הדמיה ברזולוציה גבוהה ללא תוויות המופעלת על ידי הדמיה רטט של רקמה נפוחה וניתוח

סיכום

על ידי שילוב כימיה של הידרוג'ל להרחבת דגימה עם מיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה ספציפי לכימיקלים ללא תווית, הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג הדמיה נפחית ברזולוציה גבוהה ללא תוויות בדגימות ביולוגיות. עם אלגוריתם פילוח תמונות נוסף של למידת מכונה, התקבלו תמונות מרובות רכיבים ספציפיות לחלבון ברקמות ללא תיוג נוגדנים.

תקציר

השימוש האוניברסלי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, במיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, קידם מאוד את הידע על הביולוגיה המודרנית. לעומת זאת, הדרישה לתיוג פלואורופור בטכניקות פלואורסצנטיות מציבה אתגרים משמעותיים, כגון פוטוהלבנה ותיוג לא אחיד של בדיקות פלואורסצנטיות ועיבוד דגימות ממושך. בפרוטוקול זה מוצגים נהלי העבודה המפורטים של הדמיית רטט של רקמה נפוחה וניתוח (VISTA). VISTA עוקף מכשולים הקשורים לפלואורופורים ומשיג הדמיה נפחית ברזולוציה גבוהה ללא תוויות בדגימות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית של עד 78 ננומטר. ההליך נקבע על ידי הטמעת תאים ורקמות בהידרוג'ל, הרחבה איזוטרופית של היברידית דגימת ההידרוג'ל והדמיה של התפלגויות חלבון אנדוגניות על ידי הדמיית רטט עם מיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה. השיטה מודגמת הן על תאים והן על רקמות מוח של עכברים. נצפו תמונות VISTA ואימונופלואורסצנטיות בקורלציה גבוהה, המאמתות את מקור החלבון של ספציפיות ההדמיה. תוך ניצול מתאם כזה, אלגוריתם פילוח תמונה מבוסס למידת מכונה אומן להשיג חיזוי רב-רכיבי של גרעינים, כלי דם, תאים עצביים ודנדריטים מתמונות מוח של עכברים ללא תוויות. ההליך הותאם עוד יותר כדי לחקור אגרגטים פתולוגיים של פולי-גלוטמין (polyQ) בתאים ופלאק עמילואיד-בטא (Aβ) ברקמות מוח עם תפוקה גבוהה, מה שמצדיק את הפוטנציאל שלו לדגימות קליניות בקנה מידה גדול.

מבוא

התפתחות שיטות הדמיה אופטית חוללה מהפכה בהבנת הביולוגיה המודרנית מכיוון שהן מספקות מידע מרחבי וזמני חסר תקדים של מטרות בקני מידה שונים, מחלבונים תת-תאיים ועד איברים שלמים¹. ביניהם, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא המבוססת ביותר, עם פלטה גדולה של צבעים אורגניים עם מקדמי הכחדה גבוהים ותפוקות קוונטיות², חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית קלים לשימוש³, ושיטות ברזולוציה גבוהה כגון STED, PALM ו-STORM להדמיית מבנים בקנה מידה ננומטרי ^4,5. בנוסף, ההתקדמות האחרונה בהנדסת דגימות וכימיה לשימור, המרחיבות דגימות המוטמעות בהידרוג'לים פולימריים מתנפחים ^6,7,8, מאפשרות רזולוציה מוגבלת של תת-עקיפה במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונבנציונליים. לדוגמה, מיקרוסקופ הרחבה טיפוסי (ExM) משפר ביעילות את רזולוציית התמונה פי ארבעה עם הרחבת דגימה איזוטרופית^{פי ארבעה 7}.

