בדיקות סטנדרטיות במבחנה כדי להמחיש ולכמת אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין סטפילוקוקוס אאורוס ביופילמים

ביופילם הוא קהילה של מיקרובים הקשורים לפני השטח או אגרגטים שאינם מחוברים העטופים בחומר פולימרי חוץ-תאי (EPS)^1,2. קהילות אלה מגינות על המיקרואורגניזמים העטופים מפני גורמי עקה סביבתיים, כולל עמידות לחומרים אנטי-מיקרוביאליים ולמערכת החיסון³. מספר מינים מיקרוביאליים פתוגניים יוצרים ביופילמים שנקשרו לזיהומים כרוניים⁴. פיתוח ביופילמים הוא תהליך מורכב הכולל חיבור למשטחים, ייצור EPS, התפשטות תאים, מבנה ביופילם וניתוק תאים⁵. ברגע שהתאים מתפזרים ויוצרים ביופילם, הם נשארים פלנקטוניים או עוברים טרנסלוקציה לתת-שכבה חדשה ומתחילים מחדש את פיתוח הביופילם⁶.

Staphylococcus aureus, פתוגן אופורטוניסטי, עוקב אחר תוכנית כללית של התפתחות ביופילם, כולל התקשרות, התפשטות, התבגרות ופיזור⁷. תהליך ההתקשרות בביופילמים של S. aureus מוכתב על ידי אינטראקציות הידרופוביות, חומצות טייכיות ורכיבי פני שטח מיקרוביאליים המזהים מולקולות מטריצת דבק (MSCRAMMs)^8,9. עם התפשטות של S. aureus מתחיל, EPS, אשר מורכב בעיקר פוליסכרידים, חלבונים, DNA חוץ-תאי, וחומצות teichoic, מיוצר⁵. כאשר רכיבי EPS מיוצרים, נוצרים גם אקסואנזימים שונים ומולקולות קטנות, מה שתורם למבנה התלת-ממדי של הביופילם ומסייע בניתוק⁵. S. aureus מנצל את אורח החיים המתואם הזה כדי לבסס זיהומים כרוניים שונים, כולל זיהומים עקב החדרת מכשירים רפואיים¹⁰.

עמיד למתיצילין S. aureus (MRSA) הוא אחד הגורמים המובילים לזיהומים הקשורים למכשירים רפואיים שוכנים, כגון צנתרים ורידיים מרכזיים ומשתנים, מפרקים תותבים, קוצבי לב, מסתמי לב מכניים והתקנים תוך רחמיים¹¹. במהלך זיהומים כאלה, נויטרופילים הם תאי החיסון המארחים הראשונים שגויסו לאתר הזיהום כדי להילחם בפתוגנים באמצעות אסטרטגיות מרובות¹². אלה כוללים פאגוציטוזה, דה-גרנולציה, ייצור חמצן תגובתי וחנקן (ROS/RNS), או שחרור של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs) לחיסול פתוגנים¹³.

יצירת ROS על פאגוציטוזה של מיקרובים היא אחת התגובות האנטי-מיקרוביאליות העיקריות שמפגינים נויטרופילים¹⁴. Phagocytosis משופרת אם חיידקים מצופים אופסונינים, במיוחד אימונוגלובולינים ורכיבים משלימים הנמצאים בסרום¹⁵. המיקרובים האופסונליים מזוהים על ידי קולטני פני השטח של התא על נויטרופילים ונבלעים, ויוצרים תא שנקרא פאגוזום¹⁵. נויטרופילים מייצרים ומשחררים ROS בפאגוזום באמצעות NADPH-אוקסידאז¹⁶ הקשור לממברנה. קומפלקס אנזימים רב-רכיבי זה מייצר אניוני סופראוקסיד על ידי העברת אלקטרונים לחמצן מולקולרי¹⁶. בנוסף, נויטרופילים גם מייצרים RNS באמצעות ביטוי של סינתאז תחמוצת החנקן (iNOS)¹⁷. לרדיקלים הגבוהים האלה של סופראוקסיד ותחמוצת החנקן בתוך הפאגוזום יש פעילות אנטי-בקטריאלית רחבה. הם יכולים לקיים אינטראקציה עם מרכזי מתכת באנזימים ולפגוע בחומצות גרעין, חלבונים וקרומי תאים של הפתוגן 18,19,20,21. מיקרובים רבים מאמצים אורח חיים של ביופילם ומשתמשים באסטרטגיות שונות כדי להתחמק מהרג על ידי^{ROS 22,23}. לפיכך, בדיקות סטנדרטיות כי זוג ביופילמים עם נויטרופילים כדי לכמת ROS מועילים לתוצאות עקביות.

