מאמר שיטה

מודל הפטוציטים מוסמך הבוחן את כניסת נגיף הפטיטיס B דרך נתרן טאורוחולאט קוטרנספורטינג פוליפפטיד כמטרה טיפולית

DOI:

10.3791/63761

⸱

10 במאי 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב לגורם סיכון מכריע לקרצינומה הפטוצלולרית. הטיפול הנוכחי יכול רק להפחית את העומס הנגיפי אך לא לגרום להפוגה מוחלטת. מודל הפטוציטים יעיל לזיהום HBV יציע מחזור חיים נגיפי נאמן לחיים שיהיה חיוני לסינון של חומרים טיפוליים. רוב הסוכנים הזמינים נגד HBV מתמקדים בשלבי מחזור החיים לאחר כניסה ויראלית אך לא לפני כניסה ויראלית. פרוטוקול זה מפרט את יצירתו של מודל הפטוציטים מוכשר המסוגל לבצע סינון לסוכנים טיפוליים המכוונים לשלבי מחזור החיים של כניסה טרום-ויראלית ופוסט-ויראלית. זה כולל את ההתמקדות של נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP) קשירה, היווצרות cccDNA, שעתוק, והרכבה ויראלית המבוססת על imHC או HepaRG כמו תאים מארחים. כאן, בדיקת עיכוב הכניסה HBV השתמשה בכורכומין כדי לעכב פונקציות קשירה והובלה של HBV באמצעות NTCP. המעכבים הוערכו עבור זיקה מחייבת (KD) עם NTCP באמצעות קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) - כלי אוניברסלי לבדיקת תרופות HBV המבוסס על פרמטרים תרמודינמיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב למחלה מסכנת חיים ברחבי העולם. זיהום HBV כרוני עמוס בסיכון לשחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית1. הטיפול הנוכחי נגד HBV מתמקד בעיקר בכניסה לאחר הנגיף באמצעות אנלוגים גרעיניים(t)IDE (NAs) ואינטרפרון-אלפא (IFN-α)2,3. הגילוי של מעכב כניסה HBV, Myrcludex B, זיהה מטרה חדשה לחומרים נגד HBV4. השילוב של מעכבי כניסה ו-NAs ב-HBV כרוני הפחית משמעותית את העומס הנגיפי בהשוואה לאלה המכוונים לשכפול נגיפי בלבד 5,6. עם זאת, המודל הקלאסי של הפטוציטים להקרנה של מעכבי כניסה HBV מוגבל על ידי רמות נמוכות של קולטנים נגיפיים (נתרן טאורוחולאט cotransporting polypeptide, NTCP). ביטוי יתר של hNTCP בתאי הפטומה (כלומר, HepG2 ו- Huh7) משפר את זיהום HBV 7,8. אף על פי כן, קווי תאים אלה מבטאים רמות נמוכות של אנזימים מעכלים של תרופות בשלב I ו-II ומפגינים חוסר יציבות גנטית9. מודלים של הפטוציטים שיכולים לסייע במיקוד מנגנונים מובחנים של תרכובות אנטי-HBV מועמדות כגון כניסה טרום-ויראלית, קשירת NTCP וכניסה ויראלית יזרזו את הזיהוי והפיתוח של משטרי שילוב יעילים. המחקר על פעילות אנטי-HBV של כורכומין הבהיר את עיכוב כניסת הנגיף כמנגנון חדש בנוסף להפרעה לאחר כניסת הנגיף. פרוטוקול זה מפרט מודל מארח להקרנה של מולקולות כניסה נגד HBV10.

המטרה של שיטה זו היא לחקור תרכובות אנטי-HBV מועמדות לעיכוב כניסה נגיפית, במיוחד חסימת קשירת NTCP והובלתו. מכיוון שביטוי NTCP הוא גורם קריטי לכניסה וזיהום של HBV, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול ההבשלה של הפטוציטים כדי למקסם את רמות NTCP11. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להבדיל בין ההשפעה המעכבת על כניסת HBV כעיכוב של חיבור HBV לעומת עיכוב של הפנמה. בדיקת ספיגת החומצה הטאורוכולית (TCA) שונתה גם היא באמצעות שיטה מבוססת ELISA במקום רדיואיזוטופ כדי לייצג הובלת NTCP12,13. האינטראקציה בין הקולטן לליגנד אושרה על ידי המבנים התלת-ממדיים שלהם14,15. ניתן להעריך את העיכוב של פונקציית NTCP על ידי מדידת פעילות ספיגת TCA16. עם זאת, טכניקה זו לא סיפקה עדות ישירה לקשירת NTCP למעכבי המועמדים. לכן, ניתן לחקור את הקשירה באמצעות טכניקות שונות, כגון תהודת פלסמוןפני השטח 17, ELISA, בדיקת הסטה תרמית מבוססת פלואורסצנציה (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen, ושיטות שונות אחרות20. בין טכניקות אלה, ITC הוא תקן מטרה בניתוח מחייב מכיוון שהוא יכול לצפות בספיגת חום או פליטה כמעט בכל תגובה21. זיקת הקשירה (KD) של NTCP ותרכובות מועמדות הוערכה ישירות באמצעות ITC; ערכי זיקה אלה היו מדויקים יותר מאלו שהושגו באמצעות מודל החיזוי של סיליקו 22.

