Method Article

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול להנדס מערכת איבר-על-שבב מותאמת אישית המשחזרת את המבנה והתפקוד של מחסום הסינון הגלומרולרי בכליות על ידי שילוב תאי אפיתל וכלי דם מותאמים גנטית המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. מערכת מהונדסת ביולוגית זו יכולה לקדם את רפואת דיוק הכליות ואת היישומים הקשורים אליה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כליות כרונית (CKD) משפיעה על 15% מהאוכלוסייה הבוגרת בארה"ב, אך הקמת טיפולים ממוקדי מטרה הוגבלה על ידי היעדר מודלים פונקציונליים שיכולים לחזות במדויק תגובות ביולוגיות אנושיות ונפרוטוקסיות. ההתקדמות ברפואה המדויקת של הכליות עשויה לסייע להתגבר על מגבלות אלה. עם זאת, מודלים שהוקמו בעבר במבחנה של גלומרולוס הכליות האנושיות - האתר העיקרי לסינון דם ויעד מרכזי למחלות רבות ורעילות לתרופות - משתמשים בדרך כלל באוכלוסיות תאים הטרוגניות עם מאפיינים תפקודיים מוגבלים ורקע גנטי שאין שני לו. מאפיינים אלה מגבילים באופן משמעותי את היישום שלהם עבור מודלים ספציפיים למחלה וגילוי טיפולי.

מאמר זה מציג פרוטוקול המשלב אפיתל גלומרולרי (פודוציטים) המושרה על ידי האדם ואנדותל כלי דם מחולה יחיד כדי להנדס שבב גלומרולוס כליות איזוגני וסקולרי. שבב הגלומרולוס המתקבל מורכב משכבות תאי אנדותל ותאי אפיתל שמקורם בתאי גזע, המבטאות סמנים ספציפיים לשושלת, מייצרות חלבוני קרום מרתף ויוצרות ממשק רקמה-רקמה הדומה למחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה. שבב הגלומרולוס המהונדס מסנן באופן סלקטיבי מולקולות ומשחזר פגיעה בכליות הנגרמת על ידי תרופות. היכולת לשחזר את המבנה והתפקוד של גלומרולוס הכליה באמצעות סוגי תאים איזוגניים יוצרת את ההזדמנות למדל מחלת כליות עם ספציפיות המטופל ולקדם את התועלת של איברים על שבבים לרפואה מדויקת של כליות ויישומים קשורים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקני איבר על שבב הם מודלים דינמיים תלת-ממדיים במבחנה המשתמשים בגירוי מולקולרי ומכני, כמו גם בכלי דם, כדי ליצור ממשקי רקמה-רקמה המדגימים את המבנה והתפקוד של איברים ספציפיים. התקנים שהוקמו בעבר איברים על שבב שמטרתם לסכם את הגלומרולוס (שבבי גלומרולוס) של הכליה, כללו קווי תאים של בעלי חיים1 או קווי תאים ראשוניים ואימורטליים אנושיים של מקורות הטרוגניים 2,3. השימוש במקורות תאים הטרוגניים מבחינה גנטית מציג וריאציות המגבילות באופן משמעותי את המחקרים על תגובות ספציפיות לחולה וגנטיקה או מנגנונים של מחלה 4,5. ההתמודדות עם אתגר זה תלויה בזמינותם של קווי תאים איזוגניים שמקורם באנשים ספציפיים בעלי פרופילים מולקולריים וגנטיים משומרים כדי לספק מיקרו-סביבה מדויקת יותר להנדסת מודלים במבחנה 2,3,6. קווי תאים איזוגניים ממוצא אנושי יכולים כעת להיווצר בקלות עקב ההתקדמות בתרבית תאי iPS אנושית. מאחר שתאי iPS אנושיים הם בדרך כלל ממקור לא פולשני, יכולים להתחדש בעצמם ללא הגבלת זמן, ולהתמיין כמעט לכל סוג תא, הם משמשים כמקור אטרקטיבי של תאים להקמת מודלים במבחנה, כגון שבב גלומרולוס 7,8. מחסום הסינון הגלומרולרי הוא האתר העיקרי לסינון דם. הדם מסונן תחילה דרך אנדותל כלי הדם, קרום המרתף הגלומרולרי, ולבסוף דרך אפיתל מיוחד בשם פודוציטים. כל שלושת המרכיבים של מחסום הסינון תורמים לסינון סלקטיבי של מולקולות. מוצג כאן פרוטוקול להקמת התקן איבר-על-שבב המתממשק עם אנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי ממקור תאי iPS אנושי יחיד. בעוד שפרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי להנדס שבב איזוגני וכלי דם כדי לשחזר את מחסום הסינון הגלומרולרי, הוא גם מספק תוכנית לפיתוח סוגים אחרים של איברים על שבבים מותאמים אישית ופלטפורמות מרובות איברים כגון מערכת איזוגנית 'גוף על שבב'.

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בהתמיינות מסתעפת של תאי iPS אנושיים לשתי שושלות נפרדות - מזודרם לרוחב ותאי מזודרם, אשר לאחר מכן מתמיינים לאנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי, בהתאמה. כדי ליצור תאי מזודרם לרוחב, תאי iPS אנושיים נזרעו על לוחות מצופים 1 של מטריצת ממברנת מרתף וגודלו בתרבית במשך 3 ימים (ללא חילופי מדיה) בתווך N2B27 בתוספת מפעיל Wnt, CHIR 99021, וגורם המזודרם החזק, עצם-מורפוגנטית 4 (BMP4). תאי המזודרם הלטרליים שהתקבלו התאפיינו בעבר בביטוי של ברכיורי (T), תיבת הומיאובוקס דמוית תערובת זוגית (MIXL) ו-eomesodermin (EOMES)9. לאחר מכן, תאי המזודרם הלטרליים עברו תרבית במשך 4 ימים בתווך בתוספת VEGF165 ופורסקולין כדי לגרום לתאי אנדותל וסקולריים שמוינו על בסיס VE-קדהרין ו/או ביטוי PECAM-1 באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנט (MACS). תאי האנדותל הווסקולריים שנוצרו כתוצאה מכך (viEC) הורחבו על ידי גידולם על צלוחיות ממברנת מרתף 3 מצופות עד שהם מוכנים לזרע במכשיר המיקרופלואידי.

כדי ליצור תאי מזודרם, תאי iPS אנושיים נזרעו על לוחות מצופים 2 ממברנות מרתף וגודלו בתרבית במשך יומיים בתווך המכיל Activin A ו- CHIR99021. תאי המזודרם שהתקבלו התאפיינו בביטוי של HAND1, goosecoid ו-brachury (T) כפי שתואר קודם לכן 2,10,11. כדי לגרום להתמיינות של תאי מזודרם ביניים (IM), תאי המזודרם גודלו בתרבית במשך 14 יום בתווך בתוספת BMP-7 ו-CHIR99021. תאי ה-IM המתקבלים מבטאים את הגידול 1 של וילם (WT1), את גן התיבה הזוגית 2 (PAX2) ואת החלבון הקשור 1 (OSR-1)2,10,11.