בעוד שמבחנים, כגון כימות ייצור ROS של נויטרופילים, מספקים מידע על תגובות של נויטרופילים לביופילמים, היכולת לדמיין את האינטראקציות של נויטרופילים בתוך ביופילם יכולה לשמש גם ככלי רב עוצמה. השימוש בצבעים פלואורסצנטיים למיקרוסקופיה דורש לעתים קרובות אופטימיזציה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן לניתוח הדמיית מיקרוסקופיה. הגמישות לייעל תנאים מסוימים מוגבלת מכיוון שנויטרופילים יכולים לעבור מוות תאי לאחר הבידוד. יתר על כן, ביופילמים נשטפים בדרך כלל כדי להסיר את האוכלוסייה הפלנקטונית ממערך הניסויים לפני הוספת נויטרופילים. בזמן השטיפה, שונות בין ביופילמים משוכפלים עשויה להיווצר עקב אובדן ביומסה חלקית אם ביופילמים נדבקים באופן רופף לפני השטח.

באופן כללי, השיטות הקיימות כיום בתחום לניתוח אינטראקציות בין נויטרופילים לביופילמים כוללות בעיקר מיקרוסקופיה, ציטומטריה של זרימה ויחידות יוצרות מושבה (CFU) המונה^24,25,26,27. מיקרוסקופיה כוללת שימוש בצבעים שמכתימים ישירות את הנויטרופילים והביופילמים, או מכוונים לתגובות נויטרופילים שונות נגד מיקרובים כגון היווצרות NET, דה-גרנולציה ומוות תאי^25,28. תת-קבוצה של תגובות אלה, כגון מוות של תאי נויטרופילים ודה-גרנולציה, ניתנת לניתוח גם באמצעות ציטומטריה של זרימה, אך דורשת שנויטרופילים לא יהיו קשורים באופן מועדף לאגרגטים גדולים של מיקרובים בביופילם^28,29. ציטומטריה של זרימה יכולה גם לכמת כמה פרמטרים של ביופילם, כגון כדאיות התא²⁷. עם זאת, תהליכים אלה דורשים שיבוש של הביומסה של הביופילם ולא יהיה שימושי כדי לדמיין אינטראקציות חשובות אחרות כגון ההתפלגות המרחבית של נויטרופילים ומרכיביהם בתוך ביופילם^27,29,30.

הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בהתאמת חלק מהשיטות המסורתיות המשמשות לחקר אינטראקציות נויטרופילים-ביופילם על ביופילמים שעברו אופטימיזציה כדי לספק שונות מינימלית במהלך הטיפול. פרוטוקול זה מספק אפוא שיטות סטנדרטיות לגידול וכימות ביופילמים, בידוד נויטרופילים אנושיים ראשוניים מדם היקפי, כימות ייצור ROS והדמיה של אינטראקציות ביופילם-נויטרופילים באמצעות מיקרוסקופיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למערכות שונות כדי להבין אינטראקציות ביופילם-נויטרופילים תוך התחשבות בהטרוגניות בין מאגרי התורמים.

כל ההליכים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אוהיו (IRB) (2014H0154). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל התורמים לאיסוף דם היקפי לבידוד נויטרופילים אנושיים ראשוניים. סטפילוקוקוס אאורוס (USA300 LAC)³¹ שימש כאורגניזם המודל לביצוע הניסויים. הניסויים בוצעו עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE) עקב חשיפה פוטנציאלית לפתוגן הנישא בדם.