פרוטוקול זה מכסה טכניקות בהבשלת הפטוציטים, זיהום HBV והקרנה למעכבי כניסה HBV. בקצרה, פותח מודל הפטוציטים המבוסס על קווי תאים imHC ו- HepaRG. התאים בתרבית התמינו להפטוציטים בוגרים תוך שבועיים. העלייה ברמות NTCP זוהתה באמצעות PCR בזמן אמת, כתם מערבי וציטומטריה של זרימה11. הפטיטיס B virion (HBVcc) הופק ונאסף מ- HepG2.2.15. ה-imHC או ה-HepaRG המובחנים (d-imHC, d-HepaRG) טופלו באופן מניעתי עם המועמדים נגד HBV שעתיים לפני החיסון ב-HBV virion. התוצאה הצפויה של הניסוי הייתה זיהוי הסוכנים המפחיתים את ה-HBV התאי ואת ההדבקה. פעילות אנטי-NTCP הוערכה באמצעות בדיקת קליטת TCA. ניתן לדכא את פעילות NTCP על ידי הסוכנים שקשרו באופן ספציפי את NTCP. טכניקת ITC שימשה כדי לחקור את ההיתכנות של קשירה אינטראקטיבית שיכולה לחזות מעכבים וחלבוני המטרה שלהם, ולקבוע את זיקת הקשירה (KD) של הליגנד לקולטן באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות של הקומפלקס הביומולקולרי23,24. לדוגמה, K D ≥ 1 × 103 mM מייצג כריכה חלשה, K D ≥ 1 × 106 μM מייצג כריכה בינונית, ו- K D ≤ 1 × 109 nM מייצג כריכה חזקה. ה- ΔG נמצא בקורלציה ישירה עם אינטראקציות מחייבות. בפרט, תגובה עם ΔG שלילי היא תגובה אקסרגונית, המציינת כי מחייב הוא תהליך ספונטני. תגובה עם ΔH שלילי מצביעה על כך שתהליכי הקשירה תלויים בקשרי מימן ובכוחות ואן דר ואלס. ניתן להשתמש הן בקליטת TCA והן בנתוני ITC כדי לסנן סוכני כניסה נגד HBV. התוצאות של פרוטוקולים אלה יכולות לספק בסיס לא רק לסינון נגד HBV אלא גם לאינטראקציה עם NTCP כפי שהיא מוערכת באמצעות זיקה מחייבת ופונקציית תחבורה. מאמר זה מתאר הכנה ואפיון של תאי מארח, תכנון ניסויי והערכה של הערך נגד HBV יחד עם זיקת קשירת NTCP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים במכסה מנוע זרימת סיכון ביולוגי מדרגה II או במכסה מנוע זרימה למינרית. הטיפול ב-HBV אושר אתית על ידי ה-IRB (MURA2020/1545). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הפתרונות, הריאגנטים, הציוד וקווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת תאים מארחים (הפטוציטים בוגרים)

  1. תרבית הפטוציטים (3.75 × 105 תאים HepaRG או imHC) ולשמור על בקבוקון תרבית בגודל 75 ס"מ2 עם 10 מ"ל של DMEM/F12 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. המתן עד שהתאים יגיעו למפגש של 80%-90% (תוך שבוע).
  2. השליכו את המדיום הישן מהבקבוקון ושטפו את התאים עם 4 מ"ל של מלח אפוף פוספטים (PBS).
  3. שאפו את ה- PBS והוסיפו 4 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.
  4. דגרו את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות, ובדקו את התאים הדבקים באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשה אובייקטיבית של פי 10. ודא כי monolayer התנתק מן המשטח culturing.
  5. לעכב את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום התרבית בתוספת 10% FBS לבקבוקון ולהשהות בזהירות את התאים שנקטפו. העבר את מתלה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס.
  6. שאפו את הסופרנטנט מכדור התא ושתו מחדש עם 1-2 מ"ל של מדיום התרבית שחומם מראש בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה.
  7. מערבבים 10 μL כל אחד מתרחיף התאים וטריפאן כחול וסופרים את התאים באמצעות המציטומטר. ודא שכדאיות התא גבוהה מ- 90% לפני שתמשיך לשלב הבא.
  8. זרעו 1 × 106 תאים לכל 2 מ"ל בכל באר של צלחת 6 בארות ושמרו על המדיום השלם של DME/F12 עד שהתאים מגיעים למפגש של 100%.
  9. להבשלת הכבד, הכינו מדיום התבגרות בכבד (מדיום E של וויליאמס בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 μM הידרוקורטיזון, 2 mM L-גלוטמין ו-2% DMSO).
  10. החלף את מדיום התרבות 2 פעמים בשבוע.
  11. שמור על hepatocytes במדיום התבגרות במשך 2 שבועות כדי לקבל hepatocytes בוגר מוכן לזיהום HBV.