שבב מיקרופלואידי דו-ערוצי המבוסס על פולידימתילסילוקסן (PDMS) תוכנן לסכם מחדש את מבנה מחסום הסינון הגלומרולרי במבחנה. תעלת השתן היא 1,000 מיקרומטר x 1,000 מיקרומטר (רוחב x גובה) וממד הערוץ הנימי הוא 1,000 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (רוחב x גובה). מחזורי מתיחה והרפיה מחזוריים התאפשרו על ידי התאים החלולים הנמצאים בכל צד של תעלות הנוזלים. התאים נזרעו על קרום PDMS גמיש (בעובי 50 מיקרומטר) המפריד בין תעלות השתן לתעלות הנימים. הממברנה מצוידת בנקבוביות משושה (קוטר 7 מיקרומטר, במרחק של 40 מיקרומטר זו מזו) כדי לסייע בקידום איתות בין-תאי (איור 1A)2,12. יומיים לפני השלמת אינדוקציה של IM, השבבים המיקרופלואידיים היו מצופים במטריצת קרום מרתף 2. viECs נזרעו לתוך הערוץ הנימי של השבב המיקרופלואידי באמצעות מדיום תחזוקה אנדותליאלי יום אחד לפני השלמת אינדוקציה של IM, והשבב התהפך הפוך כדי לאפשר הידבקות תאים בצד הבסיסי של קרום PDMS מצופה ECM. ביום שבו הושלמה אינדוקציה של IM, התאים נזרעו לתעלת השתן של השבב המיקרופלואידי באמצעות מדיום בתוספת BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165, וכל החומצה הטרנס-רטינואית כדי לגרום להתמיינות פודוציטים בתוך השבב. למחרת, מאגרי המדיה מולאו במדיום אינדוקציה של פודוציטים ובמדיום תחזוקה אנדותליאלי, ומתח מכני של 10% ב-0.4 הרץ וזרימת נוזלים (60 μL/h) הוחלו על השבבים.

השבבים המיקרופלואידיים התאיים גודלו בתרבית במשך 5 ימים נוספים באמצעות מדיום אינדוקציה פודוציטים (בתעלת השתן) ומדיום תחזוקה אנדותליאלי (בתעלת כלי הדם). שבבי גלומרולוס הכליות שהתקבלו גודלו בתרבית במשך עד 7 ימים נוספים באמצעי תחזוקה הן עבור תאי הפודוקיטים והן עבור תאי האנדותל. הפודוקיטים המובחנים ביטאו באופן חיובי חלבונים ספציפיים לשושלת, כולל פודוצין ונפרין 13,14, בעוד ש- viECs ביטאו באופן חיובי את חלבוני זיהוי השושלת PECAM-1 ו- VE-Cadherin, כולם מולקולות חיוניות לשמירה על שלמות מחסום הסינון הגלומרולרי 15,16 . נמצא כי הפודוקיטים וה-viECs מפרישים את חלבון קרום המרתף הגלומרולרי הנפוץ ביותר, קולגן IV, החשוב גם להבשלת רקמות ולתפקודן.

המערכת התלת-מרכיבית של מחסום הסינון - אנדותל, קרום מרתף ואפיתל - בשבבי הגלומרולוס נמצאה כמסננת מולקולות באופן סלקטיבי ומגיבה לטיפול תרופתי כימותרפי ונפרוטוקסי. תוצאות הטיפול התרופתי הצביעו על כך שניתן להשתמש בשבב הגלומרולוס למחקרי נפרוטוקסיות ולמודלים של מחלות. פרוטוקול זה מספק את ההנחיה הכללית להנדסת שבב גלומרולוס כליות מיקרופלואידי פונקציונלי מנגזרות תאי iPS איזוגניים. ניתוחים במורד הזרם של השבב המהונדס יכולים להתבצע לפי רצונו של החוקר. למידע נוסף על השימוש בשבב הגלומרולוס למודל של פגיעה גלומרולרית הנגרמת על ידי תרופות, עיין בפרסומים קודמים 2,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכן פתרונות מטריצת ממברנות מרתף ומצעים מצופים

  1. להפשיר מטריצת קרום מרתף 1 לילה על קרח ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot על פי הצעת היצרן ליחס דילול. באמצעות צינור חרוטי של 50 מ"ל ופיפטה, יש לערבב היטב כמות מתאימה של מטריצת קרום מרתף 1 ל-25 מ"ל של DMEM/F12 קר עד להפשרה מלאה ולהמסה.
    1. כדי להמיס אליקוט קפוא, יש לקחת ~200 μL מ-25 מ"ל של DMEM/F12 קר ולהעביר אותו לצינור האליקוט הקפוא. פיפטה למעלה ולמטה עד שהמטריצה מופשרת ומתמוססת היטב. העבר את תכולת הצינור המלאה של מטריצת קרום המרתף 1 לשאר ה- DMEM / F12 הקר.
  2. פיפטה 1 מ"ל של מטריצת קרום מרתף 1 תמיסה לתוך כל באר של צלחת 6 באר. כדי להשתמש בלוחות המצופים באותו יום, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
    1. לחלופין, ניתן לעטוף את הצלחות המצופות בפרפילם ולאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. כאשר אתה מוכן להשתמש בצלחת המאוחסנת, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. לדלל מטריצת קרום מרתף 2 ב 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. פיפטה 700 μL של מטריצת קרום מרתף 2 תמיסה לתוך כל באר של צלחת 12 באר. לעטוף את מטריצת קרום המרתף 2 לוחות מצופים עם parafilm ולאחסן ב 4 °C עד 2 שבועות.
  4. שחזרו את מטריצת קרום המרתף הליופילית 3 כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל במי מלח עם מאגרי פוספט (PBS, Ca+2 ו-Mg+2-free) כפי שהציע היצרן. יש לדלל אליקוט אחד של 250 μL לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם/מ"ל ב-9.75 מ"ל של PBS (ללא Ca+2 ו-Mg+2). השתמש ב-6 מ"ל של תמיסה זו כדי לצפות בקבוק T75 אחד (ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם לס"מ2). אחסנו את הצלוחיות המצופות במטריקס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

2. תרבית תאי iPS אנושית

הערה: קו DU11 המשמש בפרוטוקול זה נבדק ונמצא נקי מהפרעות מיקופלסמה וקריוטיפ.