1. הכנת ביופילם במבחנה

1. השג מושבות מבודדות של S. aureus ממלאי בהקפאה 31 באמצעות טכניקת לוח פסים^32,33 על צלחת אגר עשירה בחומרים מזינים^, כגון אגר סויה טריפטית (ראו טבלת חומרים).
2. מצפים בארות בודדות של צלחת 96 בארות עם 100 μL של 0.001% (v/v) poly-L-Lysine (PLL) מדולל ב H₂O סטרילי דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. באופן אספטי, שאף את פתרון ה- PLL באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום. תנו לבארות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   הערה: כל שלבי השאיפה בפרוטוקול מבוצעים באמצעות מלכודת שאיפה בסיוע ואקום, אלא אם כן צוין אחרת.
3. הכינו תרבית לילה על ידי חיסון מושבה של S. aureus במדיה חיונית מינימלית אלפא (MEMα) בתוספת 2% גלוקוז ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 200 סל"ד במשך 16-18 שעות.
4. לדלל את תרבית הלילה על ידי העברת 50 μL ל-5 מ"ל של MEMα טרי בתוספת 2% גלוקוז ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, טלטול ב-200 סל"ד, עד לאמצע השלב הלוגריתמי, בדרך כלל בין צפיפות אופטית 600 (OD_600nm) של 0.5-0.8. השתמש ב-MEMα כדי לנרמל את התרבות הלוגריתמית האמצעית_{ל-OD 600nm} של 0.1.
5. העבר 150 μL של תרבית מנורמלת לכל באר של צלחת PLL שטופלה 96 באר. דגירה סטטית במשך 18-20 שעות בתא לחות ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לגדל את הביופילמים גם בתבניות אחרות כגון שקופיות μ ערוצים (ראה טבלת חומרים).
6. שאפו את הסופרנטנט כדי להסיר את התאים הפלנקטוניים. יש לשטוף בעדינות את הביומסה שנותרה עם 150 μL של תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס כדי להסיר את התאים שאינם מחוברים. יש להוסיף HBSS באופן טיפה כדי למנוע הפרעה לביופילם.
   הערה: בזמן שאתם שואפים את הסופרנטנט וה-HBSS במהלך השטיפה, השאירו מספיק נוזלים (סופרנטנט או HBSS) בבארות המכילות ביופילם, כך שהביופילם עדיין שקוע. זה מונע את ההפרעה של מבנה הביופילם כאשר מוסיפים HBSS טיפה כדי לשטוף את הביופילם.
7. חזור על שלב 1.6 לפחות פעמיים נוספות כדי להסיר את כל התאים הפלנקטוניים. בשלב זה, ביופילמים מוכנים לניסויים מיידיים במורד הזרם.
   הערה: אם הביופילמים אינם משמשים לניסויים בנויטרופילים, HBSS יכול להיות מוחלף בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS). HBSS מועדף על פני PBS מכיוון ש-HBSS מכיל רכיבים, כולל גלוקוז, המספקים תנאים אופטימליים להפעלת נויטרופילים³⁴.

2. כימות ביומסה של ביופילם

1. הכינו מלאי של תמיסת קריסטל ויולט (CV) של 0.1% (w/v) (ראו טבלת חומרים) על ידי המסת 20% (v/v) אתנול ו-80% (v/v) H2 O. ודאו שה-CV מומס לחלוטין באתנול לפני הוספת H₂O. סננו ועקרו את התמיסה.
2. יש להוסיף 150 μL של תמיסת CV של 0.1% לביופילם השטוף ולדגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בלפחות שלוש בארות ריקות כפקדי מדיה בלבד.
3. שאפו את תמיסת CV של 0.1% מהביופילמים ושטפו את הביופילמים המוכתמים עם 200 μL של PBS אחד. חזור על תהליך זה בסך הכל שלוש שטיפות כדי להסיר כל קורות חיים עודפים מהבארות.
4. יש להוסיף 150 μL של 33% (v/v) חומצה אצטית קרחונית מדוללת ב-H₂O. דגירה בטמפרטורת החדר על נדנדה ב-50 סל"ד למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-CV הקשור לביומסה להתמוסס לחלוטין.
   התראה: בצע שלב זה במכסה מנוע זרימה למינרית עם PPE מתאים מכיוון שחומצה אצטית קרחונית היא כימיקל קורוזיבי.
5. בינתיים, הגדר את קורא המיקרו-לוחות (ראה טבלת חומרים) כדי לקרוא את ערכי כתמי קורות החיים. לאחר טיפול בחומצה אצטית קרחונית, יש לקרוא את הצלחת באורך גל של 595 ננומטר.
   הערה: אורך הגל המשמש למדידת OD של CV יכול לנוע בין 500-600 ננומטר³⁵.