2. כימות של NTCP סלולרי

  1. מדידת ביטוי NTCP באמצעות PCR בזמן אמת
    1. לאסוף את הכדור של hepatocytes בוגרים באמצעות טריפסיניזציה (ראה שלבים 1.2-1.5).
    2. חלץ RNA כולל מכדור התא באמצעות ערכת מיצוי RNA עם טיפול DNase I.
    3. סינתזה של cDNA מ-200 ננוגרם של רנ"א כולל באמצעות פריימר oligo-dT ומערכת שעתוק לאחור בהתאם להוראות היצרן.
    4. דלל את ה-cDNA ל-50 ng/μL והשתמש בו כתבנית לתגובת ה-PCR. ערבבו 2 μL של ה-cDNA המדולל עם ריאגנטים של תערובת מאסטר PCR המכילים תמיסת ערכת qRT-PCR ירוקה של SYBR עם פריימרים ספציפיים ל-5 μM NTCP (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' ו-5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. לנורמליזציה, השתמש ב- GAPDH כגן משק בית עם פריימרים ספציפיים (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' ו- 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
    6. הגבר את דגימות ה- cDNA באמצעות מחזור תרמי בתנאי הטמפרטורה הבאים: מחזור אחד של 3 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס (דנטורציה ראשונית); 40 מחזורים של 30 שניות ב-95°C (דנטורציה), 30 שניות ב-60°C עד 65°C (חישול), 30 שניות ב-72°C (הרחבה); מחזור אחד של 5 דקות ב-72°C (הארכה סופית).
    7. חשב את השינוי בקיפול NTCP בהפטוציטים בוגרים על פני תאים לא מובחנים באמצעות GAPDH כגן כיול המבוסס על שיטת 2-ΔΔCT .
  2. כימות NTCP באמצעות ניתוח כתמים מערביים
    1. קציר hepatocytes באמצעות מגרד תאים צנטריפוגה אותם ב 300 x גרם, 25 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי לאסוף את גלולת התא.
    2. עקוב אחר הוראות יצרן חיץ RIPA כדי לחלץ את החלבון התאי עם 100 μL של חיץ RIPA המכיל מעכב פרוטאז 1x.
    3. מדדו את ריכוז החלבון הכולל בשיטת החומצה הביסינצ'ונית (BCA).
    4. יש לערבב 12.5 μL של חלבון עם 2x צבע העמסה ביחס של 1:1 לפי נפח.
    5. מרתיחים את תערובת החלבונים והסולם הסטנדרטי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. הוסף מאגר פועל 1x לתא האלקטרופורזה.
    7. יש לטעון 5 מיקרו-ליטר מהסולם הסטנדרטי של החלבון או 20 מיקרו-ליטר של תערובת החלבון המבושל בג'ל פוליאקרילאמיד של 10% (w/v).
    8. בצע אלקטרופורזה בג'ל: 50 וולט למשך 30 דקות ואחריו 90 וולט למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    9. הכינו קרום PVDF על ידי השרייתו במתנול למשך 30 שניות, שטפו אותו במים מזוקקים פעמיים למשך 1-2 דקות, והשרו אותו יחד עם שתי פיסות נייר סינון במאגר העברה למשך 10 דקות או עד לשימוש.
    10. מניחים את נייר הסינון על צלחת האנודה של תא העברה יבש למחצה; לאחר מכן, הניחו את קרום ה-PVDF, הג'ל ונייר הסינון מלמעלה, בסדר הזה.
    11. מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום ה-PVDF ב-10 וולט למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. חסום את הממברנה עם תמיסת חסימת WB למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    13. לדגום את הממברנה עם אנטי נתרן taurocholate cotransporting פוליפפטיד (אנטי NTCP) (1:100 דילול) ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
    14. לשטוף את הממברנה 3 x 10 דקות עם TBST.
    15. לדגום את הממברנה עם נוגדן נגד עזים מצומד נגד ארנבת (1:10,000 דילול) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    16. לשטוף את הממברנה 3 x 10 דקות עם TBST ולאחר מכן 1 x 5 דקות עם TBS.
    17. זהה NTCP באמצעות מצע HRP (ראה טבלת חומרים).
    18. הוסיפו לפחות 0.1 מ"ל של תמיסת מצע HRP / ס"מ2 של הממברנה ודגרו את הממברנה למשך 3-5 דקות בחושך.
    19. דמיינו את NTCP באמצעות מערכת תיעוד ג'ל במצב chemiluminescence, בחר את אפשרות הסמן עבור הממברנה, התאם את זמן החשיפה עם מצב מצטבר כל 1 דקות, וצלם את התמונה עם זמני חשיפה שונים במשך 5 דקות.