  1. מטריצת קרום מרתף דגירה לוחות מצופים 1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
  2. יש לשטוף כל באר של צלחת 6 בארות 3x עם 1 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) DMEM / F12. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית תאי iPS אנושי (CCM) (טבלה משלימה S1) לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
  3. שטפו כל באר של צלחת 6 בארות המכילה תאי iPS אנושיים עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
  4. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של חיץ ניתוק תאים חמים לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה ב-37°C למשך דקה אחת.
  5. בדוק באופן חזותי כל באר תחת מיקרוסקופ לדיסוציאציה סביב קצוות מושבת התאים. שאפו בזהירות את מאגר ניתוק התאים מהתאים. יש לשטוף בעדינות כל באר עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
  6. בדוק את הלוחות מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא התנתקו לחלוטין מהצלחת או שאפו בטעות.
  7. הוסף 3 מ"ל של iPS CCM אנושי חם לכל באר של צלחת 6 בארות עם תאים. בעזרת מרים תאים, מגרדים בעדינות את המושבות. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מערבבים בעדינות את מתלה התא בכל באר למעלה ולמטה פעם אחת.
  8. הוציאו את מטריצת קרום המרתף החדשה צלחת מצופה 1 מהאינקובטור. העבר 0.5 מ"ל של ההשעיה התא לכל באר של מטריצת קרום המרתף החדשה צלחת 1 מצופה. הזיזו את הצלחת בתנועה של מספר שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 .
  9. שאפו את המדיום המושקע והחליפו ב-3 מ"ל של iPS CCM אנושי בכל יום של תרבית עד שהתאים נפגשים ב-70% (כ-4 ימים לאחר המעבר).

3. ימים 0-16: התמיינות של iPSCs אנושיים לתאי מזודרם ביניים

  1. ימים 0-2: אינדוקציה מזודרם
    1. הזיזו את מטריצת קרום המרתף עם לוחות מצופים 2 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי שיווי משקל לאחר האחסון.
    2. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות המכילה כ-70% תאי iPS אנושיים מקבילים. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 3 עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    3. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות.
    4. בדוק באופן חזותי כל באר תחת מיקרוסקופ לדיסוציאציה סביב קצוות מושבת התאים. בעזרת מרים תאים, מגרדים בעדינות את המושבות.
    5. העבירו את מתלי התאים מכל הבארות של צלחת 6 הבארות לצינור חרוטי של 15 מ"ל והשתמשו ב-P1000 כדי לקטר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לקבל תרחיף חד-תאי של תאי ה-iPS.
    6. מלא את מתלה התא בצינור החרוטי עד 14 מ"ל באמצעות DMEM/F12. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    7. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות את כדור התא ב-14 מ"ל של DMEM/F12 חם. חזור על צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    8. שאפו את הסופר-נטנט. יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm (טבלה משלימה S1). לספור את התאים באמצעות hemocytometer. יש לדלל במדיום אינדוקציה Mesoderm כדי להשיג ריכוז סופי של 1 × 105 תאים למ"ל.
    9. שאפו את הציפוי ממטריצת קרום המרתף צלחת 2 מצופה. יש לשטוף כל באר של מטריצת קרום המרתף 2-צלחת מצופה 2x עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    10. העבירו בעדינות את מתלה התא למעלה ולמטה פי 2. העבר 1 מ"ל של ההשעיה התא לכל באר של מטריצת קרום המרתף 2 צלחת מצופה. הזיזו בעדינות את הצלחת בתנועה של מספר שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה.
    11. לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת (יום 1), שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 12 הבאר. החלף עם 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm חם. דגירה ב-37 °C ללילה.
  2. ימים 2-16: אינדוקציה של מזודרם ביניים
    1. לשאוף את מדיום אינדוקציה Mesoderm בילה. יש להחליף ב-1 מ' ליטר של מדיום אינדוקציה בינוני חם (טבלה משלימה S1). שאפו את המדיום בילה ולהחליף עם 1 מ"ל של בינוני ביניים חם Mesoderm אינדוקציה מדיום כל יום במשך 14 ימים.

4. ימים 0-15: התמיינות והרחבה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי אנדותל וסקולריים

