בסינפסות מעוררות במוח היונקים, גלוטמט המשתחרר באופן פרה-סינפטי מפעיל קולטנים המוטבעים בקרום הפוסט-סינפטי 1,2. כוחם של הקשרים הסינפטיים הללו עובר פלסטיות תלוית חוויה, תכונה המאפשרת צורות מגוונות של למידה וזיכרון 3,4,5,6,7,8,9. שינויים פתולוגיים במספר הסינפסות ותכונות האיתות שלהן מובילים לשינוי בפעילות המעגל ועיבוד המידע המוצג בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות 10,11,12. ככזה, יש צורך קריטי להבין את המנגנונים הבסיסיים השולטים בקישוריות עצבית ואת חוזק הקשרים הסינפטיים.
סינפסות מעוררות נוצרות על קוצים דנדריטיים, בליטות פוסט-סינפטיות זעירות המכילות חלבוני פיגומים, קולטנים, גורמי איתות, חלבוני שלד ציטו ואברוני סחר 1,2,13,14,15,16. תאי איתות אלה בגודל מיקרון מאפשרים שליטה בחוזק הסינפטי על בסיס סינפסה אחר סינפסה13,16. מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי משתנה לאורך הדנדריטים העצביים, כאשר צורות עמוד השדרה מתוארות בדרך כלל כדקות, פילופודיות, זעירות, פטריות או מסועפות13. חשוב לציין, צורת עמוד השדרה קשורה לתפקוד סינפטי ויציבות. לדוגמה, לקוצים גדולים יותר יש מספר גדול יותר של קולטנים וחוזק סינפטי גדול יותר 16,17,18. בניגוד לקוצים דקים, קוצים גדולים יותר יכולים להחזיק מעמד במשך חודשים in vivo, תכונה שעשויה לאפשר קשרים סינפטיים יציבים ואחסון זיכרון לטווח ארוך19,20.
בדרך כלל עוקבים אחר מורפולוגיה וצפיפות עמוד השדרה לאורך דנדריט כדי לחקור את מידת הקישוריות העצבית ואת התכונות של סינפסות מעוררות באזור מסוים במוח, הן במצב נורמלי והן במצב מחלה13. פותחו מגוון שיטות להמחשת מורפולוגיה של עמוד השדרה בתכשירים שונים של רקמות ומערכות מודלים באמצעות מיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי סטנדרטי, כמו גם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ואלקטרונים (EM)21. טכניקות הדמיה עוצמתיות אלה סיפקו תובנה עצומה להבנה הנוכחית שלנו לגבי ארגון המוח, תפקודו ומחלות. אוסף שיטות זה כולל טכניקות הדמיה חשובות לניטור המורכבות המורפולוגית של דנדריטים ועמודי שדרה, כמו גם כלים אופטוגנטיים להפעלה ומדידה של פעילות עצבית בדנדריטים ובעמוד שדרה בודד.
Pekarek et al.22 מציגים פרוטוקול מהיר יחסית ובעל תפוקה גבוהה להדמיה וכימות המבנה של דנדריטים עצביים עמוק בתוך רקמת עצבים שלמה. המחברים מבצעים Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), טכניקת ניקוי רקמות המסירה שומנים מרקמת המוח ועוזרת למזער את פיזור האור במהלך ההדמיה הבאה23. לאחר הניקוי, ערימות Z של נוירונים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים נאספו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או דו-פוטונית. ניתוח תמונה וכימות אוטומטי אפשרו מדידות מדויקות של צפיפות וצורת עמוד השדרה, כמו גם מורכבות עצים דנדריטיים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה סימולטנית של מבנים החל מקוצים בודדים ועד עצים דנדריטיים ומסיר את השלב הגוזל זמן ועלול להזיק של חיתוך חתך דק. טכניקה זו תהיה שימושית מאוד לחוקרים המעוניינים לכמת שינויים במורפולוגיה של עמוד השדרה ובמורכבות הדנדריטית ברקמות מוח שלמות לאחר החדרה או הסרה של גנים מעניינים.
