מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן הוא אחד הגורמים העיקריים למוות ברחבי העולם, והשכיחות של סוגים רבים של סרטן ממשיכה לעלות. התקדמות רבה הושגה במונחים של סינון, מניעה וטיפול; עם זאת, מודלים פרה-קליניים המנבאים את פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן עדיין חסרים. כדי למלא את הפער הזה, פותח ואומת מודל קסנוגרפט שמקורו במטופל in vivo . המודל התבסס על עוברים של דגי זברה (Danio rerio) יומיים לאחר ההפריה, אשר שימשו כמושתלים של שברי קסנוגרפט של רקמת גידול שנלקחו מדגימה כירורגית של מטופל.
ראוי גם לציין כי דגימות ביופטיות לא עוכלו או התפרקו, על מנת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, שהיא קריטית מבחינת ניתוח התנהגות הגידול והתגובה לטיפול. הפרוטוקול מפרט שיטה לביסוס xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם במטופל (zPDXs) מכריתה כירורגית ראשונית של גידול מוצק. לאחר הקרנה על ידי אנטומופתולוג, הדגימה מנותחת באמצעות להב אזמל. רקמת נמק, כלי דם או רקמת שומן מוסרים ולאחר מכן קצוצים לחתיכות 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ.
לאחר מכן החלקים מסומנים באופן פלואורסצנטי ומושתלים בחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה. ניתן לעבד מספר רב של עוברים בעלות נמוכה, מה שמאפשר ניתוח in vivo בתפוקה גבוהה של הרגישות הכימותרפית של zPDXs למספר תרופות אנטי-סרטניות. תמונות קונפוקליות נרכשות באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את רמות אפופטוטיקה המושרות על ידי טיפול כימותרפי בהשוואה לקבוצת הביקורת. הליך xenograft יש יתרון זמן משמעותי, שכן ניתן להשלים אותו ביום אחד, מתן חלון זמן סביר לבצע סינון טיפולי עבור ניסויים קליניים משותפים.
מבוא
אחת הבעיות של חקר הסרטן הקליני היא שסרטן אינו מחלה אחת, אלא מגוון מחלות שונות שיכולות להתפתח עם הזמן, ודורשות טיפולים ספציפיים בהתאם למאפייני הגידול עצמו והחולה1. כתוצאה מכך, האתגר הוא לנוע לעבר מחקר סרטן מוכוון מטופל, על מנת לזהות אסטרטגיות מותאמות אישית חדשות לחיזוי מוקדם של תוצאות הטיפול בסרטן2. זה רלוונטי במיוחד עבור אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), שכן הוא נחשב לסרטן קשה לטיפול, עם שיעור הישרדות של 5 שנים של 11%3.
האבחנה המאוחרת, ההתקדמות המהירה והיעדר טיפולים יעילים נותרו הבעיות הקליניות הדחופות ביותר של PDAC. האתגר העיקרי הוא, אם כן, למדל את המטופל ולזהות סמני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
משרד בריאות הציבור האיטלקי אישר את כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים, בהתאם לדירקטיבה 2010/63/EU בנושא שימוש וטיפול בבעלי חיים. ועדת האתיקה המקומית אישרה את המחקר, תחת מספר רישום 70213. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים המעורבים. לפני שמתחילים, יש להכין את כל הפתרונות והציוד (סעיף 1) ולחצות את הדגים (סעיף 2).
1. הכנת פתרונות וציוד
הערה: ראה טבלה 1 לקבלת הפתרונות והמדיה שיש להכין.
- התמיכה של Agarose gel
- שקלו את אבקת האגרוז בבקבוק הניתן למיקרו והמיסו אותה בנפח נתון של מדיום דג זברה E3 ליצירת ג'ל 1%. מחממים במיקרוגל עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין.
הערה: אין להרתיח יתר על המי....