  1. יום 0: זריעת תאי iPS אנושיים
    1. הכינו 15 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK (טבלה משלימה S1). יש לחמם בטמפרטורה של 37°C.
    2. לדגום מטריצת קרום מרתף אחת צלחת 1-מצופה במשך 1-2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מטריצת קרום המרתף 1. יש לשטוף 3x עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    3. שאף את DMEM/F12. הוסף 2 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
    4. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות המכילה כ-70% תאי iPS אנושיים מקבילים. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 3 עם 1 מ"ל של DMEM/F12 חם.
    5. שאף את DMEM/F12. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות כדי לנתק את התאים לתאים בודדים.
      הערה: בשל הבדלים מובנים בין קווי תאי iPS, המשתמש יצטרך לבדוק חזותית את התאים לאחר 5 דקות כדי לקבוע את זמן הדגירה האופטימלי.
    6. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הביאו את מתלי התא לקיבולת של עד 14 מ"ל עם DMEM/F12 חם כדי לנטרל את מאגר הניתוק. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200× גרם בטמפרטורת החדר.
    7. שאפו בעדינות את הסופרנטנט. השהה את התאים ב-1 מ"ל של iPS CCM אנושי עם מעכב ROCK. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer.
    8. זרע את התאים בין 37,000 ל-47,000 תאים/ס"מ2 (355,200 עד 451,200 תאים/באר של צלחת 6 בארות). דגירה ב-37 °C ללילה.
      הערה: בשל הבדלים מובנים בין קווי תאי iPS, המשתמש יצטרך לקבוע את צפיפות הזריעה האופטימלית.
  2. ימים 1-3: אינדוקציה של מזודרם לרוחב
    1. למחרת (יום 1), שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 בארות של תאי iPS אנושיים. החלף כל באר של צלחת 6 בארות עם 5 מ"ל של מדיום אינדוקציה Mesoderm לרוחב (טבלה משלימה S1). בעת הגדלת כלי התרבות (למשל, צלוחיות), בדרך כלל, החלף פי 3 את נפח העבודה בכלי התרבית.
    2. אל תשנה מדיום זה במשך 3 ימים.
      הערה: מדיום אינדוקציה לרוחב Mesoderm בבארות בדרך כלל ישנה את צבעו מאדום לצהוב כאשר התאים משתמשים בחומרים המזינים. עם זאת, בינוני מעונן או בינוני עם צמיחת חיידקים אינו נורמלי ויש לפרק ולהשליך אותו ככזה.
  3. ימים 4-6: אינדוקציה של תאי אנדותל
    1. שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת 6 הבארות. החלף כל באר של צלחת 6 בארות עם 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אנדותליאלי חם (טבלה משלימה S1). לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
    2. במשך היומיים הבאים (ימים 5 ו -6), לאסוף את המדיום בילה מכל הבארות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. אחסן את הצינור החרוטי ב 4 °C. לחדש את התאים עם 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אנדותל חם. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. יום 7: מיון תאי אנדותל (viEC)
    1. מוציאים מטריצת קרום מרתף 3 צלוחיות ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    2. הכן 50 מ"ל של מאגר MACS (טבלה משלימה S1).
    3. הניחו את מאגר ניתוק התאים, מאגר MACS, CCM אנדותליאלי ו-PBS (ללא Ca 2+ ו-Mg2+) על קרח במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
    4. הניחו את המגנט על מעמד ה-MACS. מניחים שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל במחזיק צינור חרוטי.
    5. הניחו את מעמד ה-MACS (עם מגנט מחובר) ועמוד LS אחד במכסה המנוע של תרבית הרקמה. הגדר את מחזיק הצינור החרוטי (עם צינורות חרוטיים בתוכו) על מעמד ה-MACS, מתחת למגנט (איור משלים S1A).
    6. אסוף את המדיום בילה מכל באר של צלחת 6 באר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל משלב 4.3.2. שטפו כל באר של צלחת 6 בארות עם PBS (Ca 2+ ו- Mg2+ חינם).
    7. שאפו את ה-PBS. הוסף 1 מ"ל של מאגר ניתוק תאים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות כדי לנתק את התאים לחלוטין.
    8. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הבא את ההשעיה התא ל 15 מ"ל עם CCM אנדותל קר. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. שאפו את הסופר-נטנט. השהה את התאים ב-1 מ"ל של מאגר MACS קר. לספור את התאים עם hemocytometer.
    10. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS להשעיית התא. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 × גרם בטמפרטורת החדר.
    11. שאפו את הסופר-נטנט. השהה את התאים ב-80 μL של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים. הוסף 20 μL לכל 10 מיליון תאים של ריאגנט חוסם FcR, מיקרובי CD31 ומיקרובי CD144. דגירה במשך 15 דקות על קרח.
    12. בזמן שתרחיף התאים דוגר, צנטריפוגה של המדיום שנאסף מהשראת אנדותל (שלב 4.3.2) ב-200 × גרם למשך 10 דקות.
    13. אסוף את הסופרנטנט במסנן ואקום של 500 מ"ל 0.22 מיקרומטר. הכן את המדיום המותנה באנדותל (טבלה משלימה S1). מסננים את המדיום בתנאים סטריליים ושומרים על חום בינוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: קצב התפשטות תאי האנדותל יתחיל לרדת לאחר מעבר 3. כדי להשיג צמיחה מעריכית לאחר מעבר 3, ניתן להשלים את האנדותל מותנה ואמצעי תחזוקה עם מעכב TGF-Beta 10 μM (SB431542) החל ממעבר 1.
    14. לאחר הדגירה של 15 דקות בשלב 4.4.11, הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS לכל 10 מיליון תאים (מאגר MACS מרבי של 30 מ"ל) לתרחיף התא. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
    15. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות ב-1 מ"ל של מאגר MACS.
    16. קח את עמוד LS ומשוך את הבוכנה מתוך המזרק. החזירו את הבוכנה לשרוול הפלסטיק. הניחו את העמוד על המגנט.
    17. מקם את הצינור החרוטי הראשון של 50 מ"ל מתחת לעמודה. הוסף 1 מ"ל של מאגר MACS לעמודה. לאסוף את הצינור החרוטי 50 מ"ל מתחת.
    18. תן לנוזל לזרום דרך, אם כי לא לחלוטין כדי למנוע את הטור מלהתייבש. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, הוסף את השעיית התא לעמודה. לאסוף את flowthrough באותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
    19. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, מקמו את הצינור החרוטי הבא של 50 מ"ל מתחת לעמודה. הוסף את הזרימה הראשונית (שלב 4.4.18) לעמודה. לאסוף את הצינור החרוטי 50 מ"ל מתחת.
    20. כאשר טיפות הנוזל מתחילות לטפטף לאט, הוסף 500 μL של מאגר MACS 3x כדי לשטוף את העמודה.
    21. הסר את העמודה מהמגנט. מניחים את העמודה על צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של PBS קר לעמודה.
    22. כדי לאסוף את התאים, קח את הבוכנה משרוול הפלסטיק ודחף אותה בחוזקה לתוך העמוד.
    23. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הבא את ההשעיה התא ל 5 מ"ל עם PBS. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם.
    24. בזמן שהתאים עוברים צנטריפוגה, שטפו את מטריצת קרום המרתף 3-ציפוי בקבוקון 3x עם 5 מ"ל של PBS כדי להתכונן לזריעת תאים. שאפו את ה- PBS והוסיפו 20 מ"ל של מדיום מותנה אנדותליאלי למטריצת קרום המרתף 3 מצופה בקבוקון.
    25. הסר את התאים מהצנטריפוגה ושאף את הסופרנטנט. יש לתלות את התאים במדיום מותנה אנדותליאלי כדי לזרוע אותם ב-26,000 תאים/ס"מ2 (1.95 × 106 תאים /בקבוקון T75). זרע את התאים.
    26. כדי לחשב את יעילות המיון ותפוקת התאים, חלק את ספירת התאים משלב 4.4.23 בספירת התאים משלב 4.4.9.
  5. ימים 8-15: הרחבת viECs
    1. למחרת (יום 8), לשאוף את המדיום בילה מן הבקבוק. החלף עם 10 מ"ל של אנדותל מותנה בינוני. יש להחליף את המדיום המותנה באנדותל אחת ליומיים עד שהבקבוקון יהיה 90% מחובר או עד לשימוש מלא בבקבוק הבינוני המותנה באנדותל.
    2. שאפו את המדיום המבוזבז והחליפו ב-10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי (טבלה משלימה S1) כל יומיים להמשך הרחבה.
    3. כדי להעביר את viECs, להכין שתי מטריצת קרום מרתף 3-מצופה T75 צלוחיות. השאירו את הצלוחיות בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו היטב את הבקבוקונים הטריים 3x עם 5 מ"ל של PBS.
    4. שאפו את ה-PBS. הוסף 10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם לכל בקבוקון טרי מוכן. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מוכנים לזריעה כמתואר להלן.
    5. הוסף 5 מ"ל של מאגר ניתוק תאים לבקבוקון T75 בעל מפגש של 90% של viECs. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-7 דקות. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש להוסיף 5 מ"ל של DMEM/F12 חם. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
    6. שאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות ב-1 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם. הוסף 500 μL של מתלה התא לכל אחד מהצלוחיות T75 המוכנות הטריות.
    7. למחרת, לשאוף את המדיום בילה. החלף עם 10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותל. שאפו את המדיום המבוזבז והחליפו ב-10 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי כל יומיים עד שהבקבוקון יהיה 90% נפגש.

