מאמר שיטה

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

DOI:

10.3791/63799

⸱

27 ביוני 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך התפתחות בעלי חוליות, תאי פסגה עצביים (NCCs) נודדים באופן נרחב ומתמיינים לסוגי תאים שונים התורמים למבנים כמו השלד הקרניופציאלי ומערכת העצבים ההיקפית. בעוד שזה קריטי להבין את נדידת NCC בהקשר של עובר תלת-ממדי, בידוד תאים נודדים בתרבית דו-ממדית מקל על הדמיה ואפיון פונקציונלי, ומשלים מחקרים עובריים. הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים של אפרוחים כדי ליצור תרביות NCC ראשוניות. NCCs נודדים מגיחים מתוך צמחי קפלים עצביים המצופים על מצע מצופה פיברונקטין. התוצאה היא אוכלוסיות NCC מפוזרות ודבקות שניתן להעריך על ידי כתמים וניתוחים מורפולוגיים כמותיים. גישה תרבותית פשוטה זו ניתנת להתאמה רבה וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות. לדוגמה, הגירה של NCC והתנהגויות נדידה יכולות להיות מוערכות על ידי הדמיה בהילוך מהיר או על ידי שאילתה תפקודית על ידי הכללת מעכבים או מניפולציות ניסיוניות של ביטוי גנים (למשל, דנ"א, מורפולינו או אלקטרופורציה של קריספר). בגלל הרבגוניות שלה, שיטה זו מספקת מערכת רבת עוצמה לחקר התפתחות NCC גולגולתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי פסגה עצביים (NCCs) הם אוכלוסיית תאים חולפת בעוברים בעלי חוליות. NCCs מוגדרים בגבולות הלוח העצבי ועוברים מעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT) כדי לנדוד מהצינור העצבי הגבי1. לאחר EMT, NCCs מתפזרים באופן נרחב ברחבי העובר, ובסופו של דבר מבדילים ותורמים למבנים שונים, כולל השלד הקרניופציאלי, דרכי היציאה של הלב, ורוב מערכת העצבים ההיקפית2. שינויים בקוטביות התא, בשלד הציטוסקולרי ובתכונות ההידבקות עומדים בבסיס המעבר הזה מאוכלוסיית תאים נודדיםלאוכלוסיית תאים נודדים 3. חקר NCC EMT והגירה מספק תובנות על מנגנונים בסיסיים של תנועתיות תאים ומודיע על המאמצים למנוע ולטפל במומים מולדים וגרורות סרטניות.

בעוד שניתוח in vivo חיוני להבנת תהליכים התפתחותיים של NCC בהקשר עוברי, שיטות in vitro מציעות נגישות חזותית ופיזית המאפשרת אפיקים ניסיוניים נוספים. בסביבה דו-ממדית פשוטה, ניתן להעריך מורפולוגיה של NCC, מבנים ציטוסקטליים ומרחק שהועבר. יתר על כן, ניתן לנתח את ההשפעות של הפרעה גנטית או גורם מסיס על התנהגויות נודדות של NCCs תנועתיים 4,5,6,7,8,9,10. בנוסף, ניתן לאסוף, לאגד ולהשתמש ב-NCCs טרום-מבודדים או נודדים עבור מתודולוגיות בעלות תפוקה גבוהה כדי לחקור את הוויסות ההתפתחותי של NCCs באמצעות פרופילים פרוטאומיים, תעתיקיים ואפיגנומיים 7,11. בעוד שקיימות שיטות להכנת NCCs גולגולתיים מאורגניזמי מודל התפתחותיים שונים12,13,14, מאמר זה מדגים את המכניקה של הגישה עבור אלה שלומדים לראשונה לתרבית NCC גולגולתי מעוברי אפרוחים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה רב-תכליתית להכנת תרביות NCC גולגולתיות של אפרוחים (איור 1). מאחר ש-NCCs נודדים בקלות מקפלים עצביים מושתלים אל מצע תרבית, NCCs של אפרוחים נפרדים באופן טבעי מרקמה עוברית, ותרביות ראשוניות נוצרות בקלות. כאשר NCCs של המוח האמצעי נודדים בהמוניהם מהקפלים העצביים הגולגולתיים (בניגוד לדלמינציה הממושכת, תא אחר תא, בתא המטען15), תרביות אלה מורכבות בעיקר מתאי צמרת עצבית גולגולתיים נודדים, כאשר כריתה ראשונית של קפל עצבי מספקת שיטת איסוף עבור NCCs קדם-מגרטוריים. מפורטת שיטה בסיסית לניתוח וגידול קפלים עצביים גולגולתיים של אפרוחים, ומוצעות הצעות ליישומים שונים ווריאציות על שיטה זו.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול תרבית הקיפול העצבי הגולגולתי של אפרוחים. (A,B) קפלים עצביים גולגולתיים (מסומנים בכחול) נכרתים מעובר אפרוח עם חמישה סומיטים (מוצג במבט הגבי ב-A). פסים אפורים, סהר לבבי. (C) כאשר הם מצופים על פיברונקטין, תאי פסגה עצביים נודדים מגיחים מהקפלים העצביים ומתפזרים על המצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש בכל מגוון של גזעי גאלוס גאלוס , כולל לגהורן לבן, קישור מין זהוב או אדום רוד איילנד. ביצי התרנגולת ששימשו במחקר הנוכחי היו מגזעים שונים והתקבלו ממקורות רבים, כולל חוות מקומיות ומדגרות.