    20. הפשיטו ובדקו את הכתם עם נוגדן נגד GAPDH לעכבר (דילול 1:200,000) ונוגדן משני נגד עיזים מצומד HRP (דילול 1:10,000).
  3. מדידת רמת NTCP באמצעות ציטומטריה של זרימה
    1. לאסוף את כדורי התא של hepatocytes בוגר על ידי דגירה של התאים עם 8 mM EDTA במשך 15 דקות.
      הערה: הימנע משימוש בטריפסין או בפרוטאזות אחרות שעלולות לשבש את הקולטנים על פני התא. מכיוון ש-NTCP הוא חלבון קולטן על פני התא, נזק כתוצאה מטריפסיניזציה יכול לתת תוצאות שליליות.
    2. לתקן את hepatocytes עם 300 μL של 3.7% paraformaldehyde ב 1x PBS במשך 15 דקות. העבר את מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 °C.
    3. לשטוף את התאים 2x עם 700 μL של 1x PBS עם 1% FBS (v / v), צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 °C, להוסיף 300 μL של 0.05% Triton X-100 ב PBS גלולה התא, ולדגור את התאים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי לחדור אותם.
    4. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס, לשטוף את כדור התא 3 x 1 דקות עם 700 μL של PBS המכיל 1% FBS (v / v). דגירה של התאים עם הנוגדן העיקרי נגד NTCP (דילול 1:100) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם חיץ Perm / Wash צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס.
    5. הכתימו את התאים בנוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם חיץ Perm / Wash צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס. החזירו את כדור התא עם 200 μL של PBS עם 1% FBS (v/v).
    6. הפעל את ציטומטר הזרימה, חמם את הלייזר למשך 15 דקות ובצע ניקוי שגרתי.
    7. בחר את פרמטרי המדידה, כולל פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC) ואיזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) או פיקוריתרין (PE), והגדר את התאמת הפיצוי האוטומטי על-ידי התוכנה. כלול את דגימות בקרת הפיצוי: בקרה לא מוכתמת, בקרה מוכתמת ב- INTC ובקרה מוכתמת ב- PE.
      הערה: פרמטרים FSC ו - SSC משמשים לקביעת הגודל והפירוט של תאים בודדים כדי לבחור את אוכלוסיית התאים לניתוח gating. לגלאי התעלה הפלואורסצנטית יש ערוצי FITC ו - PE . עבור פרוטוקול זה, בחר את ערוץ FITC כדי לזהות Alexa Fluor 488.
    8. הפעל את הדגימה הלא מוכתמת בקצב זרימה נוזלי בינוני (60 μL/min), התאם את הסף של FSC ו- SSC עד שהם יכסו את אוכלוסיית התאים המעניינת, סמן את אזור השער באזור זה והחל על כל בקרות הפיצוי.
    9. הגדר את שפופרת הפוטומולטיפלייר הפלואורסצנטית (PMT) באמצעות הבקרה הלא מוכתמת, והתאם את מתח ה- PMT של FITC או PE ברביע השלילי. הפעל את הדגימה המוכתמת החיובית והתאם את FITC או PE בסולם הרביע החיובי. הפעל את הפקדים הלא מוכתמים, המוכתמים ב- FITC או מוכתמים ב- PE, חשב את הפיצוי והחל אותו על הגדרות הדגימה. הפעל את דגימת ההפטוציטים כדי למדוד את רמת NTCP.
    10. נתחו את ההפטוציטים המוכתמים באמצעות תוכנת ציטומטר זרימה (ראו טבלת חומרים).
      1. תחת חלונות BD FACSuite, לחץ על צינור הבקרה בכרטיסייה מקורות נתונים והמתן עד שהנתונים הגולמיים יופיעו.
      2. בכרטיסיה גליון עבודה בצד שמאל, לחץ על לחצן שער האליפסה , בחר את אוכלוסיית התאים ב- SSC ואת תרשים הנקודה של FSC באמצעות סמן העכבר והמתן עד שהעיגול P1 יופיע.
      3. לחץ על הלחצן Interval Gate וסמן את האזור בהיסטוגרמה של FITC, החל מערך עוצמת הפלואורסצנציה הגבוה ביותר לצד ימין. שימו לב לקו P2 שמופיע.
      4. לחץ על שפופרת הניסוי וראה שהנתונים בכרטיסיה גליון עבודה משתנים. לחץ על לחצן סטטיסטיקה ולאחר מכן על השטח הריק בגליון העבודה. שים לב לערכים הסטטיסטיים של אוכלוסיית NTCP המופיעים.