3. בידוד נויטרופילים

הערה: נויטרופילים בודדו בעקבות שיטה שפורסמה בעבר עם שינויים קלים³⁶. פרוטוקול בידוד זה משלב תחילה צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, ואחריה שקיעה דקסטרנית של 3%. חלק זה מכסה רק את פרוטוקול בידוד הנויטרופילים הכולל, תוך התמקדות בשינויים שבוצעו בפרוטוקול שפורסם. יתר על כן, הפרוטוקול המפורט להלן הוא אחת מהשיטות הרבות שיכולות לבודד נויטרופילים, וניתן להחליף אותן לפי הצורך. שיטות אחרות לבידוד נויטרופילים כוללות שימוש במדיה להפרדת תאים או הפרדת תאים מגנטית³⁷.

1. שאיבת דם מתורם מבוגר באמצעות דיקור ורי, בהתאם לפרוטוקול המפורט ב- IRB המוסדי. לפני שאיבת הדם, יש לוודא כי המזרק מכיל כמות מספקת של הפרין ללא חומרים משמרים, כך שהריכוז הסופי של הפרין הוא 20 U/mL.
2. לדלל את הדם ההיפריני עם 3/4 נפח של 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין (ראה טבלת חומרים) ב- H₂O בטמפרטורת החדר.
3. עבור כל 20 מ"ל של דגימת הדם המדוללת, aliquot 14 מ"ל של מדיום גרדיאנט צפיפות זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בצינור חרוטי טרי של 50 מ"ל. שכבה בזהירות את דגימת הדם המדוללת על גבי מדיום שיפוע הצפיפות.
4. צנטריפוגה דגימת דם שכבתית ב 400 x גרם במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. ודא שלצנטריפוגה יש הפסקה איטית כדי למנוע הפרעה לשכבה לאחר השלמת הצנטריפוגה.
   הערה: דגימת הדם תכלול חמש שכבות המכילות תערובת של מלח ופלזמה, שכבת תאים חד-גרעינית, מדיום גרדיאנט צפיפות, נויטרופילים ואריתרוציטים.
5. באמצעות פיפטה סרולוגית, שאפו את כל השכבות שמעל הנויטרופילים וכדורית כדורית כדורית הדם, ולאחר מכן הרחקה עדינה של הכדור ב 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין קר ב H₂O. עבור כל כדור שנוצר מדגימת דם של 20 מ"ל, החזירו את הכדור לנפח כולל של 20 מ"ל. הוסף נפח 1:1 של 3% דקסטרן (ראה טבלת חומרים). לדגור את הצינור זקוף במשך 18-20 דקות על קרח.
   הערה: ודא כי 3% dextran נעשה עם 0.9% NaCl ללא אנדוטוקסין ב H₂O.
6. הסר 20 מ"ל של השכבה העליונה המכילה נויטרופילים וכמה אריתרוציטים על צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל וצנטריפוגה אותו ב 355 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופר-נאטנט ומשאירים אחריו כדור אדום.
7. בעדינות להשהות את הכדור ב 10 מ"ל של קר סטרילי H₂O במשך 30 שניות כדי lyse את אריתרוציטים הנותרים. הוסיפו מיד 10 מ"ל של מי מלח קרים נטולי אנדוטוקסין 0.9% לתערובת כדי להחזיר את הטוניקה. צנטריפוגה הפתרון ב 233 x g במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. יש לשפוך את הסופר-נטנט ולהשהות את הכדור המכיל 95%-97% נויטרופילים ב-HBSS קר של 1 מ"ל לכל 20 מ"ל של דגימת הדם.
9. מעבירים 10 μL מהנויטרופילים המחיים ב-90 μL של 0.4% צבע כחול טריפאן וסופרים את התאים באמצעות המוציטומטר (ראו טבלת חומרים).
   הערה: תאים שאינם בני קיימא מוכתמים בכחול מכיוון שצבע הרחקה כחול טריפאן הוא אטום בתאים בני קיימא. פרוטוקול זה מספק >99% כדאיות תאים^37,38.
10. הוסף HBSS נוסף כך שהריכוז הסופי של נויטרופילים הוא 4 x 10^{6 תאים} למ"ל.
    הערה: במקרים עם כדאיות תאים של <99%, עדיין ניתן להשיג את הריכוז הסופי של 4 x 10^{6 תאים} למ"ל; עם זאת, הנפח הכולל של תמיסה המכילה 4 x 10^{6 תאים} / מ"ל המתקבל יקטן. ניתן להתאים את הריכוז הסופי של נויטרופילים בהתאם לצרכי הניסוי של המשתמש. הנויטרופילים הוחזרו בריכוז סופי של 4 x 10^{6 תאים} /מ"ל עבור כל הניסויים המתוארים להלן. כדי לקחת בחשבון את השונות בין תורם לתורם, מומלץ מאוד שכל הניסויים המעורבים בנויטרופילים יבוצעו עם לפחות שלושה תורמים שונים.