- שקלו את אבקת האגרוז בבקבוק הניתן למיקרו והמיסו אותה בנפח נתון של מדיום דג זברה E3 ליצירת ג'ל 1%. מחממים במיקרוגל עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר את הגישה הניסיונית ליצירת zPDXs מאדנוקרצינומה ראשונית של הלבלב האנושי. דגימת גידול נאספת, טחונה ומוכתמת באמצעות צבע פלואורסצנטי, כמתואר בפרוטוקול סעיף 4. לאחר מכן zPDXs הוקמו בהצלחה על ידי השתלת פיסת גידול בחלל הפריביטלין של 2 עוברי דגי זברה dpf, כמתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול. כפי שמתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול, ה-zPDXs נבדקו עוד יותר כדי לזהות את פרופילי הרגישות לכימותרפיה של תאים סרטניים שמקורם בחולה. לדוגמה, השילוב הכימותרפי FOLFOXIRI (5-fluorouracil, חומצה פולינית, oxaliplatin, ואירינוטקן) נבדק, שכן הוא מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודלים In vivo בחקר הסרטן מספקים כלים שלא יסולא בפז להבנת הביולוגיה של הסרטן ולחיזוי התגובה לטיפול בסרטן. כיום, מודלים שונים in vivo זמינים, למשל, בעלי חיים מהונדסים גנטית (עכברים מהונדסים ונוקאאוט) או xenografts שמקורם בחולה מתאים ראשוניים אנושיים. למרות תכונות אופטימליות רבות, לכל אחד מהם יש מגבלות שונות. בפרט, המודלים הנ"ל חסרים דרך אמינה לחקות את המיקרו-סביבה של רקמת הגידול של המטופל.
הוצע כי מיקרו-סביבה של הגידול עשויה למלא תפקידים חשובים רבים בתגובה לתרופות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי Fondazione Pisa (פרויקט 114/16). המחברים רוצים להודות לרפלה גאטה מהיחידה להיסטופתולוגיה של Azienda Ospedaliera Pisana על בחירת דגימת המטופל והתמיכה הפתולוגית. אנו מודים גם לאלסיה גלנטה על התמיכה הטכנית בניסויים. מאמר זה מבוסס על עבודה של COST Action TRANSPAN, CA21116, הנתמכת על ידי COST (שיתוף פעולה אירופי במדע וטכנולוגיה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5-פלואורואורציל | טבע פארמה AG | SMP 1532755 | |
| 48 צלחת רב-בארות | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 צלחת רב-בארות | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| אצטון | Merck | 179124 | |
| אבקת אגרוז | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| נוגדן נגד גרעינים, שיבוט 235-1 | Merck | MAB1281 | דילול 1:200 |
| רשת אקווריום QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | תרמו פישר סיינטיפיק | C7001 | |
| CellTracker אדום עמוק | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) | טכנולוגיית איתות תאי | 9661S | 1:250 דילול |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | PanReac AppliChem ITW ריאגנטים | A3672,0250 | |
| Dumont #5 מלקחיים | World Precision Instruments | 501985 | |
| חומצה פולינית - נימי זכוכית של Lederfolin | Pfizer | ||
| , 3.5 אינץ' | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | קוטר חיצוני = 1.14 מ"מ. קוטר פנימי = 0.53 מ"מ. |
| בקבוקוני זכוכית | VWR International | WHEAW224581 | |
| עזים נגד ארנבות IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | דילול 1:500 |
| סרום עיזים | תרמו פישר סיינטיפיק | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| בקבוקוני מקפיא בטמפרטורה נמוכה | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain קוצץ רקמות | World Precision Instruments | ||
| מיקסר | מיקרופלייטSCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS Thermo Fisher | Scientific 14190094 | ||
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר סיינטיפיק | 15140122 | |
| צלחת פטרי 100 מ"מ | Sarstedt | 83 3902500 | |
| צלחת פטרי 60 מ"מ | Sarstedt | 83 3901 | |
| פיפטה פסטר מפלסטיק | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 בינוני | תרמו פישר | 11875093 | |
| להב אזמל מס' 10 נירוסטה סטרילית | VWR ידית אזמל SWAN3001 | ||
| #3 | מכשירי דיוק עולמיים | 500236 | |
| טריקאין | Merck | E10521 | |
| טריטון X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| מכשיר תריס | חולץ מיקרופיפטה אנכי | P-30 |
מקורות
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