צביעת גולג'י, שפותחה לפני למעלה מ-100 שנה24, נותרה כלי רב עוצמה להמחשת ארגון מערכת העצבים ומורפולוגיה עצבית. בשיטה זו, אוכלוסיות דלילות של נוירונים מוכתמות על ידי מיקרו-קריסטליזציה של כרומט כסף, מה שמאפשר הדמיה של אקסונים, עצים דנדריטיים וקוצים25. פרנקפורט ובאומן26 מפרטים פרוטוקול הספגה מהיר של גולגי כדי להמחיש נוירונים ועמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס של החולדה ובקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית. המחברים מדגימים כיצד להכין, לצבוע ולדמות רקמה למיקרוסקופ אור עוקב, כמו גם לכמת את צפיפות עמוד השדרה לאורך עצים דנדריטיים. הפרוטוקול המתואר כאן מניב הספגה עקבית ואמינה של נוירונים, ומפחית את החשיפה לכימיקלים רעילים.
בעוד שמיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מתאימים היטב להדמיית דנדריטים וקוצים, EM מאפשר הדמיה ברזולוציה ננומטרית של מבנים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים21. גישות EM משמשות בדרך כלל למדידת התכונות האולטרה-מבניות של סינפסות, כולל ממדי הצפיפות הפוסט-סינפטית, כמו גם המספרים והגודל של שלפוחיות סינפטיות21. באוסף זה, Śliwińska et al.27 מספקים פרוטוקול לרכישת תמונות EM תלת מימדיות (3D) על ידי סריקת פנים נעילה Electron M(SBEM) ברקמת עכבר ההיפוקמפוס28,29. באופן ספציפי, הם מתארים כיצד להכין דגימות, להטמיע רקמות בשרף, להרכיב ולקצץ דגימות, לבצע SBEM ולנתח תמונות כדי ליצור שחזורים תלת מימדיים. פרוטוקול זה מייצר תמונות בעלות ניגודיות גבוהה עם ממברנות מוגדרות היטב וניתן להתאים אותו למגוון סוגי רקמות.
במהלך התפתחות מערכת העצבים, נוירונים עוברים שינויים מורפולוגיים דרמטיים כאשר קשרים סינפטיים נוצרים ומזוקקים על ידי פעילות עצבית30,31. כדי לעקוב אחר התבגרות עצבית במוח הקטן המתפתח, Chan et al.32 מספקים פרוטוקול לאלקטרופורציה לאחר הלידה in vivo של נוירונים גרגירים מתפתחים. כאן, החוקרים הזריקו DNA למוח האחורי של גורי עכברים לאחר לידה כדי להעביר אוכלוסייה דלילה של נוירונים עם חלבונים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה והדמיה תלת מימדית אפשרו לחוקרים לאפיין את המורפולוגיה של דנדריטים וטפרים דנדריטיים על פני מספר שלבים של התפתחות לאחר הלידה. חשוב לציין, גישה זו יכולה לאפשר החדרה או הסרה של גנים שעשויים להשפיע על התבגרות ותפקוד תאי הגרגיר ותעניין מאוד חוקרים החוקרים את התפתחות המוח הקטן והבשלת נוירונים גרגירים.
לבסוף, הפרוטוקולים של Cuentas-Condori ו-Miller33 משתמשים בהדמיה ברזולוציהגבוהה 34, אופטוגנטיקה35 והדמיית תאים חיים של דינמיקת סידן36 כדי לחקור את הפעילות של נוירונים GABAergic בנמטודה, C. elegans. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד להדמיה ברזולוציהגבוהה 37, המחברים מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בדנדריטים כדי למדוד את התדירות של צורות עמוד שדרה שונות. יתר על כן, המחברים מעריכים את התפקוד העצבי על ידי ביטוי של חלבון אופטוגנטי באופן פרה-סינפטי ואינדיקטור סידן פוסט-סינפטי. בעקבות הפעלת אור של טרמינלים, נצפו מעברי סידן בתוך קוצים דנדריטיים בודדים. פרוטוקולים אלה, יחד עם ממצאים אחרונים38, מדגישים את השימוש המרגש ב-C. elegans כמערכת מודל רבת עוצמה למעקב אחר מורפולוגיה של עמוד השדרה ופעילות סינפטית.
יחד, הפרוטוקולים המתוארים באוסף שיטות זה יתווספו לארגז הכלים העשיר ממילא הזמין להמחשת מבנה ותפקוד עצביים21. יישום שיטות אלה במחקרים עתידיים יספק ככל הנראה תובנות נוספות לגבי התהליכים המניעים פלסטיות סינפטית הקשורה ללמידה והמנגנונים התאיים העומדים בבסיס מצבי מחלה.