למרות יתרונותיו, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה חולקת מגבלות שמקורן בתיוג פלואורופור. ראשית, פוטו-הלבנה והשבתה של פלואורופורים פוגעים ביכולת להערכות פלואורסצנטיות חוזרות וכמותיות. פוטוהלבנה היא אירוע בלתי נמנע כאשר האור ממשיך לשאוב אלקטרונים למצבים מעוררים אלקטרונית⁹. שנית, תיוג הפלואורופורים למטרות הרצויות אינו תמיד משימה פשוטה. לדוגמה, צביעה חיסונית דורשת תהליך הכנת דגימה ארוך ומייגע ומעכבת את תפוקת ההדמיה¹⁰. זה יכול גם להכניס חפצים עקב תיוג נוגדנים לא הומוגני, במיוחד עמוק בתוך רקמות¹¹. יתר על כן, אסטרטגיות תיוג מתאימות המכוונות לפלואורופורים עבור החלבונים הרצויים עשויות להיות לא מפותחות. לדוגמה, נדרשו בדיקות נרחבות כדי למצוא נוגדנים יעילים לפלאק Aβ¹². לצבעים אורגניים קטנים יותר, כגון אדום קונגו, יש לרוב ספציפיות מוגבלת, ורק מכתימים את ליבת רובד Aβ. לכן, רצוי מאוד לפתח שיטת סופר-רזולוציה נטולת תוויות העוקפת את החסרונות של תיוג פלואורופור ומספקת הדמיה משלימה ברזולוציה גבוהה מתאים לרקמות, ואפילו לדגימות אנושיות בקנה מידה גדול.

מיקרוסקופ ראמאן מספק ניגודיות ללא תוויות למבנים ספציפיים לכימיקלים וממפה את התפלגות הקשרים הכימיים הבלתי נראים אחרת על ידי התבוננות במעברי הרטט הנרגשים¹³. בפרט, הדמיית פיזור רמאן מגורה (SRS) על דגימות ללא תוויות או עם תווית זעירה הוכחה כבעלת מהירות ורזולוציה דומות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית^14,15. לדוגמה, אזור בריא במוח נבדל בקלות מאזור שחדר לגידול ברקמות אנושיות ועכברים ^16,17. פלאק Aβ צולם בבירור גם על ידי התמקדות ברטט חלבון CH₃ (2940 ס"^מ-1) ואמיד I (1660 ס"^מ-1) על פרוסת מוח קפואה טרייה ללא כל תיוג¹⁸. פיזור ראמאן, אם כן, מציע ניגודיות חזקה ללא תוויות המתגברת על המגבלות של פלואורופורים. השאלה הייתה כיצד ניתן להשיג יכולת סופר-רזולוציה באמצעות פיזור ראמאן, שיכול לחשוף פרטים מבניים בקנה מידה ננומטרי והשלכות פונקציונליות בדגימות ביולוגיות.

למרות שנעשו מאמצים נרחבים להשיג רזולוציית על עבור מיקרוסקופ ראמאן עם מכשור אופטי אלגנטי, שיפור הרזולוציה בדגימות ביולוגיות היה מוגבל למדי ^19,20,21. כאן, בהתבסס על העבודות האחרונות ^22,23, אנו מציגים פרוטוקול המשלב אסטרטגיית הרחבת דגימה עם פיזור רמאן מגורה להדמיית רטט ללא תוויות ברזולוציה גבוהה, הנקראת הדמיית רטט של רקמות נפוחות וניתוח (VISTA). ראשית, תאים ורקמות הוטמעו במטריצות הידרוג'ל באמצעות פרוטוקול הכלאה אופטימלי של חלבון-הידרוג'ל. לאחר מכן הודגרו הכלאות רקמת ההידרוג'ל בתמיסות עשירות בחומרי ניקוי להסרת שומן, ולאחר מכן התרחבות במים. הדגימות המורחבות צולמו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופ SRS רגיל על ידי התמקדות בתנודות CH₃ מחלבונים אנדוגניים שנשמרו. VISTA, בשל תכונת ההדמיה נטולת התוויות שלה, עוקפת פוטוהלבנה ותיוג לא הומוגני הנובע מתיוג פלואורופור, עם תפוקת עיבוד דגימה גבוהה בהרבה. זוהי גם ההדמיה הראשונה מתחת ל-100 ננומטר (עד 78 ננומטר) ללא תוויות שדווחה. אין צורך במכשור אופטי נוסף מלבד הגדרת SRS טיפוסית^22,24, מה שהופך אותו לישימים בקלות. עם תמונות VISTA ואימונופלואורסצנציה בקורלציה, אלגוריתם פילוח תמונות מבוסס של למידת מכונה הוכשר^25,26 ליצור תמונות מולטיפלקס ספציפיות לחלבון מתמונות חד-ערוציות. השיטה יושמה עוד כדי לחקור פלאק Aβ ברקמות מוח של עכברים, וסיפקה תמונה הוליסטית המתאימה לתת-פנוטיפ על סמך התצוגות העדינות, של ליבת הפלאק וחוטים היקפיים המוקפים בגרעיני תאים וכלי דם.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הטכנולוגי של קליפורניה (IACUC), ונהלי הפרוטוקול עמדו בכל התקנות האתיות הרלוונטיות.

