מאמר שיטה

הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

DOI:

10.3791/63807

⸱

20 במאי 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצבנות העור היא חלק חשוב ממערכת העצבים ההיקפית. למרות שהמחקר של סיבי העצב העוריים התקדם במהירות, רוב ההבנה של המאפיינים ההפצתיים והכימיים שלהם מגיעה מהכתמים היסטוכימיים ואימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים על חלקי רקמה דקים. עם התפתחות טכניקת ניקוי הרקמה, ניתן היה לראות את סיבי העצב העוריים על חלקי רקמה עבים יותר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כתמים פלואורסצנטיים מרובים על מקטעי רקמות בעובי של 300 מיקרומטר מהעור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה, שני אתרי העור השעירים והזוהרים האופייניים. כאן, הפפטיד הקשור לגן קלציטונין מסמן את סיבי העצב החושיים, בעוד שפלואידין וקולטן אנדותל היאלורונן אנדותל כלי הלימפה 1 מסמנים את הדם וכלי הלימפה, בהתאמה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סיבי העצב החושיים המסומנים היו במעקב מלא במרחק ארוך יותר, רצים בצרורות בשכבה העורית העמוקה ובסגנון חופשי בשכבה השטחית. סיבי עצב אלה זרמו במקביל לכלי הדם או הקיפו אותם, וכלי הלימפה יצרו רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) בעור השעיר והזוהר. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה יותר לחקר העצבנות של העור מאשר השיטות הקונבנציונליות הקיימות מנקודת המבט המתודולוגית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור, האיבר הגדול ביותר בגוף, המשמש כממשק מפתח לסביבה, מופנם בצפיפות על ידי סיבי עצב רבים 1,2,3. למרות שעיוורון העור נחקר באופן נרחב בעבר בשיטות היסטולוגיות שונות, כגון צביעה על מקטעי עור ורקמות שלמים 4,5,6, ההדגמה היעילה המפורטת של סיבי עצב עוריים היא עדיין אתגר 7,8. בהתחשב בכך, הפרוטוקול הנוכחי פיתח טכניקה ייחודית להצגת סיבי עצב עוריים בצורה ברורה יותר בחלק הרקמה העבה.

בגלל הגבול של עובי החלקים, התצפית על סיבי עצב עור פנימיים אינה מדויקת מספיק כדי לתאר במדויק את הקשר בין סיבי עצב פפטידים הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) לבין רקמות ואיברים מקומיים ממידע התמונה שנרכש. הופעתה של טכנולוגיית ניקוי רקמות תלת-ממדית מספקת שיטה אפשרית לפתרון בעיה זו 9,10. ההתפתחות המהירה של גישות לניקוי רקמות הציעה כלים רבים לחקר מבני רקמות, איברים שלמים, הקרנות עצביות ובעלי חיים שלמים בתקופה האחרונה11. ניתן היה לדמות את רקמת העור השקופה בקטע עבה הרבה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל את הנתונים כדי לדמיין סיבי עצב עוריים.

במחקר הנוכחי, העור הכפי והגבי של כף רגל אחורית של חולדה נבחר כשני אתרי המטרה של עור שעיר וגלברוס 3,4,7. כדי להתחקות אחר סיבי העצב העוריים במרחק רב יותר, רקמת העור נחתכה בעובי של 300 מיקרומטר לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית, ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות. CGRP שימש לסימון סיבי העצב החושיים12,13. בנוסף, כדי להדגיש את סיבי העצב העוריים על רקע הרקמה, נעשה שימוש נוסף בפלואידין ובקולטן היאלורונן אנדותל לימפתי 1 (LYVE1) כדי לתייג את כלי הדם וכלי הלימפה, בהתאמה14,15.

גישות אלה סיפקו שיטה פשוטה שניתן ליישם כדי להדגים תצוגה ברזולוציה גבוהה של סיבי העצב העוריים וגם כדי לדמיין את המתאם המרחבי בין סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור, אשר עשוי לספק הרבה יותר מידע כדי להבין את ההומאוסטזיס של העור הרגיל ואת השינוי העורי בתנאים הפתולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ו- Moxibustion, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-04-13-1). כל ההליכים נערכו בעקבות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). במחקר זה נעשה שימוש בשלוש חולדות זכר בוגרות (ספראג-דאולי, משקל 230 ± 15 גרם). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ואפשרו גישה חופשית למזון ולמים.