5. יום 14: הכנת מכשירי שבבי איברים מיקרופלואידיים לתרבית תאים

  1. טיפול פלזמה ומטריצת קרום מרתף 2 ציפוי
    1. הכן מטריצת קרום מרתף 2 פתרון (שלב 1.3). הניחו אותו בצד.
    2. במכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית, פרקו את צלחת הפטרי העגולה בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ. מקם את החלק העליון של צלחת פטרי, פונה כלפי מטה, מתחת לתחתית צלחת פטרי (איור משלים S1B).
    3. בעזרת פינצטה, מוציאים את השבבים המיקרופלואידיים מהאריזה ומניחים אותם בתוך צלחת פטרי. סגרו את צלחת הפטרי באמצעות המכסה שמתחת לתבשיל.
    4. בפתח הפלזמה, הניחו את מכסה צלחת פטרי מתחת לצלחת, כשהחלק העליון פונה כלפי מטה, ושומרים אותם יחד כיחידה אחת. הניחו את יחידת צלחת הפטרי בתא אשר הפלזמה. התחל את אשר פלזמה עם חמצן ב 100 W, 15 SCCM, 30 שניות.
    5. רגישות לזמן: לאחר סיום הטיפול, הוציאו את יחידת צלחת פטרי מאשרת הפלזמה. נגבו במהירות ובעדינות את מכסה צלחת הפטרי עם 70% אתנול שרוסס על מגבון מעבדה. מכסים את צלחת הפטרי במכסה שלה.
    6. הביאו את צלחת הפטרי למכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית. הוסף בעדינות 25 μL של תמיסת מטריצת קרום מרתף 2 לערוץ השתן (העליון) של השבב. הוסף 20 μL של מטריצת קרום מרתף 2 פתרון לתוך הערוץ הנימי (התחתון) של השבב.
    7. קח שני כובעי צינור חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל ומלא אותם במים מזוקקים סטריליים (~ 500 μL). הניחו את הפקק בצלחת הפטרי כדי למנוע את התייבשות תעלות השבב והממברנה. מניחים את המכסה על הכלים. דגירה ב-37 °C ללילה.

6. זריעה של viECs ותאי מזודרם ביניים לתוך התקנים microfluidic

  1. יום 15: viECs
    1. שאפו את המדיום מ-T75-צלוחיות המכילות 90% מפגשים של viECs. יש להוסיף 5 מ"ל של מאגר ניתוק תאים ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-7 דקות.
    2. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של DMEM/F12. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
      הערה: כל בקבוקון T75 עם כ-90% נוכחות של viECs יניב ~3 מיליון תאים.
    3. שאפו את הסופר-נטנט. החזירו את התאים ל-300 μL של מדיום תחזוקת האנדותל כדי לקבל כ-2 מיליון תאים/300 μL. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. הניחו את מתלה התא בצד.
    4. מעבירים את צלחת הפטרי המכילה את השבבים המיקרופלואידיים למכסה המנוע של תרבית הרקמה. חברו קצה מחסום P200 לקצה השואף.
    5. שטפו הן את הערוצים העליונים והן את הערוצים התחתונים של השבב המיקרופלואידי עם 200 μL של DMEM/F12 ובמקביל שאפו לפריפריה של השקע.
    6. החזק את השבב בחוזקה כאשר קצה מחסום P200 מחובר לאספירטור, הרחק מהשקע של הערוץ התחתון. הזריקו בחוזקה 20 μL של מתלה viEC עם כ -134,000 תאים לתוך הערוץ הנימי (התחתון) של השבב. בזהירות לשאוף מדיום מן הפריפריה של מוצא.
    7. בדוק מתחת למיקרוסקופ אם יש בועות או צפיפות זריעה לא אחידה של viEC.
    8. הפוך בעדינות את השבב כדי להפוך אותו כך שה- viECs יוכלו להיצמד לצד הבסיסי של קרום PDMS הגמיש. הכנס את השבב למחסנית המחזיק. הוסף 3 מ"ל של PBS למחסנית מחזיק השבב כדי למנוע את התייבשות הממברנה. לדגום את השבב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    9. בדוק את התעלה התחתונה מתחת למיקרוסקופ עבור שכבה מקבילה של viECs המחוברים לממברנת PDMS הגמישה. יש לטפטף 200 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי על פתח הערוץ התחתון ולאפשר לו לזרום דרך הערוץ כדי לשטוף את הערוץ של תאי אנדותל לא מחוברים תוך שאיפה זהירה מהפריפריה של מוצא הערוץ הנימי (התחתון).
    10. החלף את השבב בחזרה למחסנית המחזיק. דגירה ב-37 °C ללילה.
  2. יום 16: תאי מזודרם ביניים (IM)
    1. שטפו בעדינות את התעלה הנימית (התחתונה) עם 200 μL של מדיום תחזוקת אנדותל תוך שאיפה קפדנית לפריפריה של יציאת היציאה.
    2. יש לשטוף את תעלת השתן (העליונה) עם 200 μL של DMEM/F12 תוך שאיפה קפדנית לשולי השקע. שחרר ~ 50 μL של DMEM / F12 על פתחי הכניסה והיציאה.
    3. שאפו את מדיום אינדוקציה Mesoderm ביניים מכל באר של צלחת 12 בארות.
      הערה: כל באר בסוף ההתמיינות נותנת כ-1.5 מיליון תאי IM.
    4. יש להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת 12 בארות ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. גרד בעדינות את התאים באמצעות מרים תאים, ופיפט למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים באמצעות P1000. הוסף 2 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין (טבלה משלימה S1) לכל באר. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הביאו את נפח מתלי התא ל-50 מ"ל עם DMEM/F12 וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות.
    6. שאפו את הסופר-נטנט. החזירו את התאים ב-500 μL של מדיום אינדוקציה ביניים Mesoderm כדי לקבל כ-3 מיליון תאים/500 μL. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר.
    7. החזק את השבב בחוזקה כאשר קצה מחסום P200 מחובר לאספירטור, הרחק מהשקע של ערוץ השתן (העליון). להזריק בחוזקה 25 μL של תרחיף התא עם כ 112,500 תאי IM לתוך ערוץ השתן (העליון) של השבב, בזהירות לשאוף את המדיום מן הפריפריה של השקע.
    8. בדוק מתחת למיקרוסקופ אם יש בועות או צפיפות זריעה לא אחידה של תאי IM. הוסף 3 מ"ל של PBS למחסנית מחזיק השבב. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
    9. שטפו את שני הערוצים עם 200 μL של מדיום תרבית התאים המתאים להם, תוך שאיפה זהירה לפריפריה של שקעי השבב כדי לסייע במניעת זרימה לאחור של פסולת המדיום והתאים.
    10. חברו קצוות מחסום P200 ריקים לשני השקעים של תעלות השתן והנימים. Pipette 200 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ הנימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצוות פיפטה מלאים במדיום.
    11. Pipette 200 μL של תחזוקת IM בינוני ולהזריק חצי לתוך פתח ערוץ השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצוות פיפטה מלאים במדיום. דגרו את השבבים בעזרת קצוות המוטמעים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. חבר שבבים לביוריאקטור של שבב איברים כדי להפעיל זרימת נוזלים ומתח מכני.
    1. הסר טיפים P200 מתעלות השתן והנימים. הוסיפו טיפות של מדיה מתאימה לכניסה ולשקע של תעלות השתן והנימים כדי למנוע התייבשות.
    2. הוסף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה פודוציטים חם (טבלה משלימה S1) למאגר כניסת השתן. הוסף 3 מ"ל של מדיום תחזוקת אנדותל חם למאגר הכניסה הנימי.
    3. הוסף 300 μL של מדיום אינדוצין פודוציטים חם למאגר מוצא תעלת השתן ישירות מעל יציאת היציאה. הוסף 300 μL של מדיום תחזוקה אנדותליאלי חם למאגר יציאת התעלה הנימית ישירות מעל יציאת היציאה.
    4. החליקו את התרמילים על המגש ולתוך הביוריאקטור של שבבי האיברים.
    5. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור של שבב האיברים כדי לבחור ולהתחיל את מחזור הפריים (2 דקות). בדוק באופן חזותי את החלק התחתון של התרמיל לאיתור טיפות קטנות בכל ארבע יציאות הנוזלים.
    6. כדי להשיג מגע נוזלי-נוזלי בין החלק התחתון של ה-Pod לבין יציאות השבב המיקרופלואידי, החלק בעדינות את מנשא השבב לתוך ה-Pod. לחצו בעדינות על לשונית מנשא השבב פנימה ולמעלה. שאפו מדיום עודף ממשטח השבב.
    7. הגדר את קצב הזרימה של ביוריאקטור שבב איברים ל-60 μL/h. הגדר את הזן המחזורי ל-10% ב-0.4 הרץ. השתמש בחוגה הסיבובית על ביוריאקטור שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הוויסות ולהפעיל במשך 2 שעות.
    8. בדוק חזותית את מאגרי מוצא עבור עלייה ברמת המדיום.
    9. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הסידור.