3. ייצור חלקיקי HBV שמקורם בתרבית תאים (HBVcc)

  1. תרבית HepG2.2.15 במדיום שלם (DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ למשך 24 שעות.
  2. החלף את המדיום השלם בתוספת גנטיצין של 380 מיקרוגרם/מ"ל (G418) כאשר HepG2.2.15 מגיע למפגש של 60%-70%. לקצור את המדיום המותנה כל יומיים; לאחסן את המדיום המכיל HBV ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה של הסופרנטנט ב-5,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אסוף את המדיום המותנה באמצעות מזרק של 20 מ"ל וסנן אותו דרך מסנן בעל קשירה נמוכה של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תאים.
  4. כדי לרכז HBV, דלל נפח 1 של רכז עם 3 כרכים של supernatant מסונן משלב 3.3 בצינור צנטריפוגה חרוטי ולערבב בזהירות את הפתרון על ידי היפוך צינור. מניחים את התערובת בחום של 4 מעלות למשך שעה. צנטריפוגה של התמיסה במשך שעה אחת ב 1,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס וודא כי גלולה אוף-ווייט נראית לעין.
    הערה: עבור כל 30 מ"ל של סופרנטנט מסונן משלב 3.3, הוסף 10 מ"ל של הרכז כדי להגיע לנפח כולל של 40 מ"ל.
  5. הערך את titer HBV (שווה ערך לגנום) עם HBV 1.3-mer WT replicon כעקומה סטנדרטית הנעה בין 1 × 102 ל 1 × 1010 באמצעות PCR מוחלט בזמן אמת, כפי שתואר קודם לכן11.
  6. שחזרו בעדינות את הכדור ב-FBS ואחסנו עד שנה אחת ב-−80 מעלות צלזיוס ב-aliquots חד-פעמיים.

4. בדיקת כניסה נגד HBV

  1. שמור על 100% מפגש imHC או HepaRG ב-6 צלחות טובות במדיום ההבשלה (2% DMSO במדיום E של וויליאמס, 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 מיקרומטר הידרוקורטיזון ו-2 mM L-גלוטמין) למשך שבועיים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.
  2. שאפו את המדיום, ואז הוסיפו את הכורכומין (10-30 μM) או 4 μM ציקלוספורין A (CsA) מדולל עם מדיום E של ויליאם למשך שעתיים. שאפו את מעכב הכניסה HBV המועמד והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיום E של ויליאם המכיל 4% פוליאתילן גליקול.
  3. הוסיפו חלקיקי HBV למדיום התרבית בריבוי זיהום (MOI) של 100 לכל באר ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. השליכו את ה-supernatant, הוסיפו 2 מ"ל של PBS קר וסובבו בעדינות כדי לשטוף את המדיום הישן עם HBV לא מאוגד.
  4. הוסף 2 מ"ל של מדיום E שלם של ויליאם ותרבות במשך 7 ימים. שאפו את המדיום, שטפו את התאים עם PBS אחד, וקבעו את התאים עם 3.7% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חלחלו וחסמו את התאים הנגועים עם תמיסה חוסמת IF (0.2% Triton X-100 ו-3% אלבומין בסרום בקר ב-PBS) ודגירה שלהם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מוסיפים את הנוגדן העיקרי (אנטיגן הליבה נגד HBV) בדילול 1:200 בתמיסת החסימה ודוגרים לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם תמיסת כביסה (0.5% Tween 20 ב PBS).
  6. הוסיפו נוגדן משני (דילול 1:500) לתמיסת חסימת IF, דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ושטפו את התאים 3X1 דקות בתמיסת כביסה.
  7. הרכב את הדגימה עם מדיום הרכבה אנטי-פאדי עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI), וכסה בכיסוי זכוכית. זהה את אות הפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן DAPI (Ex 352-402 nM ו- Em 417-477) ומסנן PE (Ex 542-582 ו- Em 604-644), יחד עם עדשה אובייקטיבית של פי 20, וקבע פעילות כניסה נגד HBV של התרכובות המועמדות.