4. מדידת ROS המיוצרת על ידי נויטרופילים

1. יש להוסיף 100 μL של 20% סרום אנושי רגיל (מדולל ב-HBSS) באופן טיפה לביופילם השטוף (שלב 1.6) ולדגור בטמפרטורה של 37°C במצב סטטי למשך 30 דקות כדי להפוך את הביופילם לאופטימאלי.
2. שאפו את תמיסת הסרום ב-20% ושטפו את הביופילמים עם 150 מיקרוגרם של HBSS פעם אחת. שאפו את ה-HBSS, והותירו אחריהם בארות עם ביופילמים מאופרים.
   הערה: לצורך פענוח הניסוי, מומלץ לפחות ארבע קבוצות: (A) נויטרופילים + ביופילם, (B) נויטרופילים + PMA (בקרה חיובית, ראו טבלת חומרים), (C) נויטרופילים בלבד, ו-(D) ביופילם בלבד.
3. הוסף לומינול (ראו טבלת חומרים) לנויטרופילים שעברו החייאה ב-HBSS בריכוז של 4 x 10^{6 תאים} /מ"ל, כך שריכוז הלומינול הסופי הוא 50 מיקרומטר. פתרון זה מוכן לשימוש עבור קבוצות (A) ו- (C). הוסף 4 x 10⁵ נויטרופילים מעורבבים עם לומינול לבארות עם ביופילמים opsonized.
4. בצינור נפרד, הכינו תמיסת לומינול של 50 מיקרומטר ב-HBSS ללא נויטרופילים והוסיפו אותה לביופילם המכיל היטב (קבוצה D).
5. Aliquot 350 μL של נויטרופילים מעורבבים עם לומינול ומוסיפים פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) בריכוז סופי של 500 ng/mL לתערובת. עבור קבוצה (B), הוסף 4 x 10⁵ נויטרופילים מתערובת זו לבארות ללא ביופילם. זה משמש שליטה חיובית.
   הערה: ריכוז ה-PMA המצוין בשלב זה גבוה יחסית כדי להבטיח תגובת פרץ חזקה מכיוון שנויטרופילים מעוררי PMA הם שליטה חיובית. ניתן להשתמש ב-PMA בריכוז נמוך יותר כדי להפעיל נויטרופילים, בהתאם לניסוי.
6. צנטריפוגה את הצלחת ב 270 x גרם במשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס.
7. ודא שקורא הלוחות מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס יחד עם ההגדרה לזוהר וקריאה קינטית למשך 60 דקות במרווחים של 3 דקות. הניחו את הצלחת בקורא הצלחות כדי למדוד את ייצור ה-ROS על ידי נויטרופילים למשך 60 דקות.
   הערה: עבור בדיקה זו, ביופילמים גודלו בלוחות לבנים המשמשים לבדיקות זוהר. PMA הוא אגוניסט ידוע לתגובת פרץ חמצונית³⁹. בעת ביצוע מחקרים הכוללים PMA, ודא כי PMA מתווסף בשלב הסופי בזמן שהתמיסה המכילה נויטרופילים קרה מכיוון ש- PMA יוזם מיד את תגובת ההתפרצות.