1. פרפוזיה והכנת דגימה

  1. הזריקו 250 מ"ג/ק"ג של תמיסת טריברומואתנול (ראו טבלת חומרים) באופן תוך-צפקי לתוך החולדה כדי לגרום להמתת חסד.
  2. לאחר הפסקת הנשימה, השתמשו במספריים כירורגיים מפלדת אל-חלד כדי לפתוח את חלל בית החזה של החולדה. השתמשו במחטים של 20 גרם כדי לחדור דרך חדר הלב השמאלי13 בקצב של 3 מ"ל לדקה עם 100 מ"ל של 0.9% ממס תמיסה רגילה ואחריה 250-300 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M מאגר פוספט (PB, pH 7.4) (איור 1A,B).
  3. לאחר זלוף, יש להשתמש באזמל כדי להסיר את עור הגב והסוליה מהכף האחורית.
    1. עבור הדגימות הדורשות חתך קפוא, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 0.1 M PB במשך 2 שעות; ולאחר מכן להגן על הרקמות ב 25% סוכרוז ב 0.1 M PB במשך יותר מ 24 שעות ב 4 °C (76 °F)
    2. עבור הדגימות עם החלק העבה הדורש ניקוי רקמות, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 1x מלוחים בופר פוספט (1x PBS) במשך 2 שעות; לאחר מכן הגן על הרקמות ב-1x PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1C–E).

2. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות

הערה: צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו- LYVE1 הוחלה כדי לחשוף את סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור שעיר וגלברוס על חלקי רקמה בעובי של 300 מיקרומטר לאחר טיפול בפינוי רקמות.

  1. מכינים 2% אגרוז ב-1x PBS על ידי חימום במיקרו-תנור למשך 2 דקות עד שהאגרוז מתמוסס (ראו טבלת חומרים).
  2. לאחר הכביסה, הטמיעו את רקמות העור ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והניחו אותן בתוך קופסת הקרח לקירור (איור 1F,G).
  3. קבעו את הרקמה המותקנת על המיקרוטום הרוטט עם מי הקרח וחתכו אותם בעובי של 500 מיקרומטר בכיוון הרוחבי. השתמש בפרמטרים הבאים כדי להגדיר את חיתוך הרטט ולסיים חיתוך: מהירות, 0.50 מ"מ לשנייה, משרעת, 1.5 מ"מ (איור 1H-K).
  4. לאחר החיתוך, הסירו את האגרוז מהמקטעים ואחסנו אותם בצלחת בעלת שש בארות עם 1x PBS (pH 7.4) (איור 1L).
  5. דגירה של חלקי הרקמה בתמיסה של 2% טריטון X-100 ב-1x PBS (TriX-PB) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ראו איור 2 להליך הבא.
  6. מכניסים את חלקי הרקמה למאגר החוסם ומסובבים ב-72 סל"ד על השייקר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב המאגר החוסם הוא 10% סרום חמור רגיל, 1% טריטון-X 100 ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS (ראו טבלת חומרים).
  7. מעבירים את חלקי הרקמה לתמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכברים (1:500) ונוגדן אנטי-LYVE1 רב-שבטי של כבשים (1:500) במאגר דילול בצינור המיקרו-צנטריפוג' (ראו טבלת חומרים), ומסובבים על השייקר במשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרכב מאגר הדילול הוא 1% סרום חמורים רגיל, 0.2% Triton-X 100, ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS.
  8. שטפו את חלקי הרקמות פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר, ואז השאירו אותם על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במאגר הכביסה.
    הערה: הרכב מאגר הכביסה הוא 0.2% Triton-X 100 ב-0.1 M PB (pH 7.4).
  9. למחרת, העבירו את חלקי הרקמה לתמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם אלקסה-קמח594 פאלואידין (1:1000) (ראו טבלת חומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה וסובבו ב-72 סל"ד בשייקר במשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
  10. יש לשטוף את חלקי הרקמות בצלחת בת שש בארות עם חיץ כביסה למשך שעה, פעמיים, בטמפרטורת החדר. שמור את חלקי הרקמות במאגר שטיפה על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. מעבירים את חלקי הרקמה לריאגנט ניקוי הרקמה (ראו טבלת חומרים, נפחו היה גדול פי חמישה מנפח הדגימה) ומסובבים ב-60 סל"ד על השייקר בעדינות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר טיפול זה, חלקי הרקמה מתבהרים (איור 2B).
  12. הרכיבו את הרקמות המנוקות על המגלשה, הקיפו את הרקמות עם ספייסר, והדביקו את הפער עם ריאגנט לניקוי רקמות טריות וכיסויים.

3. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 בעקבות הגישה המקובלת

הערה: לשם השוואה, אותה צביעה בוצעה על חתכי רקמה בעובי של 30 מיקרומטר בעקבות טכניקות קונבנציונליות.

  1. פורסים את חלקי הרקמה ב-30 מיקרומטר על מיקרוטום בכיוון הרוחבי ומרכיבים אותם על המגלשה.
  2. הוסיפו תמיסת חסימה עם סרום חמורים תקין של 3% ו-0.3% Triton X-100 ב-0.1 M PB ודגמו את החלקים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את תמיסת החסימה ודגדג את החלקים עם התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכבר (1:500) ונוגדן פוליקלונלי נגד LYVE1 של כבשים (1:500) במאגר דילול לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, שטפו את חלקי הרקמות עם 0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, הוסיפו את התמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) על החלקים ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. לפני תצפית מיקרוסקופית, שטפו את החלקים ב-0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, ואז כסו אותם בכיסויים ב-50% גליצרין.

4. הדמיה וניתוחים

  1. שימו לב לדגימות המוכתמות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולאחר מכן צלמו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
  2. צלם 30 תמונות (Z-stacks), כל אחת במסגרות של 10 מיקרומטר, מכל מקטע בעובי 300 מיקרומטר ושלב תמונה אחת ממוקדת באמצעות מעבד תמונה של מערכת המיקרוסקופיה הקונפוקלית (ראו טבלת חומרים).
    1. בצע את השלבים הבאים בתוכנת עיבוד התמונה של ההגדרה הקונפוקלית לניתוח תלת-ממדי (תלת-ממדי): הגדר מישור מוקד התחלה | הגדרת מישור מוקד קצה | הגדרת גודל שלב | בחר תבנית עומק | לכידת תמונה | סדרת Z.
      הערה: אורכי הגל של העירור והפליטה של אותות פלואורסצנטיים כחולים היו 401 ננומטר ו-421 ננומטר, בהתאמה. אורכי הגל של עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים ירוקים היו 499 ננומטר ו-519 ננומטר, בהתאמה. אורכי גל עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים אדומים היו 591 ננומטר ו-618 ננומטר, בהתאמה. 152 μm הוא קוטר חור הסיכה הקונפוקלי (עדשה אובייקטיבית פי 10, NA: 0.4). רזולוציית לכידת התמונה הייתה 1024 × 1024 פיקסלים.
  3. עבור הדגימות הקונבנציונליות (שלב 3), צלם 30 תמונות (Z-stacks) במסגרות של 1 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 30 מיקרומטר והתייחס עוד יותר לתמונות אלה כאמור לעיל (שלבים 4.1-4.2).
  4. הדגימו את התמונות בתבנית של שחזור תלת-ממדי באמצעות מערכת עיבוד התמונה.
  5. בצע שחזורים תלת-ממדיים על-ידי ייבוא תמונות קונפוקליות של Z-stack לתוך Imaris 9.0 (תוכנת הדמיית תאים, ראה טבלת חומרים) וצור עיבודי משטח המבוססים על עוצמות כתמים: הוסף משטחים חדשים | בחר את ערוץ המקור | קביעת הפרמטרים באפשרות החלקה של Surfaces Detail | קביעת הפרמטרים באפשרות הסף של עוצמה מוחלטת | סיווג משטחים | סיום.
  6. קבל נתונים בשטח הפנים של סיבי עצב חיוביים באמצעות תוכנת הדמיית התאים. בחר את התמונה המעובדת | סטטיסטיקה | | מפורט ערכים ספציפיים | נפח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר צביעה פלואורסצנטית משולשת, סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1, בהתאמה, בעור השעיר והזוהר (איור 3,4). עם הטיפול המנקה, סיבי העצב החיוביים ל-CGRP, כלי הדם החיוביים לפאלואידין וכלי הלימפה החיוביים ל-LYVE1 ניתנים לדמיון בעומק רב יותר כדי לקבל את המידע המבני המלא של העור (איור 3). כאשר מבני רקמות אלה שוחזרו עוד יותר בתבנית תלת-ממדית, תפוצתם נעשתה קלה יותר לאיתור. הודגם כי סיבי העצב החיוביים ל-CGRP עברו דרך הרק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מספק הדגמה מפורטת של סיבי העצב העוריים בעור השעיר והזוהר על ידי שימוש באימונופלואורסצנציה על חלקי רקמות עבים יותר עם טיפול ניקוי ותצוגה תלת-ממדית כדי להבין טוב יותר את העצבנות של העור. זמן הדגירה של הנוגדנים של עד 1-2 ימים ותהליך ניקוי לילה חשובים. שני שלבים מרכזיים אלה משפיעים ישירות על אפקט הכתם החיסוני של חתכים עבים. בעיה נוספת הועלתה מבחירת הנוגדנים, שלא כולם מתאימים למקטעים עבים. אנו משערים כי נוגדנים עם משקלים מולקולריים קטנים יותר עשויים להיות אידיאליים להכתמת אימונופלואורסצנציה של חתכים עבים. לפיכך, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הסינית לחדשנות במדעי הרפואה של סין (קוד פרויקט מס'. CI2021A03404) והקרן הלאומית הלאומית לחדשנות בין-תחומית ברפואה סינית מסורתית (קוד פרויקט מס' ZYYCXTD-D-202202).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x תמיסת מלח חוצצת פוספטSolarbio Life SciencesP1020pH 7.2-7.4, 0.01 מול
2,2,2-טריברומו-אתנולסיגמא מדעי החייםT48402-5G
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקליתOlympus CorporationFluoview FV1200
חמור נגד עכבר IgG H& L Alexa-Flour488Abcam plc.ab150105
חמור נגד כבשים IgG H& L Alexa-Flour405Abcam plc.ab175676
צינור EPWuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות'.6150011.5 מ"ל
שלב הקפאה מערכת מיקרוטום הזזהLeica BiosystemsCM1860
Imaris SoftwareOxford Instrumentsv.9.0.1
IRIS מספריים סטנדרטייםWPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacerSunJin Lab co.IS005
מיקרו מלקחיים-StrRWDF11020-11
נוגדן חד שבטי נגד CGRPעכבר סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, בע"מsc-57053
פורמלין ניטרלי חוצץSolarbio מדעי החייםG216110%
סרום חמור רגילJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 מ"ל
משאבה פריסטלטיתארוכה יותר דיוק משאבות ושות', בע"מBT300-2J
פלואידין Alexa-Fluor 594תרמו פישר סיינטיפיקA12381
RapiClear 1.52 פתרוןSunJin Lab co.RC15200110 מ"ל
רגיל אגרוזגן חברה בע"מG-10
SEMKEN 1 x 2 מלקחיים לרקמת שיניים-StrRWDF13038-12
נוגדן אנטי-LYVE1 פוליקלונלי כבשיםR& די סיסטמס, בע"מAF7939
צלחת שש בארותCorning Incorporated3335
נתרן אזידSigma Life ScienceS200225 גרם
סוכרוזסיגמא מדעי החייםV900116500 גרם
סופר גלוHenkel AG & Co.Pattex 502
ידיות כירורגיותRWDS32003-12
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 מ"ל
UrethaneSigma Life ScienceU2500500 גרם
VANNAS מספריים קפיצייםRWDS1014-12
מיקרוטום רטטLeica BiosystemsVT1200S
503242

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181(2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Skin InnervationHairy SkinGlabrous SkinTissue ClearingFluorescent StainingConfocal MicroscopySensory Nerve FibersBlood VesselsLymphatic VesselsCGRP Staining

מאמרים קשורים