7. ימים 17-21 ואילך: אינדוקציה פודוציטים ותחזוקת שבבים

  1. שאפו את המדיום ממאגרי היציאה של תעלת השתן באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר בכל יום של תרבות. לחדש את מאגר פתח השתן עם עד 3 מ"ל של Podocyte אינדוקציה בינונית כל 2 ימים במשך 5 ימים.
    1. לאחר 5 ימים, לשאוף את המדיום מן ערוץ השתן אבל לשמור על כמה מדיום במאגר. לחדש את מאגר פתח השתן מדי יום עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה Podocyte.
  2. שאפו את המדיום ממאגרי היציאה הנימיים באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר בכל יום של תרבות. חדש את מאגר כניסת התעלה הנימית מדי יום עם עד 3 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי.

8. בדיקה תפקודית והדמיית אימונופלואורסצנציה

הערה: ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים על ניתוח ציטומטריה של זרימה, ELISA עבור שפכי שבב ובידוד mRNA.

  1. בדיקה פונקציונלית (סינון מולקולרי) באמצעות אינולין ואלבומין
    1. שאפו את המדיום ממאגר מוצא התעלה הנימית באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר. החלף עם 3 מ"ל של מדיום תחזוקה אנדותליאלי בתוספת אינולין ואלבומין (טבלה משלימה S1) במשך 6 שעות.
    2. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, מודדים את הנפח (במ"ל) של המדיום מערוץ השתן ומעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש לעטוף את השפופרת בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ולמזער את ההלבנה של אינולין ואלבומין מצומדים לפלואורופור. לחדש את המאגר עם 3 מ"ל של פודוציט תחזוקה בינוני.
    3. הכינו פתרון מלאי של אינולין במדיום תחזוקה של פודוציטים. החל מ-25 מיקרוגרם/מ"ל אינולין, הכינו שמונה תקנים של אינולין באמצעות דילול טורי פי 2 במדיום תחזוקה של פודוציטים.
    4. באופן דומה, הכינו פתרון מלאי של אלבומין במדיום תחזוקה של פודוציטים. החל מ-150 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין, הכינו שמונה תקנים של אלבומין באמצעות דילול סדרתי פי 2 במדיום תחזוקה של פודוציטים.
    5. פיפטה ב-100 μL משוכפלים של כל ריכוז אינולין סטנדרטי לתוך כל באר של צלחת שחורה, 96 בארות (או 16 בארות סה"כ של אינולין). פיפטה בשכפול 100 μL של כל ריכוז אלבומין סטנדרטי לתוך כל באר של אותה צלחת 96 באר (16 בארות סה"כ של אלבומין). פיפטה במדיום תחזוקה כפול של 100 μL Podocyte כדי לשמש כריק (או שתי בארות סה"כ של מדיום תחזוקה Podocyte).
    6. פיפטה בשכפול 100 μL של תווך שפכים מתעלת השתן לתוך כל באר של אותה צלחת 96 באר. פיפטה בשכפול 100 μL של תווך שפכים מן הערוץ הנימי.
    7. הכנס את הצלחת לקורא הלוחות ומדוד את הפלואורסצנטיות של אלבומין בעירור 550 ננומטר ופליטה 615 ננומטר. מדוד את אותה צלחת עבור אינולין בעירור 513 ננומטר ופליטה 577 ננומטר.
    8. מהנתונים שנוצרו, ממוצע המדידות הכפולות (לכל שבב). הפחת את הערך הריק המתאים לקריאת לוח זה משאר הנתונים בגיליון.
    9. התווה את הערכים המתאימים לתקני האלבומין כדי ליצור עקומה סטנדרטית עם ריכוז [μg/mL] על ציר ה-x ופלואורסצנציה על ציר ה-y. התווה את הערכים המתאימים לתקני האינולין כדי ליצור עקומה סטנדרטית עם ריכוז [μg/mL] על ציר x ופלואורסצנטיות על ציר y.
    10. השתמש בחבילת תוכנה לניתוח סטטיסטי ובאינטרפולציה ליניארית כדי לקבוע את ריכוז האינולין והאלבומין בשתן בהתאמה, בתווך הקולחין מהשבבים.
    11. קבע את מרווח השתן של אינולין/אלבומין מהשבבים באמצעות משוואה (1)2:
      פינוי שתן = ([U] × UV) / [P] (1)
      כאשר [U] הוא ריכוז השתן משלב 8.1.10, UV הוא נפח שפכי תעלות השתן שנאספו משלב 8.1.2, ו-[P] הוא הריכוז הנימי של אינולין או אלבומין (10 מיקרוגרם/מ"ל אינולין או 100 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין).
  2. הדמיה אימונופלואורסצנטית
    1. הזריקו קצה P200 ריק ליציאות היציאה של תעלות השתן והנימים. כדי לתקן את התאים, פיפטה 200 μL של 4% פורמלדהיד ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ התחתון. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    2. Pipette 200 μL של 4% פורמלדהיד ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים כעת לקצות פיפטה מלאים בקיבוע.