1. הכנת פתרונות וחומרים

  1. הכן את הפתרון של רינגר על ידי ערבוב 123.3 mM NaCl, 1.53 mM CaCl 2, 4.96 mM KCl, 0.809 mM Na 2 HPO 4, ו- 0.147 mM KH2 PO4 (ראה טבלת חומרים). התאם את ה-pH ל-7.4 וסנן את העיקור לבקבוקים של 100 מ"ל. יש לאחסן במקום נקי ויבש. אין לשטוף בקבוקים עם סבון (התייחסו אליהם כאל כלי זכוכית מתרבית רקמות).
  2. יש להכין תמיסת מלאי פיברונקטין (FN) של 1 מ"ג/מ"ל (ראה טבלת חומרים) על ידי המסת FN בתמיסה סטרילית של רינגר ולאחסן ב-100 μL aliquots בטמפרטורה של -80°C (יציבה למשך 4 שנים לפחות).
  3. הכינו מדיית תרבית מלאה על ידי הוספת מצע L15 עם 0.8% L-גלוטמין, 0.08% פניצילין/סטרפטומיצין, 10% FBS ו-10% תמצית עובר של אפרוח12. צור 3 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 °C או -80 °C.
    הערה: אם תרביות דוגרות בחממת CO2 , יש להחליף את DMEM/F12 ב-L15, שהוא מאגר לאוויר.
  4. הכינו תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS אחד. התאם את ה-pH ל-7.4. צור 10 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (70 °F).
    התראה: יש לטפל בפרפורמלדהיד במכסה אדים.
  5. הכן מסגרות תמיכה בנייר סינון (כ-1 ס"מ x 1.5 ס"מ מלבני נייר עם שניים או שלושה חורים מנוקבים חופפים בציר הארוך).
    1. נקב חורים לאורך הקצה של פיסת נייר סינון גדולה באמצעות ניקוב סטנדרטי של שלושה חורים, חתוך / חתוך את הקצה המנוקב לרצועה, ולאחר מכן חתוך את הרצועה בין החורים למלבנים ~ 1.5 ס"מ אורך. ניירות סינון Autoclave לפני השימוש (אופציונלי).
  6. אספו כלי נתיחה, כולל מלקחיים עדינים , מלקחיים קהים, מספריים לנתיחה, מספריים קפיצים ומחטי טונגסטן מושחזות16.