5. בדיקת קשירת תאי HBV

  1. שמור על 100% מפגש imHC או HepaRG ב-6 צלחות טובות במדיום ההבשלה (2% DMSO במדיום E של וויליאמס, 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 מיקרומטר הידרוקורטיזון ו-2 mM L-גלוטמין) למשך שבועיים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.
  2. שאפו את המדיום, ואז הוסיפו כורכומין (10-30 מיקרומטר) או ציקלוספורין A (4 מיקרומטר) מדולל במדיום E של ויליאם למשך שעתיים. שאפו את מעכב הכניסה HBV והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיום E של ויליאם המכיל 4% פוליאתילן גליקול.
  3. הוסיפו חלקיקי HBV למדיום התרבית ב-MOI של 100 לכל באר ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר קשירת HBV להפטוציטים. השליכו את המדיום המכיל HBV לא מאוגד, הוסיפו 2 מ"ל של PBS קר והסתחררו בעדינות כדי להסיר עקבות של המדיום המושקע.
  4. קצור את התאים הנגועים באמצעות מגרד תאים ושבש את התאים עם מאגר תזה. העבר את הליזאט לצינור איסוף וחלץ דנ"א כולל כדי להעריך את הדנ"א של HBV באמצעות PCR בזמן אמת עם פריימרים ספציפיים עבור HBV (פריימר קדמי: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', ופריימר הפוך: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') באמצעות PRNP (פריימר קדמי: 5'- GACCAATTTATGCCTACC-3', פריימר הפוך: 5'- TTTATGCCTACCCTCCTA-3') כבקרה פנימית.
  5. הגבר את מוצרי ה-PCR במחזור תרמי באמצעות תנאי הטמפרטורה המתוארים בשלב 2.1.
  6. חישוב רמות דנ"א יחסית של HBV/1 × 106 תאים בטיפול לעומת בקרה באמצעות PRNP כגן הכיול המבוסס על שיטת 2-ΔΔCT .

6. בדיקת ספיגת חומצה טאורוכולית (TCA)

  1. שמור על 100% תאים מחוברים של imHC ו- HepaRG במדיום ההבשלה למשך 14 יום.
  2. לשאוף את המדיום ולשטוף את hepatocytes עם 1x PBS. הוסיפו כורכומין או ציקלוספורין A (10-50 מיקרומטר) מדולל במדיום E של ויליאם למשך שעתיים. החלף את המדיום בתמיסת חומצה טאורוכולית נתרן (0.5 M נתרן טאורוקולאט הידרט ב- 1x HEPES) ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שאפו את תמיסת החומצה הסודיום טאורוחולית, ושטפו 3x עם HEPES קר 1x. הוסיפו 300-500 מיקרון של HEPES קר 1x וקצרו את התאים עם מגרדי תאים על קרח.
  4. הומוגניזציה של התאים על ידי אולטרה סאונד בתדר של 20 קילוהרץ במשך 20 שניות ודגירה על קרח במשך 5 דקות. צנטריפוגה של הליזאטים ב-10,000 × גרם למשך 20 דקות כדי לזרז את פסולת התאים. אסוף את העל-טבעי והערך את ריכוז החומצה הטאורוכולית התוך-תאית באמצעות ערכת בדיקה של TCA ELISA (ראה טבלת חומרים).

7. קביעת אינטראקציות חלבון-ליגנד באמצעות קלורימטריה איזותרמית

הערה: מערכת בדיקה זו פותחה על בסיס MicroCal PEAQ-ITC (תוכנת ITC).