    3. לדגור את השבבים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    4. לאחר 20 דקות, השליכו את כל קצות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לחדור לתאים, פיפטה 200 μL של 0.125% טריטון X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח ערוץ נימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    5. Pipette 200 μL של 0.125% Triton X-100/PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור את השבב בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    6. השליכו את כל קצוות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לחסום את התאים, פיפטה 200 μL של 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב 0.125% Triton X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח הערוץ הנימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    7. Pipette 200 μL של 1% BSA ב 0.125% Triton X-100 / PBS ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח צינור השתן. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    8. השליכו את כל קצוות הפיפטה. יש לשטוף את שני הערוצים פי 3 על ידי הזרמת 200 μL של 0.125% Triton X-100/PBS לכל ערוץ ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    9. הכן 100 μL של נוגדן ראשוני לכל ערוץ עם הדילול המומלץ על ידי היצרן ב 0.125% Triton X-100 / PBS. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. Pipette 100 μL של נוגדן ראשוני ולהזריק חצי לתוך הערוצים המתאימים. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה.
    10. דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או, לקבלת תוצאות טובות יותר, לילה ב 4 °C (60 °F).
      הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים בבת אחת; עם זאת, יש לדלל את תמיסת הנוגדנים העיקרית בהתאם להוראות היצרן.
    11. שטפו את הערוצים 3 x 10 דקות כמתואר בשלב 8.2.8.
    12. הכן 100 μL של נוגדן משני לכל ערוץ עם מקדם הדילול המומלץ על ידי היצרן ב- 0.125% Triton X-100/PBS. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. Pipette 100 μL של נוגדן משני ולהזריק חצי לתוך הערוצים המתאימים. שחררו את קצות הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להשתמש בכל נוגדן משני בנפרד. יש לשטוף לפחות 3 x 10 דקות בין כל יישום בהתאם לשלב 8.2.8.
    13. שטפו את הערוצים 3 x 10 דקות כמתואר בשלב 8.2.8.
    14. יש לשטוף את שני הערוצים פעם אחת עם 200 μL של מים מזוקקים תוך שאיפת שאריות הנוזל מהפריפריה של יציאות יציאת השבב.
    15. הזריקו P200 נקי וריק ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לנטרל את התאים, פיפטה 200 μL של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, דילול 1:1,000 במים מזוקקים) ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח ערוץ נימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה, ופיפטה 200 μL של DAPI והזריקו מחצית ממנו לכניסת תעלת השתן. משחררים את קצה הפיפטה בתוך הכניסה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    16. השליכו את כל קצוות הפיפטה. הזרימו קצוות P200 נקיים וריקים ליציאות המוצא של תעלות השתן והנימים. כדי לנטרל את התאים, פיפטה 200 μL של phalloidin (דילול 1:1,000 ב- PBS ללא Ca 2+ ו- Mg2+) ולהזריק מחצית ממנו לתוך פתח התעלה הנימי ולשחרר את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. פיפטה 200 μL של phalloidin (דילול 1:1,000 ב- PBS ללא Ca 2+ ו- Mg2+) ולהזריק מחצית ממנו לתוך פתח תעלת השתן ולשחרר את קצה הפיפטה בתוך הכניסה. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
    17. שטפו את הערוצים פי 3 עם 200 μL של PBS ללא Ca 2+ ו-Mg2+, ושאפו לנוזלים עודפים מהפריפריה של יציאות היציאה.
    18. דמיינו את השבבים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מראים כי מודל תלת-ממדי פונקציונלי במבחנה של הגלומרולוס יכול לעבור כלי דם ואפיתל ממקור איזוגני של תאי iPS אנושיים. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מספק הוראות כיצד ליישם את טכנולוגיית תאי ה- iPS האנושיים, במיוחד את יכולתם להתמיין לסוגי תאים מיוחדים, כדי ליצור אפיתל גלומרולרי בכליות (פודוציטים) ואנדותל כלי דם (viECs) שניתן לשלב עם התקנים מיקרופלואידיים כדי למדל את המבנה והתפקוד של הכליה האנושית ברמה הספציפית למטופל. סקירה סכמטית של הפרוטוקול וציר הזמן הזה (איור 1A) מתארת כיצד לתרבת תאי iPS אנושיים פעילים מיטוטית...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול לגזירת אנדותל וסקולרי ואפיתל גלומרולרי (פודוציטים) מקו תאי iPS אנושי איזוגני ואת השימוש בתאים אלה כדי להנדס מערכת תלת-ממדית של איבר על שבב המחקה את המבנה, ממשק הרקמה-רקמה ותפקוד הסינון המולקולרי של גלומרולוס הכליה. שבב גלומרולוס זה מצויד באנדותל ובאפיתל גלומרולרי, אשר יחד מספקים מחסום לסינון סלקטיבי של מולקולות.