2. דגירה של עוברים

  1. להשיג ביציות מופרות מכל אחד מהמקורות שהוזכרו לעיל.
  2. מניחים את הביצים המופרות במצב זקוף (ציר ארוך של הביצית אנכית כשהקצה המחודד כלפי מטה/צד קהה כלפי מעלה) בתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס (100 מעלות פרנהייט).
  3. דגירה עד שנוצרו ארבעה עד שבעה סומיטים (שלבים 8+-9)17, אשר לוקח בערך 35 שעות.
    הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם לזן, גיל התרנגולות, העונה וכו ', ויש לקבוע זאת באופן ניסיוני. טיימרים הניתנים לתכנות ליציאה שימושיים לייזום דגירה במהלך הלילה כדי להשיג את התזמון הרצוי.
  4. לאחר הסרת מן האינקובטור, לרסס ביסודיות את הביצים עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש כדי לחטא את הקליפות.
    הערה: ניתן לאסוף עוברים באופן מיידי, אך מתן אפשרות לביצים להתקרר לטמפרטורת החדר מפחית את שבריריות החלמונים ואת אובדן העובר במהלך האיסוף.

3. הכנת מנות תרבות

  1. בחר מנות תרבית קיפול עצבי (ראה טבלת חומרים) המתאימות ליישום במורד הזרם.
    1. עבור תרביות שיהיו קבועות ומוכתמות, השתמשו בכיסויי זכוכית שהוכנסו לתוך כלי תרבית רקמה מרובי בארות.
      הערה: כיסויים התואמים את גודל הבאר יזוזו פחות עם ערבוב נוזלים, מה שיפחית את הסבירות שצמחים יזוזו וסביר יותר להידבק לכיסוי ולא לתחתית המנה.
    2. בחר בכלים בעלי תחתית זכוכית בודדת או בתאים מחולקים (ראו טבלת חומרים) להדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
    3. להדמיה חיה במיקרוסקופ זקוף או סטריאופוני, השתמש בלוחות תרבית רקמה מתאימים היטב ל-6, 12 או 24.
    4. בחר מנות תרבית רקמה מפלסטיק לאיסוף המוני של תאי פסגה עצביים נודדים לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה.
  2. הוסיפו 10 U/mL של פניצילין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין לבקבוק של 100 מ"ל של תמיסה סטרילית של רינגר (לדוגמה, 100 μL של 10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, כדי ליצור את ה-P/S של רינגר). יש להשתמש ב-P/S של רינגר תוך שבוע.
  3. להפשיר אליקוט של 1 מ"ג/מ"ל של FN על קרח. יש לדלל עם P/S של רינגר לריכוז של 10-100 מיקרוגרם/מ"ל של FN.
  4. תמיסת FN מספקת כדי לכסות את תחתית הבאר או המנה. לדוגמה, 100 μL לכל באר בצלחת 24 באר, 500 μL עבור צלחת 35 מ"מ.
  5. החליפו את המכסה והדגירו כלים או צלחות בתמיסת FN באינקובטור לח (או במגש מכוסה במגבות נייר מזוקקות ספוגות במים) בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס (100 מעלות פרנהייט) למשך שעה אחת לפחות תוך ניתוח קפלים עצביים.