5. הדמיית אינטראקציות ביופילם-נויטרופילים

1. הגדר ביופילם באמצעות שלבים 1.2-1.6. כדי להקל על הדמיית ביופילם, השתמשו בזן פלואורסצנטי של S. aureus, כגון USA300 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)^40,41, כדי להגביר את הקלות של הדמיית מיקרוסקופיה.
   הערה: נעשה שימוש בשקופית בת 6 μ ערוצים (ראה טבלת חומרים) במקום בלוח של 96 בארות כדי להדגים את מודל הביופילם במבחנה (שלב 1).
2. דגירה של 4 x 10^{6 תאים} /מ"ל של נויטרופילים עם 100 מיקרומטר של צבע CMAC כחול (7-אמינו-4-כלורומתילקומרין) (BCD, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בנדנדה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. ודא שהדגימות דוגרות בחושך והגבל את החשיפה לאור בצעדים הנותרים.
3. כדי לשטוף עודף BCD, נויטרופילים צנטריפוגה ב 270 x גרם במשך 5 דקות ולשאוף supernatant. יש להשעות את הנויטרופילים ב-HBSS טרי. בשלב זה, הוסיפו אתידיום הומודימר-1 (ראו טבלת חומרים) לנויטרופילים המוכתמים ב-BCD בריכוז סופי של 4 מיקרומטר כדי לנטר נויטרופילים ומוות חיידקי.
4. הוסף 150 μL של נויטרופילים לביופילם S. aureus שגדל בשקופיות μ, כך שיחס הנויטרופילים לחיידקים הוא 1:30 (נויטרופיל: חיידקים). דגרו את מגלשות μ בתא לח למשך 30 דקות. מספר תאי החיידקים מבוסס על ספירות התאים המתקבלות מציפוי ביופילם של 18 שעות.
5. דמיינו את האינטראקציה בין נויטרופיל לביופילם באמצעות תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לאורכי הגל של העירור והפליטה של הצבעים/חלבונים הפלואורסצנטיים.
   הערה: עבור המחקר הנוכחי, BCD הוא 353/466 ננומטר, אתידיום הומודימר-1 הוא 528/617 ננומטר, ו- GFP הוא 395/509 ננומטר. הגבל את החשיפה של הדגימה ללייזר או לאור כדי למנוע הלבנה של הדגימות.
6. נתח את התמונות באמצעות תוכנות ניתוח תמונות מיקרוסקופיה או תוכנות כגון FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ ו- BAIT, בין^{רבים אחרים 42,43,44,45}.
   הערה: כאשר עובדים עם כתמים, חשוב לקחת בחשבון את הספציפיות של הצבעים בשימוש. חלק מהכתמים פועלים על תאים פרוקריוטים ואאוקריוטים, בעוד שאחרים עובדים רק על אחד. אם נויטרופילים וביופילמים מוכתמים בנפרד באמצעות צבעים שיכולים להכתים את שני סוגי התאים, הקפידו לשטוף את כל הצבעים שנותרו לפני שילוב של נויטרופילים וביופילמים כדי למנוע צביעה צולבת.

המדיה המשמשת לגידול ביופילמים חיידקיים משפיעה על הישרדותם של נויטרופילים. מדיות שונות נבדקו כדי להפחית את ההשפעה של מדיה בלבד על הכדאיות של נויטרופילים לחקר אינטראקציות נויטרופיל-ביופילם (איור 1). מדיית צמיחה חיידקית כגון מרק סויה טריפטי ממזערת את הכדאיות של נויטרופילים, כך ש~ 60% מהנויטרופילים חיים לאחר תקופת דגירה של 30 דקות ב -37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. מדיה של תרביות תאים של יונקים, כגון MEMα, אינה משפיעה על הכדאיות של נויטרופילים ותומכת בצמיחה של ביופילמים של S. aureus. למעשה, מדיה מינימלית מקדמת צמיחה חזקה של ביופילמים בחיידקים אחרים46,47.

כדי להעריך את השפעת המדיה על גדילת הביופילם ואת השונות בכימות הביומסה של ביופילם לאחר שטיפת הביומסה כדי לחסל תאים פלנקטוניים, גדל ביופילם של 18 שעות S. aureus בצלחת של 96 בארות, כאשר בארות טופלו או לא טופלו בפולי-ל-ליזין. במדיה עשירה בחומרים מזינים (מרק סויה טריפטי (TSB)) ובמדיה מינימלית (MEMα) נעשה שימוש כפי שהוא או בתוספת 2% גלוקוז. הביומסה של הביופילם שהוכתמה ב-CV גילתה שביופילם S. aureus שגדל ב-MEMα בתוספת 2% גלוקוז הפיק את הביופילם החזק ביותר מבין כל המדיות שנבדקו (איור 2A). יתר על כן, ביופילמים שגודלו בבארות PLL שטופלו מראש המכילות MEMα + 2% גלוקוז הראו שונות פחותה מאשר ביופילמים בבארות לא מטופלות PLL המכילות MEMα + 2% גלוקוז. ביופילמים אלה הראו פחות שונות בכימות באמצעות בדיקת CV35 וה-CFU/mL כאשר הם מצופים לאחר טיפול מדויק בביופילמים לכימות ביומסה. הביופילמים האלה הכילו, בממוצע, 1 x 108 CFU/mL, כפי שהוכח על-ידי ציפוי הביופילמים בשלושה ימים נפרדים (איור 2B). מספר זה שימושי בקביעת מספר הנויטרופילים שיש להוסיף לביופילמים עבור מבחני פונקציונליות נויטרופילים.