חוקרים המעוניינים להתאים פרוטוקול זה צריכים לעשות את השיקולים הבאים: ראשית, אופטימיזציה עשויה להיות נחוצה לזריעת תאים בהתאם למאפייני הגדילה האינהרנטיים ש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. הוא ממציא על פטנט הקשור להתמיינות פודוציטים מתאי iPS אנושיים. למחבר השני אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר להנדסה ע"ש פראט באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה במחלקה לרפואה של דיוק, מלגת וייטהד במחקר ביו-רפואי ופרס מחקר ג'ננטק עבור ס. מוסא. י. רוי זכה במלגת קרן אוניברסיטת דיוק-אלפרד פ. סלואן ובמלגת ויליאם מ. "מונטי" רייכרט מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת דיוק. קו תאי ה-iPS של DU11 (שיבוט #11) של אוניברסיטת דיוק נוצר במתקן הליבה של Duke iPSC וסופק לנו על ידי מעבדת בורסאק באוניברסיטת דיוק. המחברים מודים לנ 'אבוטאלב, ג'יי הולמס, ר 'בהאטצ'אריה וי' ג'ואו על סיוע טכני ודיונים מועילים. המחברים רוצים גם להודות לחברי מעבדת מוסח על הערות מועילות על כתב היד. המחברים מודים למעבדת סגורה על המתנה של ציטומטר זרימה Acuri C6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<נוגדנים חזקים>
Alexa Fluor 488- ו-Alexa Fluor 594-נוגדנים משניים מצומדיםThermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
קולגן IVThermo/Life Technologies14-9871-82
NephrinProgenGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
<חזק>מטריצות ממברנת מרתף
קורנינג פיברונקטין,קרנינג356008קרום בסיס (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) שבראיוואי צפון אמריקהN8922012מטריצת ממברנת הבסיס (2)
מטריצה מוסמכת hESC של Matrigel, בקבוקון 5 מ"לBD Biosciences354277מטריצת ממברנת הבסיס (1); עשויה להראות שונות ממנה לאצווה
<תאים חזקים>תאים
DU11 תאיiPS אנושייםקו תאי ה-iPS של אוניברסיטת דיוק (שיבוט #11) של אוניברסיטת דיוק נוצר במתקן הליבה של דיוק iPSC וסופק לנו על ידי מעבדת Bursac באוניברסיטת דיוק. הקו נבדק ונמצא נקי ממיקופלזמה (בדיקה אחרונה בנובמבר 2021) והפרעות קריוטיפ (יולי 2019)
<חזק>גורמי גדילה בינוניים ותוספי מדיה
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
2-MercaptoethanolThermo/Life Technologies21985023
אלבומין מסרום בקר, טקסס אדום מצומדThermo/Life TechnologiesA23017
חומצה רטינואית All-trans (500 מ"ג)Stem Cell Technologies72262
B27 תוסף תזונה ללא סרוםThermo/Life Technologies17504044
תוסף B-27 (פי 50) ללא ויטמין AThermo/Life Technologies12587010
אלבומין בסרום בקרSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004עשוי להראות וריאציה של אצווה לאצווה
ערכה בינונית מלאה עם CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-Rמדיה לתחזוקת פודוציטים
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028-DMEM
/F12 עם תוסף GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042-DMEM/F12 עם גלוטמין
פורסקולין (מפעיל אדניליל ציקלאז)Abcamab120058
תוסף GlutaMAXתרמו/לייף טכנולוגיות35050061תוסף גלוטמין
FBS Thermo/Life Technologies10082147
תמיסת הפריןתאי גזע7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
BMP4 אנושיPreprotech120-05ET
Human BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
Human VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 טכנולוגיותתאי גזע05850מדיה של תרבית תאי iPS אנושית (CCM). הוסף תוספת פי 5 לפי היצרן. ניתן לאחסן iPS CCM אנושי עד 6 חודשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
תוסף N-2 (100x)Thermo/Life Technologies17502048
מדיה נוירו-בזאליתThermo/Life Technologies21103049מדיה בסיסית מזודרם לרוחב
PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט)Thermo/Life Technologies14190-250
פניצילין-סטרפטומיצין, נוזל (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK מעכב (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011מדיום תרבית תאי אנדותל (CCM). הוסף תוסף בהתאם ליצרן. ניתן לאחסן CCM אנדותל עד שבועיים בטמפרטורה של 4 מעלות; C או -20 ו-deg; C עד 6 חודשים.
מעכב TGF-Beta (SB431542)Stem Cell Technologies72234
<חזק>אנזימים וריאגנטים אחרים
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501מאגר ניתוק תאים
דימתיל סולוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2438
תמיסת אתנול, 70% (נפח/נפח), VWR בדרגת ביוטכנולוגיה97065-058
Paraformaldehyde (PFA)Thermo/Life Technologies28906
מים מזוקקים סטרילייםThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) מודול רכזתלחקותORB-HM1
צלחת פטרי עגולה 100 מ"מ x 15 מ"מפישרברנדFB087579B
120 x 120 מ"מ צלחת תרבית תאים מרובעתVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
פיפטות שאיבה, עטופות בנפרדקורנינג29442-462
יחידת שאיבהSP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R צנטריפוגהבקמן קולטרB99516
צינור צנטריפוגה חרוטית, צינורקורנינג
50 מ"לקורנינג352098
EVOS M7000טכנולוגיות תרמו/חייםAMF7000מיקרוסקופ פלואורסצנטי לצילום תמונות של קבוע ומוכתם. תאים.
המוציטומטרVWR100503-092
חממת CO2 Heracell VIOS 160iThermo/Life Technologies51030403
הפוכה Zeiss Axio Observer מצויד במצלמת AxioCam 503Carl Zeiss Micrscopy491916-0001-000 (מיקרוסקופ) ; 426558-0000-000 (מצלמה)
כפפות ניטריל קימברלי-קלארקVWR40101-346
Kimwipes, גדולVWR21905-049
Leoca SP8 מיקרוסקופ
מאגר מדיה (מודול נייד POD)לחקותPOD-1
VWR12620-926
שבב איברלחקותS-1 שבב
מחזיק שבב איברלחקותAK-CCR
P10 קצות פיפטה מחסום מדויקותדנוויל סיינטיפיקP1096-FR
P100 קצות פיפטה מחסוםדנוויל סיינטיפיקP1125
P1000 קצות פיפטה מחסוםדנוויל סיינטיפיקP1121
P20 קצות פיפטה מחסוםדנוויל סיינטיפיקP1122
P200 קצות פיפטה מחסוםדנוויל סיינטיפיקP1122
פלזמה אשרמניין טקK1050X RFתחריט פלזמה/אשר/מנקה פלזמה זה שימש כחלק ממתקן מכשור החומרים המשותפים (SMiF) של אוניברסיטת דיוק.
מבחנה פוליסטירן תחתון עגול עם מכסה הצמד מסננת תאים352235קורנינג
10 מ"ל, עטופה בנפרדקורנינג356551
פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל, פיפטה סרולוגית קורנינג 356525
, 5 מ"ל, עטופהקורנינג356543
סטריפליפ, 0.22 ומיקרו; m, PESEMD MilliporeSCGP00525
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטרילייםתומאס סיינטיפיק1138W14
T75cm2 בקבוק תרבית תאים עם מכסה אוורורקורנינג430641U
12 צלחות באר שטופלו בתרבית רקמותקורנינג353043
תרבית רקמות 6 צלחות בארקורנינג353046
מודולטור ואקום ומשאבה פרסטלטית (מודול תרבות Zoe)לחקותZOE-CM1שבב איברים ביו-ריאקטור
VE-Cadherin CD144 נוגדן אנטי אנושי - APC מצומדMiltenyi Biotec130-126-010
מרים תאים רחב שיפועCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, אנושיMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 MicroBead Kit, אנושיMiltenyi Biotec130-091-935
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
אנושי טכנולוגיות בינוניות צנטריפוגה חרוטי 352097 15 מ"ל, קונפוקלי זקוף שייקר מיקרופלייט פיפטה סרולוגית , עטופה בנפרד בנפרד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812(2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967(2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles