-71מצלמה
Bovie דלוקס ערכת קוטרי בטמפרטורה גבוההכלי מדע עדינים18010-00צריבה
C57BL / 6 עכבריםמעבדות נהר צ'ארלס בינלאומיC57BL / 6NCrlC57BL / 6 עכברים
כותנה עם קצה אפליקטוריםפוריטן806-WCמוליך כותנה
CS-8R 8 מ"מ כיסוי זכוכית עגולוורנר אינסטרומנטס64-0701כיסוי זכוכית
מד לחץ דיגיטליITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM & Vמד לחץ דיגיטלי
ד"ר אמא Slimline נירוסטה LED אוטוסקופד"ר אמא אוטוסקופים1001אוטוסקופ
אתיל אלכוהול 95% נפחאלכוהול מסחריP016EA9595% אתנול
מספריים עדינים - מרטנסיטי נירוסטהכלי מדע עדינים14094-11מספריים
פישרברנד סרט תיוג צבעוניפישר מדעי1590110סרט תיוג
Gast DOA-P704-AA משאבת ואקום בעלת קיבולת גבוההחברת קול-פארמר קנדהZA-07061-40משאבת ואקום
הרטמן המוסטטיםכלי מדע עדינים13003-10מלקחיים המוסטטיים
גריז ואקום גבוה שומן ואקוםDC976VFשומן ואקום
איזופלורן USPFresenius KabiCP0406V2Isoflurane
LIDOcaine הזרקת HCl 1% 50 מ"ג/5 מ"לTeligent קנדה0121AD01לידוקאין HCl 1%
Lung SurgiBoardLuxidea, Inc.IMCH-0001מיועד למיקרוסקופיה תוך-חיונית של הריאה
שמן מינרליטבע קנדה00485802
ערכת אינטובציה אנדוטרכיאלית לעכברKent Scientific CorporationETI-MSE, מסכת הרדמה, צינורית אנדוטרכיאלית 20 G, כבל סיבים אופטיים
MST49 מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeica Microsystems10 450 022מיקרוסקופ פלואורסצנטי
N Plan L 20x/0.40 מיקרוסקופ למרחק עבודה ארוך אובייקטיביLeica Microsystems56603520x אובייקטיבי
ספוגים לא ארוגים 2 אינץ' x 2 אינץ'AMD-RitmedA2101-CHגזה
Optixcare סיכה לעיניים בתוספתAventix5914322ג'ל דמעות
מקורי Prusa i3 MK3S+ מדפסת תלת מימדPrusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEIמדפסת תלת מימד
חמצן, לינדה קנדה דחוסהבע"ממחט חמצן
PrecisionGlide 30 גרם x 1/2 (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)בקטון, דיקינסון ושות'30510630 גרם מחט
פיירקס 5340-2L 5340 צלוחיות סינון, 2000 מ"לCole-Parmer Canada Company5340-2Lבקבוק ואקום
רודמין 6 גרםסיגמא-אולדריץ'252433רודמין 6G
סרט רפואי בד רך מאובטח - 3 אינץ'PM5-630709סרט בד
סילסטיים בדרגה רפואית .040 אינץ'. מזהה x 0.085 אינץ' ODDow Corning602-2051.0 מ"מ צינורות פוליאתילן תעודת זהות
Somnosuite מערכת הרדמה בזרימה נמוכהKent Scientific CorporationSS-01, SS-04-moduleמאוורר מכרסמים קטן, מערכת הרדמה בזרימה נמוכה, כרית חימום, בדיקת טמפרטורת פי הטבעת, מלקחיים רקמות אוקסימטר דופק
, באורך 12.5 ס"מ, מעוקל, 1 x 2 שינייםמכשירים מדויקים עולמיים501216מלקחיים
עם שינייםסרט רפואי טרנספור, 1527-1, 1 אינץ' x 10 יארד (2.5 ס"מ x 9.1 מ')סרט רפואי7000002795 3 מ
, שקוף, 3/8 אינץ' בקוטר פנימי.Grainger קנדהUSSZUSA-HT33141.0 ס"מ תעודת זהות צינורות פוליאתילן
Whatman 6720-5002 50 מ"מ מסננים בשורה, PTFE, 0.2 ומיקרו; mחברת קול-פארמר קנדה6720-5002מוטבע 0.2 ומיקרו; מסנן M
מעמד אינטובציה ג'ל דמעות צינורות צינורות '

מקורות

  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
  2. Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).
  3. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  4. Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
  5. Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748(2014).
  6. Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).
  7. Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
  8. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).
  9. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  10. Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
  11. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  12. Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
  13. Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
  14. Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).
  15. Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
  16. Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
  17. Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).
  18. Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
  19. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  20. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  21. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  22. Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  25. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  26. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).
  27. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  28. Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
  29. Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  30. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  31. Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
  32. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים