הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63814

⸱

6 באוקטובר 2022

 ,  , 
1Nanotechnology Engineering Program, Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering, COPPE, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 23D Biofabrication Training and Innovation Center, BioEdtech

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

תקציר

ההתקדמות בתרביות תאים תלת-ממדיות פיתחה מודלים פיזיולוגיים יותר רלוונטיים במבחנה , כגון ספרואידים של רקמות. לתאים המעובדים כספרואידים יש תגובות ביולוגיות מציאותיות יותר הדומות לסביבה in vivo . בשל יתרונותיהם, ספרואידים רקמתיים מייצגים מגמה מתפתחת לעבר מודלים מעולים, אמינים יותר ומנבאים יותר עם מגוון רחב של ישימות ביוטכנולוגית. עם זאת, פלטפורמות ניתנות לשחזור שיכולות להשיג ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים רקמתיים הפכו לצורך שלא נענה בחקירה מלאה והגברת הפוטנציאל שלהם. כאן, הייצור בקנה מידה גדול של כדורי רקמות הומוגניים מדווח באמצעות מתודולוגיה זולה וחסכונית בזמן. מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד פותח כדי לייצר עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת בעלת 6 בארות. המכשיר מיוצר בשיטת הסטריאוליתוגרפיה באמצעות שרף הניתן לצילום. המכשיר הסופי מורכב ממיקרופינים גליליים, בגובה של 1.3 מ"מ וברוחב של 650 מיקרומטר. גישה זו מאפשרת יצירה מהירה של ספרואידים הומוגניים וספרואידים בתרבית משותפת עם צורה וגודל אחידים ויכולת קיום תא של >95%. יתר על כן, המכשיר דמוי הבול מתאים לגדלים שונים של צלחות באר וצלחות פטרי. הוא מעוקר בקלות וניתן לעשות בו שימוש חוזר לתקופות ארוכות. הייצור היעיל בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות חיוני כדי למנף את תרגומם לתחומים רבים בתעשייה, כגון הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות ורפואה מותאמת אישית לפי דרישה.

מבוא

ספרואידים רקמתיים הם מיקרו-רקמות תלת-ממדיות הנוצרות על ידי מתלי תאים העוברים הרכבה עצמית ללא כוחות חיצוניים1. ספרואידים אלה היו בשימוש נרחב בפרוטוקולי ייצור ביולוגי בשל הדמיון שלהם עם תכונות מפתח של המערכת הפיזיולוגית האנושית 2,3. ספרואידים רקמתיים מספקים מטבוליזם דומה, דינמיקה של שלד, יכולת קיום של תאים ופעילות מטבולית והפרשה דומים יותר מאשר תרבית תאים חד-שכבתית מסורתית1. בשל יכולת ההיתוך שלהם, הם יכולים לשמש גם כאבני בניין (למשל, פרוטוקולי הדפסה ביולוגית) ליצירת מבנים מורכבים מהונדסים רקמות עם רלוונטיות ביולוגית משופרת 4,5.

בשל הרלוונטיות הביולוגית שלהם, ספרואידים של רקמות שימשו ככלי ביוטכנולוגי לפרוטוקולים הנעים בין הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות והערכה ננוטוקסיקולוגית, הפחתת זמן, עלויות מקום וניסוייםבבעלי חיים 3,6,7,8. עם זאת, כדי לחקור ולמנף באופן מלא את הפוטנציאל של ספרואידים רקמות, שיטות אמינות וניתנות לשחזור המכוונות לייצור בקנה מידה גדול שלהם נחוצות מאוד, ואלה נותרו אתגר מתמשך.

מספר מתודולוגיות מייצרות ספרואידים, כגון טיפה תלויה, בארות תחתונות מצופות בצורת U, מיקרופלואידיקה, ושימוש במטריצה פולימרית 9,10. למרות שמתודולוגיות אלה סללו את הדרך בשוק הייצור הכדורי, הן עדיין מורכבות, גוזלות זמן, דורשות עבודה רבה או יקרות10.

הפרוטוקול הנוכחי מדווח על ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות תוך שימוש במתודולוגיה זולה וחסכונית בזמן. פיתחנו מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד כדי לייצר עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת של 6 בארות. יתר על כן, ניתן להתאים את המכשיר דמוי הבול לייצור יותר ספרואידים לכל באר, המתאימים לצלחות תרבית תאים שונות. הוא ניתן לחיטוי בקלות וניתן לעשות בו שימוש חוזר לתקופות ארוכות. הייצור היעיל בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות חיוני לתרגום השימוש בהם למרפאות, ותורם לתחומים רבים בתעשייה כגון הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות ורפואה מותאמת אישית לפי דרישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

קו התאים L929, פיברובלסטים של עכברים, שימש במחקר הנוכחי. המכשיר הביולוגי דמוי הבול המודפס בתלת-ממד התקבל ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). תרגול תרבית תאים טובה וטכניקות סטריליות בוצעו לאורך כל הפרוטוקול. המכשיר המפוברק עוקר על ידי ניגובו עם 70% אלכוהול וחשיפתו לאור UV למשך 15 דקות. המדיה והתמיסות של תרביות התאים חוממו לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני המגע עם התאים או עם כדורי הרקמה. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