  1. הכן את המאגר (50 mM חיץ Tris-HCl, pH 7.0).
  2. הכן 15 μM של NTCP במאגר.
  3. הכן 150 μM מועמדים לפתרונות מעכבי HBV במאגר.
  4. שטפו את תא הדגימה, את תא הייחוס ואת המזרק במכשיר ITC באמצעות המאגר (שלב 7.1.).
    1. הפעל את תוכנת ITC על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה במערכות Windows. תחת הכרטיסייה הפעל הדגשת ניסוי, בחר שיטת microCal עבור 19 Injection.itcm ולחץ על פתח. כאשר חלון חדש נפתח, לחץ על הכרטיסייה ניקוי, ובחלון שיטת ניקוי, בחר בלחצן 'שטיפה' עבור 'שיטת ניקוי תאים' ובלחצן 'שטיפה' עבור ' שיטת ניקוי מזרק'. לחץ על הבא ופעל לפי ההוראות שעל המסך.
      הערה: שלב הכביסה עשוי להימשך 1.4 שעות.
  5. טען את הדגימה לתוך ITC; תחת הכרטיסייה הפעל ניסוי , לחץ על הלחצן טען וקרא את ההוראות שעל המסך. לחץ על הבא ופעל לפי הוראות הווידאו עד להשלמת שלב טעינה זה.
    1. מלא את תא ההפניה במאגר פתרונות באמצעות מזרק. מלא את תא הדגימה במאגר NTCP של 15 μM באמצעות מזרק והסר את תמיסת ה- NTCP העודפת מעל תא הדגימה. מלאו את המזרק בתמיסת 150 μM של הכורכומין (ליגנד), והימנעו מבועות אוויר במזרק.
  6. הפעל את הדוגמה, ותחת הכרטיסייה הפעל ניסוי , לחץ על לחצן הפעלה . התבונן בחלונות בצד שמאל המציגים מידע ניסיוני ותפאורה ניסיונית. הזן את ריכוזי הליגנד והחלבון כ- 150 μM ב-[Syr], 15 μM ב-[Cell] ו-25 °C בטמפרטורה.
  7. בתוכנה, לחץ על התחל כדי לבצע את תהליך ההזרקה והמתן 1.4 שעות עד שהאינטראקציה בין החלבון לליגנד תושלם.
    הערה: לחצן הניתוח הדהוי מופיע מתחת לחלונות התוכנה.
  8. שים לב כי כפתור הניתוח מתבהר לאחר השלמת ההזרקה. לחץ על כפתור הניתוח בתוכנת הבקרה כדי לנתח את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת הניתוח. לחץ על סקירה כללית כדי להציג את הנתונים הגולמיים ובחר את הדגם המתאים כסט אחד של אתר כריכה.
  9. ודא שמצב האיגוד מציג את נתוני הניסוי (איגוד, ללא כריכה, בקרה או בדיקת נתונים) ושערכי הניסוי (KD, ΔG, ΔH, TΔS ו- N) מוצגים בלוח התוכנה.
  10. ייצא את הפרמטרים התרמודינמיים המנבאים את קשירת האינטראקציה, כולל קשר מימן, קשר ואן דר ואלס ואינטראקציה הידרופובית לפורמט tif או jpeg.
  11. לאחר השלמת הניסוי, שטף את תא הדגימה לאחר שלב 7.4.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע את כל הניסויים בשלושה שכפולים עצמאיים (n = 3).
  2. הצג נתונים ניסיוניים כאמצעי ± SD, ובצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי הרצויה.
  3. השתמש במבחן t של תלמידים דו-זנביים לא משויכים כדי להשוות בין שני ערכים ממוצעים או החל ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם Dunnett להשוואות מרובות בין ערכים מרובים לערך פקד. הגדר את רמת המובהקות ב- p ≤ 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נצפו תכונות של הבשלת הכבד, כולל תאים דו-צדדיים ומורפולוגיה בצורת מצולע (איור 1), במיוחד בשלב ההבחנה, imHC (איור 1A). עלייה גדולה בביטוי NTCP נמדדה ב-d-HepaRG וב-d-imHC פי 7 ופי 40, בהתאמה (איור 1B). הצורה המגולגנת מאוד של NTCP, שהונחה כמעניקה רגישות לכניסת HBV, זוהתה יותר ב-d-imHC מאשר ב-d-HepaRG (איור 1C). ה-imHC הממוין הכיל רמות NTCP גבוהות ב-65.9% בהשוואה לתאים הלא מובחנים (איור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום HBV מתחיל באמצעות זיקה נמוכה קשירה לפרוטאוגליקנים של הפראן סולפט (HSPGs) על הפטוציטים25, ולאחר מכן קשירה ל- NTCP עם הפנמה לאחר מכן באמצעות אנדוציטוזה26. מכיוון ש-NTCP הוא קולטן חיוני לכניסת HBV, ניתן לתרגם קלינית את הכניסה ל-HBV להפחתת זיהום דה נובו , העברה מאם לילד (MTCT) והישנות המחלה לאחר השתלת כבד. הפרעה לכניסת הנגיף תהיה תרופה חלופית אפשרית לזיהום כרוני ב-HBV.

כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול הנ"ל מסוכמים כאן. בעת הכנת תאים מארחים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת Mahidol והמחקר והחדשנות המדעית של תאילנד (TSRI) המוענקים בנפרד ל- A. Wongkajornsilp ו- K. Sa-ngiamsuntorn. עבודה זו נתמכה כספית על ידי המשרד הלאומי למחקר מדעי ומדיניות חדשנות באמצעות היחידה לניהול תוכניות לתחרותיות (מענק מספר C10F630093). A. Wongkajornsilp הוא זוכה במענק Chalermprakiat של הפקולטה לרפואה בית החולים סיריראג ', אוניברסיטת Mahidol. המחברים רוצים להודות למיס סאווין סימקאן (המרכז המצוין לגילוי תרופות, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת מאהידול) על עזרתה בטכניקת ITC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<קווי תאים חזקים>
תאי HepaRG,Thermo FisherHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 קו תאי הפטובלסטומה אנושיMerckSCC249
<ריאגנטים>חזקים
4% תמיסת חיץ פוספט ParaformadehydeFUJIFLIM Wako כימי163-20145
BD מאגר סלסול/שטיפהBD Biosciences554723מאגר סלסול/שטיפה
ציקלוספורין Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 מ"מ
G 418 מלח דיסולפטMerck108321-42-2
קוקטייל מעכב פרוטאז להפסיק  ללא EDTA (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA ערכות בידודGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA ערכת בידודGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II מערכת שעתוק הפוךPromegaA3800
KAPA SYBR ערכת qPCR מהירהKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X רכזTakara bioPT4421-2רכז
Luminata crescendo Western HRP מצעMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
ערכת מיצוי DNA נוקלאוספיןmacherey-nagel1806/003
פוספט חוצץ מלחMerckP3813
פוליאתילן גליקול 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
רקומביננטי NTCPשיבוט ענןRPE421Hu02
RIPA מאגר ליזה (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
ערכת TCA ElisaMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072לדלל ל-0.125%
<חזק>נוגדנים
      נוגדן נגד NTCP1Abcamab131084דילול 1:100
      נוגדן נגד GAPDHThermo Fisher ScientificAM43001:200,000 דילול
    נוגדן נגד ארנב עז מצומד HRPAbcamab2057181:10,000 דילול
    HRP עז אנטי עכבר נוגדן משניAbcamab970231:10,000 דילול
    נוגדן משני IgG נגד ארנב עיזים, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 דילול
<הרכב מגיב חזק>חזק
<חזק>1° מאגר דילול נוגדנים
        1x TBST
        3% BSASigmaA7906-100Gריכוז עבודה: 3%
        נתרן אזידסיגמא199931ריכוז עבודה: 0.05%
<חזק>הפטוציטים בינוני גידול
          DME/F12גיבקו12400-024
          10% FBSסיגמא אולדריץ'F7524
          1% עט/סטרפטוקוסHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
<חזק>כבד בינוני
          וויליאמס E בינוניסיגמא אולדריץ'W4125-1L
          10% FBSסיגמא אולדריץ'F7524
          1% עט/סטרפטוקוסHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
          5 ומיקרו; גרם/מ"ל  אינסוליןסיגמא אולדריץ'91077C-100MG
          50 ומיקרו; M הידרוקוטיזוןסיגמא אולדריץ'H0888-1g
        2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF תמיסת חסימת IF
        1x PBSGibco21300-058
        3% BSASigmaA7906-100Gריכוז עבודה: 3%
        0.2% Triton X-100SigmaT8787ריכוז עבודה: 0.2%
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188ריכוז סופי: 1X
        קוקטייל מעכב פרוטאזThermo Scientific78425ריכוז סופי: 1X
            Na3VO4ריכוז סופי: 1 mM
            PMSFריכוז סופי: 1 mM
            ריכוז סופי של NaF: 10 מ"מ
<מגיב כתם חזק>מערבי
        10x תמיסת מלח Tris-buffered (TBS)Bio-Rad170-6435ריכוז סופי: 1X
        Tween 20Merck9005-64-5
        1x TBST0.1% Tween 20
        1x PBSGibco21300-058
        ערכת בדיקת חלבון BCA PierceThermo Fisher ScientificA53225
        ג'ל פוליאקרילאמידBio-Rad161-0183
        אמוניום פרסולפט (APS)Bio-Rad161-0700ריכוז סופי: 0.05%
      TEMEDBio-Rad161-0800ג'ל מערם: 0.1%, ג'ל Resolver: 0.05%
      2x Laemmli מאגר דגימהBio-Rad161-0737ריכוז סופי: 1X
      חלבון Precision Plus תקני צבע כפולBio-Rad161-0374
<תמיסת חסימת חזק>WB/ 2° מאגר דילול נוגדנים
        1x TBST
        5% חלב רזה (חלב יבש ללא שומן)Bio-Rad170-6404ריכוז עבודה: 5%
<חזק>1x מאגר ריצה 1 ליטר
          10x תמיסת מלח Tris-buffered (TBS)Bio-Rad170-6435ריכוז סופי: 1X
        גליציןסיגמאG889814.4 גרם
        SDSMerck7910ריכוז עבודה: 0.1%
<חזק>מאגר העברת כתמים 500 מ"ל
          10x תמיסת מלח Tris-buffered (TBS)Bio-Rad170-6435ריכוז סופי: 1X
        גליציןסיגמאG88987.2 גרם
        מתנולMerck106009100 מ"ל
<חזק>תמיסת הפשטה עדינה 1 ליטרהתאימו את ה-pH ל-2.2
      גליציןסיגמאG889815 גרם
        SDSMerck79101 גרם
        Tween 20Merck9005-64-510 מ"ל
<חזק>ציוד
15 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430052
50 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430291
Airstream Class IIEsco2010621ארון בטיחות ביולוגי
CelCulture CO2 Incubatorחממת תרבית רקמות לחהשל Esco2170002
CFX96 מגע גלאי PCR בזמן אמתBio-Rad1855196
FACSציטומטר זרימה גבוההBD Biosciences651154
פיפטות בוגרות (10 מ"ל)Jet BiofilGSP010010
פיפטות בוגרות (5 מ"ל)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernאיזותרמי טיטרציה קלורימטרים
מיני PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004תא אלקטרופורזה
מיני Trans-blot נייר סינון סופגBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
בקר פיפטהEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052ספק כוח
PVDF ממברנהMerckIPVH00010
T-75 בקבוק תרבית תאיםCorning431464U
Trans-Blot SD תא העברה חצי יבשBio-Rad1703940העברה חצי יבש
מעבד אולטרסאונד (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & חומרים
ורסטי שולחן צנטריפוגה מקוררתEscoT1000Rצנטריפוגה עם דלי מתנדנד סיבובי
Scientific תא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169(2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054(2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125(2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952(2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796(2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144(2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205(2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115(2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216(2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NTCPHepaRG

מאמרים קשורים