4. בידוד עוברי אפרוחים

  1. הקפידו לשמור על כיוון הביצית (העובר צף לראש החלמון במהלך הדגירה). השתמשו במספריים או במלקחיים קהים כדי לתקוע חור קטן בקליפה, בערך 1/4-1/3 מהדרך לאורך הביצה.
    1. הכניסו בזהירות את קצה המספריים או המלקחיים הקהים לתוך החור הקטן, תוך הקפדה שלא להפריע לחלמון, וחתכו את קליפת הביצה סביב הביצה, והסירו את החלק העליון של קליפת הביצה (איור 2A).
  2. מקם את העובר לבידוד.
    הערה: אם העובר אינו ממוקם באופן אידיאלי בגביע הקליפה, השתמש במלקחיים קהים כדי להפוך בזהירות את החלמון, כך שהעובר יהיה בחלק העליון. לחלופין, מוזגים את החלמון לתוך יד מכוסה כפפות, נזהרים לא לשבור את החלמון ומאפשרים לאלבומין להתנקז החוצה (איור 2B). לאחר מכן, ניתן למקם את העובר על ידי הזזת החלמון מיד ליד.
  3. הכינו את העובר על ידי שימוש עדין בקצה השטוח של מלקחיים קהים סגורים כדי לנגב את עודפי האלבומין שנותרו על פני השטח של החלמון המכסים את העובר (איור 2C). ניתן להסיר עודפי אלבומין גם בלחץ עדין עם מגב משימות עדין.
    הערה: לאחר פינוי האלבומין, פני השטח של החלמון צריכים להיראות בעלי מרקם במקום חלקים. אי מחיקה של אלבומין מספיק תעכב את ההידבקות של תמיכת נייר הסינון בסעיף 4, שלב 4.
  4. השתמש במלקחיים כדי למקם מסגרת תמיכה בנייר סינון מעל העובר, כאשר העובר נמצא בחלון המסגרת. לחצו בעדינות על נייר הסינון כדי להדביק אותו על החלמון.
  5. גזור מסביב לחלק החיצוני של מסגרת נייר הסינון באמצעות מספריים לנתיחה (איור 2D). השתמשו במלקחיים או בקצות מספריים כדי לתפוס את קצה המסגרת ולהרים בעדינות את העובר הרחק מהחלמון (איור 2E). הרמה בזווית תסייע להסיר את העובר בצורה נקייה מהחלמון.
  6. הניחו את העובר כשמסגרת הנייר כלפי מטה (צד הגחון של העובר כלפי מעלה) לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ או 100 מ"מ מלאה ב-P/S של רינגר (איור 2F). יש לשמור את צלחת העוברים על הקרח אם הם נאספים עבור יישום רגיש ל-RNA או לחלבון במורד הזרם.
    הערה: אי הנחת עוברים בצד הגחון כלפי מעלה עלולה לנתק אותם ממסגרות הנייר שלהם. ניתן לאסוף ולאחסן עוברים מרובים ב-P/S של רינגר למשך עד שעה לפני המעבר לשלבי הדיסקציה של הקפל העצבי.

5. כריתת קפלים עצביים

  1. העבירו את העובר לכלי נקי המכיל את תמיסת ה-P/S של רינגר ושטפו את העובר על ידי החזקת מסגרת נייר הסינון עם מלקחיים וסיבוב עדין קדימה ואחורה כדי לפנות כל חלמון שמטשטש את ראיית העובר. מחליפים את ה-P/S של הצלצול או מעבירים למנה טרייה אם היא הופכת מעוננת.
  2. מקמו את הצד הגבי של העובר/מסגרת כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ מנתח. השארת העובר על מסגרת הנייר כדי לשמור אותו מתוח מתוח ומוחזק במקומו, להסיר את קרום vitelline באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את הקפלים העצביים.
    הערה: אם העובר נופל ממסגרת הנייר, ניתן להניח אותו שטוח בצלחת או להצמיד אותו לצלחת מצופה סילגרד18 לצורך דיסקציה.
  3. באמצעות מספריים קפיציים או מחט טונגסטן מחודדת, יש לכרות בזהירות את הקפלים העצביים של המוח האמצעי. כלול רקמת קאודל לשלפוחית האופטית המתרחבת ורוסטרל למוח האחורי, שם התכווצויות רומבומירים רק מתחילות להופיע (הסהר הלבבי הוא גם אינדיקטור שימושי, איור 3B,C). הקפידו לכרות את ההיבט הגבי ביותר של הקפל העצבי עם מינימום זיהום של התעלה העצבית ואקטודרם לא עצבי (איור 3C).
  4. מעבירים את הקפלים העצביים לכלי נקי המכיל את ה-P/S של רינגר באמצעות פיפטור P20 או פיפטה סטרילית מזכוכית פסטר שטופה ב-P/S של יולקי רינגר (זה חוסם את הפלסטיק או הזכוכית כדי למנוע מהרקמה להידבק). יש לאחסן קפלים שנאספו על קרח תוך ניתוח קפלים נוספים.