כדי למדוד את ייצור ה-ROS על ידי נויטרופילים בתגובה לביופילמים, הביופילמים של S. aureus גודלו באופן סטטי במשך 18-20 שעות בלוח של 96 בארות. לאחר מכן נוספו ביופילמים, ונוספו נויטרופילים. לאחר מכן נמדד ייצור ROS במשך 60 דקות (איור 3A). השטח שמתחת לעקומה מחושב מהעקומה הקינטית כדי לכמת את סך ייצור ה-ROS על ידי נויטרופילים. נויטרופילים המטופלים באגוניסט, כגון PMA, המשמשים כבקרה, מראים ייצור ROS מוגבר. בהיעדר ביופילמים, נויטרופילים שטופלו ב-PMA הראו ייצור ROS חזק. בנוכחות ביופילם S. aureus , הייצור הכולל של ROS על ידי נויטרופילים שטופלו ב- PMA ירד. בהיעדר PMA, נויטרופילים מסתמכים אך ורק על האינטראקציה שלהם עם הביופילם, מה שמפחית עוד יותר את כמות ה-ROS המיוצרת (איור 3B).

כדי להמחיש את יחסי הגומלין בין נויטרופיל לביופילם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, נעשה שימוש בזן המבטא GFP של S. aureus, צבע CMAC כחול ואתידיום הומודימר-1, המכתיים את הציטופלסמה של תאים חיים ודנ"א של תאים מתים, בהתאמה. הביופילם S. aureus גודל במשך 18 שעות בשקופית של 6 μ ערוצים. נויטרופילים המסומנים בצבע כחול CMAC נוספו יחד עם אתידיום הומודימר-1 לביופילמים השטופים והודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לפני ההדמיה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה גילתה שנויטרופילים רבים היו ממוקמים על פני השטח של ביופילמים מסוג S. aureus, בעוד שכמה מהם נמצאים בתוך הביופילם (איור 4A). האינטראקציה בין תאי S. aureus בתוך נויטרופילים נראתה גם היא (איור 4C). רוב תאי S. aureus שקיימו אינטראקציה עם נויטרופילים (ציאן) היו מתים (מגנטה), בעוד שכמה מהם נשארו חיים (צהובים) כפי שנקבע על-ידי צביעת מתים חיים (איור 4C). לשם השוואה, ביופילמים של S. aureus המבטאים GFP הוכתמו באתידיום הומודימר-1, שחשף שבריר מאוכלוסיית S. aureus המתה בתוך הביופילם (איור 4B). נויטרופילים שאינם בני קיימא שהיו חיוביים לאתידיום הומודימר-1 כומתו באמצעות תוכנת אנליזה (ראו טבלת חומרים) לאחר דגירה עם ביופילמים של S. aureus. כ-48% מהנויטרופילים כבר היו מתים תוך 30 דקות מהדגירה עם ביופילם S. aureus. במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול המיקרוסקופיה, הוערכה גם ההשפעה של שטיפת הביופילם והנויטרופילים לאחר 30 דקות של דגירה כדי להסיר נויטרופילים שאינם דבקים, וגילתה שכ-33% מהנויטרופילים המתים עדיין מחוברים לביופילם (איור 4D).