1. הכנת תבניות לא דבקות מהמכשיר דמוי הבול

  1. הכינו ג'ל אגרוז 2% (w/v) לפי השלבים הבאים.
    1. לדלל את אבקת האגרוז במי מלח חוצצים פוספט (1x PBS) והומוגניזציה של המתלה שנוצר עם תנועות מעגליות.
      הערה: ניתן להניח פתרון זה בבקבוק זכוכית. בשלב זה, פתרון האגרוז לא יהיה שקוף.
    2. הכניסו את בקבוק הזכוכית למיקרוגל והניחו אותו ל-30 שניות. כל 5 שניות, לעצור את המיקרוגל, להסיר את בקבוק זכוכית, באופן ידני homogenize עם תנועות מעגליות. תהליך החימום צריך להתבצע עד שהתמיסה מגיעה למצב נוזלי-צולע.
      הערה: פלטה חמה יכולה לשמש גם כחלופה למיקרוגל. לאחר תהליך החימום, התמיסה חייבת להיות שקופה/צולעת.
    3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת אגרוז לכל באר של צלחת 6 בארות המתוכננת לניסוי.
    4. המתן ~ 15 דקות או עד שהאגרוז יתמצק.
      הערה: ניתן להשתמש בלוח קירור כדי לקצר את זמן ההתמצקות.
    5. מוסיפים 1-2 מ"ל של תמיסת האגרוז ומכניסים בעדינות את המכשיר מעל האגרוז הנוזלי.
      הערה: מיקום המכשיר חייב להיעשות בזהירות כדי למנוע בועות אוויר בממשק מכשיר האגרוז.
    6. המתן ~ 30 דקות או עד שהאגרוז יתמצק.
      הערה: ניתן להשתמש בלוח קירור כדי לקצר את זמן ההתמצקות.
    7. הסר בעדינות את המכשיר מהאגרוז.
      הערה: ההסרה היא קריטית. יש להסיר אותו בזהירות כדי לשמור על תכונות האגרוז שלמות; אחרת, האגרוז יכול להיות משובש.
    8. הוסף 2 מ"ל של מדיה DMEM, המתן 10 דקות, השליך את המדיה והחלף אותה ב- DMEM טרי. חזור על כך שלוש פעמים כדי לשטוף את הבאר כראוי.
    9. הוסיפו 2 מ"ל DMEM והניחו את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO2 ו-80% לחות) עד לזריעת התא (איור 2A-F, סרטון משלים 1).

2. דור של כדורי רקמות

הערה: לשושלות תאים שונות יש תכונות הידבקות שונות. לפיכך, באמצעות מתודולוגיה זו, סוגים מסוימים של תאים עשויים שלא ליצור את כדורי הרקמה כראוי.

  1. לגדל את התאים בעקבות תרבית חד-שכבתית מסורתית (כלומר, לגדל את התאים בצלוחיות תרבית תאים באמצעות DMEM עם גלוקוז נמוך בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) (ראה טבלת חומרים). שמור על התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 , ולפקח עד שהם מגיעים 80% של מפגש.
  2. לאחר ההגעה למפגש הרצוי, לשטוף את התאים עם 1x PBS.
    הערה: מומלץ להשתמש 5 מ"ל עבור 25 ס"מ2 צלוחיות, 10 מ"ל עבור 75 ס"מ2 צלוחיות, ו 15 מ"ל עבור 150 ס"מ2 צלוחיות.
  3. מוסיפים את אנזים הדיסוציאציה ודגורים על התאים במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO2 ו-80% לחות.
    הערה: המחקר הנוכחי השתמש ב-0.125% טריפסין עם 0.78 מילימטר חומצה טטראצטית אתילאנדיאמין (EDTA) כאנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים).
  4. שימו לב לניתוק התאים מצלוחיות תרבית התאים והוסיפו מדיום גידול בתוספת FBS כדי לנטרל את אנזים הדיסוציאציה של התא.
    הערה: במחקר הנוכחי, DMEM עם גלוקוז נמוך (ראה טבלת חומרים) שימש בתוספת 10% FBS.
  5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ספור את התאים באופן ידני.
  6. קח 50 x 105 תאים לכל צינור ולהוסיף 5 מ"ל של 1x PBS.
    הערה: מספר התאים שנזרעו משפיע על קוטר הרקמה הסופית. לפיכך, ניתן להגדיל את מספר התא כדי ליצור כדורי רקמות בקטרים גדולים יותר.
  7. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. מוציאים את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, מוסיפים 1 מ"ל ממדיום תרבית התא, ומהומוגניים את התמיסה.
    הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתרבית שלמה של DMEM עם גלוקוז נמוך, בתוספת 10% FBS, 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין 100 מק"ג/מ"ל.
  9. הסר 2 מ"ל של מדיום מהצלחת 6 בארות (שלב 1.1.9) והוסף 1 מ"ל של תרחיף התא למרכז תבנית האגרוז שנוצרה על ידי הביו-התקן המודפס בתלת-ממד (שלב 1.1.7). המתן עד שקיעת התאים בכריתות המיקרו (~ 20-30 דקות) והוסף בזהירות 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים לבאר.
    הערה: יש להיות זהירים במיוחד בשלב זה. מומלץ להוסיף בעדינות את המדיום, למקם את קצה הפיפטה קרוב לדופן הבאר ולהוציא בכמויות קטנות.
  10. הניחו את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 ו-80% לחות) כדי שייווצרו כדורי הרקמה (בערך 24-48 שעות, תלוי בסוג התא) (איור 3).
    הערה: לסוגי תאים שונים (למשל, תאים סרטניים, תאים ראשוניים) יש קינטיקה שונה של הרכבה עצמית11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יצירת מיקרו-כריתות הומוגניות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד
המכשיר דמוי הבול המודפס בתלת-ממד יוצר בהצלחה בשיטת סטריאוליתוגרפיה12 באמצעות שרף הניתן לריפוי (איור 2A). המכשיר הסופי הורכב ממיקרופינים גליליים בגובה של 1.3 מ"מ וברוחב של 650 מיקרומטר (איור 2A). השימוש בו כתבנית אב לייצור מיקרו-כריתות לא דבקות הושג על-ידי שמירה על הגיאומטריה (איור 2B-F

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה, מהירה וזולה לייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים ברקמות. מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד שימש כתבנית אב, שיצרה עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת בעלת 6 בארות. הוכח כי לתאים המעובדים כספרואידים יש תגובות ביולוגיות מציאותיות יותר הדומות מאוד לסביבה in vivo 1. בשל יתרונותיהם, ספרואידים רקמתיים מייצגים מגמה מתפתחת לעבר מודלים מעולים, אמינים יותר ומנבאים יותר13,14. לפיכך, פיתוח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המכשירים דמויי הבולים המודפסים בתלת ממד הוצעו על ידי הסטארט-אפ Bioedtech, שבו ג'נאינה דרנובסק היא מייסדת שותפה ומנהלת חדשנות. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לתמיכה במחקר של מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ, ברזיל), התיאום לשיפור אנשי ההשכלה הגבוהה (CAPES, ברזיל), והמועצה הלאומית הברזילאית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq, ברזיל). אנו מודים ל-Bioedtech על אספקת המכשירים דמויי הבולים ששימשו במחקר זה ולפרופסור ברתירה ברגמן מהמעבדה לאימונופרמקולוגיה על השימוש במתקני תרביות התאים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 6 בארMerckCLS3516
AgarosePromegaV3121
Biodevice ביואדטק
ThermoFisher 
צנטריפוגהThermoFisher 
75004031 צינורות צנטריפוגה קורנינג 50 מ"לMerckCLS430829-500EA
צלוחיות תרבית תאים של קורנינג שטח פנים 75 ס"מ2MerckCLS430641
שרף טיוטה FormLabsFLDRBL01
Dulbecco & prime; s Modified Eagle ′ s בינוני - גלוקוז נמוךMerckD6046
סרום בקר עוברי (FBS)ThermoFisher 
Form 2FormLabs
ThermoFisher 
51033782 קווי תאים L929שהוקמו במעבדה 
פניצילין וסטרפטומיצין (PS)ThermoFisher 
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Merck806552
טריפסין עם EDTAMerckT3924
ארון בטיחות ביולוגי 5102970116000044 חממת 15140122

מקורות

  1. Laschke, M., Menger, M. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  2. Mekhileri, N., et al. Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs. Biofabrication. 10 (2), 024103(2018).
  3. Itoh, M., et al. Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae. PLoS One. 10 (12), 0145971(2015).
  4. Kronemberger, G., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  5. Mironov, V., et al. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  6. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  7. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  8. Charelli, L., et al. Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids. Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).
  9. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
  10. Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  11. Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (148), e59714(2019).
  12. Quan, H., et al. Photo-curing 3D printing technique and its challenges. Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).
  13. Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate. International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331(2021).
  14. Baptista, L., et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285(2018).
  15. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  16. vander Valk, J. Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  17. vander Valk, J., Brunner, D., et al. Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).
  18. Smyrek, I., et al. microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity. Biology Open. 8 (1), 037051(2018).
  19. McMillen, P., Holley, S. Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).
  20. Tung, Y., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  21. Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture. Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).
  22. Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. The role of information technology in the future of 3D biofabrication. Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).
  23. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  24. Skardal, A., et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Scientific Reports. 7, 8837(2017).
  25. Armoiry, X., et al. Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal. PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).
  26. Nakamura, A., et al. Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration. Biofabrication. 13 (4), 044103(2021).
  27. Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology. Biochemical Engineering Journal. 174, 108122(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תאים בתלת-ממדייצור ספרואידים בקנה מידה גדולהתקן מודפס בתלת-ממדשיטת סטריאוליתוגרפיהתבנית אגרוזזריעת תאיםהנדסת רקמותפיתוח תרופותמידול מחלות
יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.