6. ציפוי קפלים עצביים

  1. הפשרה של תקשורת תרבותית שלמה (סעיף 1, שלב 3). יש להוסיף 100 U/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין ולסנן את העיקור. יש לשמור על מדיה מוכנה בטמפרטורה של 37-38 מעלות צלזיוס תוך ביצוע שלבים אחרים.
  2. הסר כלי תרבות מהאינקובטור (סעיף 3, שלב 5). באמצעות פיפטור או פיפטה פסטר, הסר את תמיסת ה- FN מכיסויים, כלים או בארות. לאחר שטיפת המצע המצופה FN ב-P/S של רינגר, הוסיפו נפח מתאים של מדיית תרבית שלמה למנות או לבארות (500 מיקרון לבארות בצלחת של 24 בארות, 2 מ"ל לצלחת של 35 מ"מ או לצלחת של שש בארות).
    הערה: נפחים קטנים יותר יכולים לשמר ריאגנטים יקרים (למשל, עד 200 μL עבור צלחת של 24 בארות) אך להבטיח שהמנה לחה מספיק כדי למנוע אידוי.
  3. באמצעות פיפטור p20 או p200, ראשית, שטפו את קצה הפיפטה עם P/S של yolky Ringer כדי לחסום את הפלסטיק ולמנוע את הידבקות הרקמה. לאחר מכן, העבירו את הקפלים העצביים המבודדים על גבי הכיסויים המצופים ב-FN, תוך הקפדה על העברת P/S של רינגר קטן ככל האפשר. הניחו את הקיפולים לכיוון מרכז הכיסוי המצופה ב-FN.
    הערה: ניתן לצפות קפל עצבי אחד או כמה קפלים עצביים על מכסה בקוטר 12 מ"מ בבאר של 19 מ"מ, עד 50 על צלחת של 35 מ"מ.
  4. לאחר שאפשרתם לצמחים להסתפק במשך 10-15 דקות, הכניסו אותם לתא לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס (100 מעלות פרנהייט) על ידי נשיאה איטית וזהירה של כלי התרבית עם קפלים עצביים מצופים. זה ימזער את הסטת הקפלים העצביים בבארות, ויבטיח שהם יישארו מפוזרים וידבקו בכל כיסוי.
    הערה: בעת שימוש ב-L15 (לא DMEM), ניתן גם לדגור כלים מתרבית של צמחים באינקובטור ביצים באמצעות מגש מכוסה עם מגבות נייר לחות.
  5. דגירה של תרביות קפלים עצביים באינקובטור הלח למשך הנדידה הפעילה (כ-16-20 שעות בסך הכל, איור 4).