איור 1: בדיקת LIVE-DEAD משווה את הישרדות הנויטרופילים בין אמצעי גדילה של חיידקים ויונקים. נויטרופילים בודדו ודוגרו ב-HBSS, MEMα, TSB או 0.1% SDS במשך 30 דקות. אחוז הנויטרופילים החיים נקבע, כאשר נויטרופילים מודגרים של HBSS טופלו כ-100% נויטרופילים חיים. התוצאות מייצגות בממוצע שני ניסויים בלתי תלויים שבוצעו במשולש, כאשר נויטרופילים מתקבלים משני תורמים שונים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (*p < 0.05, ****p < 0.0001. ANOVA חד כיוונית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: כימות של ביומסה של ביופילם בתנאים שונים וספירת הכדאיות של חיידקים של ביופילמים שגדלו בתנאים הממוטבים. (A) S. aureus נזרע בצלחת בת 96 בארות מצופה או לא מצופה בפולי-ל-ליזין (PLL). ביופילמים גודלו ב-TSB, ב-MEMα או בכל אחד מחומרי ההדפסה בתוספת 2% גלוקוז בתנאים סטטיים במשך 18 שעות. צביעת קריסטל סגול (CV) בוצעה כדי להכתים ביומסה של ביופילם. כתם קורות החיים המלוטש דולל בשעה 1:10 ונקרא בקורא מיקרו-לוחית. התוצאות מייצגות בממוצע שלושה ניסויים בלתי תלויים שבוצעו במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ה-SD של כל קבוצה מוצג בתחתית כדי להדגים שונות בתנאי הגידול של ביופילם. (B) ספירות CFU של חיידקים התקבלו מביופילמים שגודלו בתווך אופטימלי (MEMα + 2% גלוקוז). הביופילמים הסטטיים של 18 שעות היו נתונים למספר זהה של שטיפות ואחריהן סוניקציה של 10 דקות כדי לשחרר את הביומסה של הביופילם ועברו דרך מחט 22G כדי לשבש את האגרגטים לפני הציפוי. התוצאות מייצגות שלושה שכפולים המבוצעים במשולש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (ns = לא משמעותי. ANOVA חד כיוונית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: כימות ייצור ROS על-ידי נויטרופילים באמצעות בדיקת כימילומינסנציה. (A) נויטרופילים (PMN) דוגרו עם ביופילמים מסוג S. aureus (BF) שנשטפו על ידי HBSS בנוכחות (משולש אפור סגור) או בהיעדר (משולש אפור הפוך פתוח) של PMA כדי למדוד את ייצור ROS על ידי נויטרופילים. Luminol שימש כדי לזהות ROS כל 3 דקות במשך 60 דקות בקורא microplate. בעוד שנויטרופילים שטופלו ב-PMA בהיעדר ביופילם (עיגול שחור סגור) שימשו כבקרה חיובית, קבוצות נויטרופילים בלבד (עיגול שחור פתוח) וביופילם בלבד (משולש אפור פתוח) שימשו כבקרות שליליות. הנתונים מייצגים בממוצע שני ניסויים בלתי תלויים שבוצעו במשולש עם נויטרופילים שהתקבלו משני תורמים שונים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. (B) השטח שמתחת לעקומה מ-(A) חושב כדי לכמת את סך ה-ROS שנוצר על ידי הנויטרופילים. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. (***p < 0.0001. ANOVA חד כיוונית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: הדמיה של האינטראקציה בין ביופילם S. aureus ונויטרופילים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. נויטרופילים המסומנים בצבע כחול CMAC (ציאן) נוספו עם אתידיום הומודימר-1 (מג'נטה; מת) לפני הדגירה עם ביופילם S. aureus באורך 18 שעות (צהוב). אינטראקציות ביופילם-נויטרופילים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה ותמונות שעובדו באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. ניסויים נערכו עם שלושה תורמים שונים. תמונות מייצגות מוצגות כ- (A) תצוגה תלת-ממדית של ביופילם S. aureus עם נויטרופילים חיים (ציאן) ומתים (מגנטה; כמה מהם מסומנים בחצים לבנים), (B) תצוגה תלת-ממדית של ביופילם S. aureus בהיעדר נויטרופילים עם S. aureus חי המבטא GFP (צהוב) או מת S. aureus מוכתם באתידיום הומודימר-1 (מגנטה), (C) מבט אורתוגונלי של S. aureus ואינטראקציה בין נויטרופילים כפי שהיא מתוארת במישורי xy, yz ו-xz, ו-(D) כימות של כדאיות נויטרופילים בנוכחות ביופילם S. aureus לאחר 30 דקות מיד (לא שטוף) או לאחר שלושה סבבים של שטיפות עם HBSS כדי להסיר נויטרופילים שאינם דבקים (שטפים). מוות תאי נויטרופילים מוצג כממוצע ± SD (מבחן t של התלמיד). סרגל קנה מידה מציין 50 מיקרומטר אינץ' (A) ו- (B) ו- 10 μm אינץ' (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

למחברים אין מה לחשוף.