1. הכנת פתרונות מלאי לקיבוע והרחבת מדגם

1. הכן 40 מ"ל של תמיסת קיבוע על ידי המסה ראשונה של 12 גרם אקרילאמיד (30% w/v) מוצק ב-26 מ"ל מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף לתערובת 10 מ"ל של תמיסת מלאי PFA של 16%. לבסוף, הוסף 4 מ"ל של מי מלח 10x חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4). ניתן לאחסן את התמיסה המוכנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.
   הערה: אקרילאמיד מסוכן ולכן השלב של המסת אקרילאמיד מוצק במים צריך להיעשות במכסה אדים.
2. הכן תמיסת ג'לציה (מלאי X) על ידי המסת 70 מ"ג נתרן אקרילט (7% w/v), 200 מ"ג אקריל אמיד (20% w/v), ו-50 מיקרוליטר של N, N′-methylenebisacrylamide (0.1% w/v) ב-420 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. הוסף 57 מיקרוליטר של 10x PBS (pH 7.4) מסונן סטרילי בסוף ואחסן תמיסה זו ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   הערה: הימנע מנתרן אקרילט מוצק היוצר גושים; ודא שהנתרן אקרילט המשמש הוא בצורת אבקות מפזרות. המניה שנוצרה X תהיה נוזל חסר צבע; אם הנוזל נראה צהוב בהיר, השג נתרן אקרילט חדש.
3. הכן את תמיסת יוזם הפילמור על ידי המסת 1 גרם אמוניום פרסולפט (APS, 10% w/w) ב-9 מ"ל מים נטולי נוקלאז. באופן דומה, הכינו תמיסת מאיץ פילמור על ידי המסת 1 גרם של טטרמתיל-אתילנדיאמין (TEMED, 10% w/w) ב-9 מ"ל של מים נטולי נוקלאז. יש לצטט את התמיסות המתקבלות ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. הכן 50 מ"ל של מאגר דנטורינג על ידי המסת 2.88 גרם נתרן דודציל סולפט (SDS, 200 מ"מ), 0.584 גרם נתרן כלורי (200 מ"מ) ו-2.5 מ"ל של 1M Tris-HCl buffer (50 מ"מ, pH 8) במים נטולי נוקלאז.
   הערה: ריכוז ה-SDS קרוב למצב הרוויה שלו. התגבשות מסוימת במאגר היא נורמלית. חימום קל עד 37 מעלות צלזיוס יכול להפוך את התמיסה לברורה ומוכנה לשימוש.

2. הכנת דגימות תאי יונקים

1. זרע 3.5 x 10⁴ תאי HeLa על כיסוי בורוסיליקט 12 מ"מ (#1.5) בצלחת של 24 בארות ולאחר מכן תרבית את התאים ב-400 מיקרוליטר של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין (DMEM מלא) באווירה לחה עם 5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס.
2. כדי להשיג תאים בשלבים מיטוטיים שונים, דגרו את התאים ב-DMEM מלא עד למפגש של 60%. לאחר מכן, טפל בתאים עם DMEM ללא סרום בקר עוברי למשך 20 שעות כדי לסנכרן את שלבי התא. לאחר הסנכרון, החלף את המדיום לתאים כדי להשלים DMEM ודגירה למשך 2-6 שעות נוספות כדי למקד את השלבים השונים של המיטוזה.
3. שטפו את תאי הלה על כיסויים עם PBS סטרילי ודגרו אותם בתמיסת קיבוע (4% PFA 30% אקרילאמיד [AA] ב-PBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 7-8 שעות לפני עיבוד נוסף.
   הערה: טמפרטורת קיבוע גבוהה יותר יחד עם ריכוז גבוה של אקרילאמיד עוזרת להרוות את הקישור הבין-מולקולרי בין חלבונים במהלך תהליכי הקיבוע ומדווחת כמשמרת את המבנים האולטרה-מפורטים של חלבונים⁸.
4. עבור תאים עם אגרגטים של polyQ, גדל את התאים ב-DMEM מלא עד שהם מגיעים למפגש של 70%-90%. לאחר המעבר ל-DEM שלם חדש, העביר 1 מיקרוגרם של פלסמיד המקודד mHtt97Q-GFP לתאים באמצעות חומר טרנספקציה (פרטים בטבלת החומרים). בצע טרנספקציה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
5. לאחר 24-48 שעות של טרנספקציה, הסר את מדיום התרבות והוסף 800 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע (4% PFA, 30% AA) לכיסויים עם תאים. דגרו את הכיסויים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6-8 שעות. שטפו את הכיסוי עם PBS 3x, ודגימות התאים המתקבלות מוכנות לעיבוד נוסף.