7. תיקון והכתמה של NCCs נודדים מתורבתים לניתוח מורפולוגי

  1. הסר את מדיית התרבות עם פיפטה של פסטר ושטוף את הבארות עם PBS 1x מעוקר במסנן.
  2. יש להוסיף 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לקבוע את זמן הקיבוע באופן ניסיוני. ניתן גם להוסיף paraformaldehyde ישירות למדיה במשך 10 דקות (50:50), להסיר, ולהחליף עם 4% paraformaldehyde undiluted במשך 10 דקות כדי לשמור על מבנים תאיים עדינים יותר.
  3. יש להסיר את הפרפורמלדהיד ולשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד.
  4. כתם קבוע NCCs עם צבע מתאים להערכה מורפולוגית. כדוגמה, מכתים עם פלואידין מצומד ירוק אורגון מפורט כאן.
    הערה: הדמיה של שלד האקטין עם phalloidin19 חושפת את המורכבות המבנית של NCC נודד עם עוצמת מכתים אחידה יחסית; עם זאת, ייתכן שפלואידין לא ידגיש את כל אזורי התאים. ניתן להשתמש גם בצבעים המסמנים את קרום הפלזמה (למשל, אגלוטינין נבט חיטה או DiI) או ציטופלסמה, אך מסבכים את ההדמיה של בליטות עדינות ביחס לגוף התא המכתיים בבהירות. בנוסף, אימונופלואורסצנציה יכולה להתבצע במקביל כדי לסמן תאי פסגה עצביים עם HNK-1 או כדי לקבוע את לוקליזציה תת-תאית של חלבון בעל עניין 7,20.
    1. יש להסיר את שטיפת ה-PBS הסופית ולהוסיף PBS + 0.5% Triton X-100 (PBST) + סרום 5% (FBS או מבעל חיים אחר המתאים לשילוב נוגדן) כדי לכסות את הכיסויים ולדגור במשך 10 דקות על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר.
    2. Pipet 200 nM של אורגון גרין מצומד פאלוידין (מדולל ב- PBST + 5% סרום) על משטח חלק (כגון סרט איטום פרפין גמיש) עבור כל כיסוי. עבור כיסוי 12 מ"מ, פיפטה נפח 30 μL.
    3. באמצעות זוג מלקחיים, הסר את כיסוי הסרום PBST + 5%, תוך הקפדה על שמירה על כיוון התאים הפונים כלפי מעלה. געו לזמן קצר בקצה הכיסוי למגב משימה עדין כדי לפתות את עודפי הנוזלים.
    4. מניחים בעדינות כל צד של תא כיסוי כלפי מטה על טיפת הפלואידין המדולל. לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשמור את הכיסויים בחושך בזמן ההכתמה (מכסים בכלי מכוסה בנייר אלומיניום או מניחים במגירה).
    5. במהלך הדגירה, הוסיפו PBST לבארות של צלחת התרבית (750 μL של PBST עבור כל באר של צלחת 24 בארות).
    6. לאחר תקופת הדגירה, הרימו את הכיסויים מתמיסת הכתמים והחזירו אותם לצלחת התרבית, תוך היפוך הכיסוי כך שצד התא יהיה למעלה. ודאו שהכיסוי מכוסה ב-PBST והניחו על שייקר פלטפורמה למשך 10 דקות, תוך שמירה על הכיסויים מכוסים ובחושך. יש להסיר PBST ולחזור על שלב זה פעמיים, ובסך הכל שלוש כביסות של 10 דקות.
    7. יש להניח טיפה אחת (לכל כיסוי) של מדיית הרכבה (ראו טבלת חומרים) על שקופית מיקרוסקופ. נפח של 25 μL פועל היטב עבור כיסוי של 12 מ"מ.
    8. לאחר הכביסה הסופית עם PBST, געו בקצה הכיסוי למגב משימה עדין להסרת עודפי נוזלים, תוך מעקב אחר צד התא של הכיסוי.
    9. הרכב את צד תא הכיסוי כלפי מטה על-ידי הנמכה איטית של הכיסוי בזווית על גבי מדיית ההרכבה כדי למנוע יצירת בועות. אפשר למדיה להגדיר לפני ההדמיה.

8. הערכה מורפולוגית של NCCs נודדים בתרבית

  1. תמונה מוכתמת בתאים וייצוא כקבצי .tiff.
    הערה: מטרה של 40x פועלת היטב עבור תרביות הדמיה, אך ניתן להשתמש במטרות הנעות בין 10x (כדי ללכוד שדה שלם של NCCs נודדים) ל- 100x (NCCs בודדים) כדי לאסוף תמונות להערכה מורפולוגית. התמונות במחקר הנוכחי צולמו באמצעות פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית הפוכה (ראו טבלת חומרים).
  2. העלה את התמונות לתוכנת ניתוח תמונות (ImageJ21, ראה טבלת חומרים). לחץ על Image > Duplicate כדי ליצור עותק שני של כל תמונה לשימוש לניתוח, ובכך להשאיר את המקור ללא עריכה, מכיוון שלא ניתן להפוך את רוב עיבוד התמונה.
  3. לחץ על תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות והשתמש בפסי הזזה כדי להתאים את הבהירות או הניגודיות של התמונות.
  4. המירו את התמונות לגווני אפור לפי השלבים הבאים.
    1. אם תמונות מיוצאות ב- RGB, הן יועלו ב- RGB כערוץ ממוזג. כדי להפריד בין התמונות, לחץ על תמונה > צבע > פיצול ערוצים כדי לרכוש תמונות בגווני אפור של ערוץ יחיד.
    2. אם התמונות כבר מופרדות, עבור אל תמונה > הקלד > 8 סיביות כדי להמיר קובץ לגווני אפור.
  5. לחץ על תמונה > התאם את סף > כדי להמיר לתמונה בינארית שבה פיקסלים מזוהים כתאים (חזית; שחור) או רקע (לבן). השתמש בסרגל ההזזה ו/או לחץ על אוטומטי כדי לבחור את הגדרת הסף המגדירה בבירור תאים מהרקע.
    1. אם התאים חופפים או שהכתמים אינם רציפים, ייתכן שיהיה צורך לעבד עוד יותר באמצעות הפונקציות פרשת מים או מילוי חורים22. פעולה זו תפריד תאים זה מזה או תמלא פערים בתוך התאים לניתוח. לחץ על תהליך > בינארי > הפוך בינארי כדי להמיר תחילה את התמונה לתבנית בינארית של 8 סיביות. לאחר מכן לחץ על תהליך > קו פרשת המים > בינארי או מלא חורים.
      הערה: התוכנה תתאים בצורה הטובה ביותר למקום שבו יש להפריד או למלא אותות, אותם ניתן לכוונן עוד יותר באמצעות תוספים במידת הצורך.
  6. בחר את המידות שיש ללכוד. לחץ על נתח > הגדר מדידות וסמן את התיבות מתארי צורה לניתוח מעגליות (Circ.), יחס גובה-רוחב (AR), מעוגלות (עגול) ומוצקות.
    הערה: מדידות אחרות עשויות להיכלל גם הן, כגון שטח והיקף, בהתאם לסוג הניתוח הדרוש.
  7. לחץ על נתח > נתח חלקיקים, והגדר את הפרמטרים מתפריט "נתח חלקיקים".
    1. תחת "גודל", הערך באופן גס את גודל התאים או החלקיקים המעניינים בפיקסלים, מכיוון שאות רקע או פסולת תאים קטנה יותר ייכללו גם אם הפרמטר Size יישאר מוגדר ב-0-Infinity (לדוגמה, מוגדר כ-500-Infinity באיור 5).
      הערה: התאמת הגודל לטווח הדוק יותר יכולה לא לכלול חלקיקים קטנים או גדולים יותר מאלה הדרושים לניתוח.
    2. תחת "מעגליות", השאר ב- 0-1.0 כדי למדוד את כל צורות התאים בתמונה.
    3. תחת "הצג", בחר קווי מתאר חשופים מהתפריט הנפתח כדי לבדוק את קווי המתאר של התאים שנבחרו באמצעות הפונקציה "נתח חלקיקים". סרוק את קווי המתאר כדי לוודא שהתאים החופפים נבדלים, אך התאים אינם מחולקים שלא לצורך. כמו כן, סמן את תיבות התפריט עבור "הצג תוצאות", "סיכום" ו "הוסף למנהל".
  8. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, לחץ על אישור.
    הערה: ארבעה חלונות נפרדים יופיעו, ויציגו (1) את קווי המתאר החשופים של התאים שזוהו בתמונה, (2) את התאים שנספרו בתמונה, (3) את תוצאות המדידות של כל תא, ו-(4) סיכום של המספר הכולל של התאים שנספרו והמדידות הממוצעות שלהם.
    1. אם נספרו פסולת, תאים חופפים נספרו כאחד, תאים בודדים נספרו ככפולות, או תאים רבים הושמטו מהספירה, חזרו לתמונה המקורית והלא ערוכה, צרו שכפול נוסף והתאימו את "סף" או פרמטרים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה כללית של הפרוטוקול הנוכחי מוצגת באיור 1. הביצים שהודגרו נפתחו, והחלמון, עם העובר על פני השטח, בודד על ידי מזיגה עדינה לתוך כף ידה של כפפות (איור 2A,B). לאחר פינוי האלבומין (איור 2C), מסגרות נייר סינון הוחלו על קרום החלמון המקיף את העובר כדי להקל על חיתוך והרמת העובר מהחלמון, שמתחיל להישפך לאחר חיתוך קרומי החלמון (איור 2D,E).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה ניתנת להתאמה של בידוד קפלים עצביים של אפרוחים וציפוי שלהם כדי ליצור תרבויות של NCCs גולגולתיים נודדים. תרביות אלה מספקות תנאים דו-ממדיים פשוטים לניתוח קל של נדידת NCC של אפרוחים ומורפולוגיה שיכולים להשלים מאתגרים יותר מבחינה טכנית בשיטות הדמיה של ovo 24,25,26. בעוד ששיטת in vitro זו פשוטה יחסית, תוצאות עקביות תלויות בביצים וריאגנטים באיכות גבוהה. בנוסף, בשל השונות האינהרנטית של הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקורין א. פיירצ'יילד וקייטי ל. ורמיליון, שהשתתפו בפיתוח הגרסה שלנו לפרוטוקול תרבית הקפל העצבי הגולגולתי של אפרוחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AxioObserver מצויד בראש סריקה קונפוקלי LSM710 הנשלט על ידי תוכנת ZEN 3.0 SR Zeissהשתמש בכלי תא אלפא Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2Sigma-AldrichC3306
(תחתית זכוכית, יחידה או מחולקת)MatTek; תא VisP35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		תא יחיד 35 מ"מ או 4 תאים 35 מ"מ
זכוכית כיסוי CarolinaBiological Supply Company633029, 633031, 633033, 633035, 633037עיגולים, 0.13– עובי 0.17 מ"מ, זמין בקוטר 12-25 מ"מ 
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033אלטרנטיבה לחממת ביצים למדיה L15
Sportsman1502
FBS Life Technologies10437-028
פיברונקטיןפישר סיינטיפיקCB-40008A
נייר סינוןWhatmanדרגה 3 מ"מ כרומטוגרפיה
מלקחיים (בוטה)פישר סיינטיפיק; תומאס סיינטיפיק08-890 (פישר); 1141W97 (תומס)
מלקחיים (עדין)כלים מדעיים עדינים11252-20Dumont #5
Image Jhttps://fiji.sc/תוכנה חינמית לניתוח תמונות
KClSigma-AldrichP3911
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
L15 mediaInvitrogen11415064
L-גלוטמיןInvitrogen25030
מדיה הרכבה (Vectashield או ProLong Gold)מעבדות וקטור; Thermofisher ScientificH-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4Sigma-AldrichS9638
NaClSigma-AldrichS9888
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15140-14810,000 יחידות/מ"ל פניצילין; 10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין
צלחות פטריVWR (או דומה)60 מ"מ, 100 מ"מ
פלואידיןסיגמא-אולדריץ'P1951פלורופורים מרובים זמינים
מחזיק סיכהכלי מדע עדינים26016-12למחט טונגסטן (אלטרנטיבה למספריים קפיציים)
מספריים (דיסקציה)כלי מדע עדינים14061-10
מספריים קפיציםכליםמדעיים עדינים15000-08קצה חיתוך 2.5 מ"מ (חלופה למחט טונגסטן)
SylgardKraydenSylgard 184
מסנני מזרקSigma-AldrichSLGVM33RSMillex-GV יחידת מסנן מזרק, 0.22 ומיקרו; m, PVDF, 33 מ"מ, מעוקר גמא
כלי תרבית רקמותSarstedt83-390035 מ"מ כלי תרבית לתרביות קיפול עצבי בתפזורת
Triton X-100Sigma-AldrichX100
חוט טונגסטןמגוון מקורותקוטר 0.01 אינץ' למחט טונגסטן (חלופה למספריים קפיציים)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231(2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJ

מאמרים קשורים