3. הכנת דגימות מוח של עכבר

1. רכשו עכברי C57BL/6J (בני 6 עד 8 שבועות, זכר ונקבה, שישה עכברים) ועכברי אלצהיימר (בני 9 חודשים, נקבה, שלושה עכברים) ממקורות מסחריים (פרטים בטבלת החומרים). לבצע המתת חסד באמצעות נרקוזה של פחמן דו חמצני על פי פרוטוקול תקן²⁷. בקצרה, הניחו עכברים בתא ומלאו את התא בזרימה של 100% CO₂ בסדר גודל של 30%-70% מנפח החדר/דקה ושמרו על הזרימה לפחות דקה אחת לאחר המוות הקליני.
2. לאחר אישור המתת החסד ההומנית, ערפו במהירות את ראשי העכברים באמצעות מספריים. חשוף את הגולגולת עם חתך גדול דרך העור לאורך קו האמצע. משוך את העור לכיוון האף של החיה כדי לחשוף את הגולגולת במלואה.
3. חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע בעזרת מספריים עדינים ומקלפים את שני חצאי הגולגולת הצידה. השתמש בפינצטה כדי לגרוף את המוח לצלחת פטרי על קרח עם PBS. שטפו את מוח העכבר הטרי עם PBS קר כקרח והעבירו את המוח ל-10 מ"ל של מאגר קיבוע (4% PFA, 30% AA).
4. דגרו את מוח העכבר במאגר קיבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות ולאחר מכן העבירו אותו ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שטיפתו עם PBS סטרילי, חותכים את מוח העכבר למקטעים של 150 מיקרומטר באמצעות ויברטום ומאחסנים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס.

4. הטמעת הידרוג'ל, דנטורציה והרחבה של דגימות תאים ורקמות

1. ודא שהדגימות הודגרו במאגר הקיבוע למשך הזמן הנדרש, כפי שצוין לעיל. הפשירו פתרונות מלאי X, יוזם רדיקלים חופשיים ומאיצים ושמרו אותם על הקרח במהלך כל התהליך.
   הערה: זמן דגירה לא מספיק עלול לגרום למספר מופחת של חלבונים שנשמרו על היברידית ההידרוג'ל ולכן לגרום לירידה באות.
2. הרם את הכיסוי עם תאים והניח אותו על מגלשת זכוכית בעזרת פינצטה. בחרו את פרוסות המוח (בעובי 150 מיקרומטר) והניחו אותן על מגלשת זכוכית אחרת באמצעות מברשת צמר רכה, כדי לוודא שהן שטוחות. היפטר מעודפי נוזלים שמגיעים עם הדגימות.
3. ערמו שני כיסויים (#1.5), על ידי הוספת טיפות מים ביניהם, משני צידי הדגימה על מגלשת הזכוכית ליצירת תא ג'לציה. הנח את מגלשת הזכוכית כשהדגימה פונה כלפי מעלה על גוש חום קר כקרח וקרר אותה ל-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
4. הוסף 10% (w/w) TEMED למלאי X ולאחר מכן 10% פתרון APS. מערבולת במהירות, ותוך דקה אחת לאחר הערבוב, זרוק לאט את התמיסה המתקבלת לתוך התא על הדגימות כדי לכסות את פני הדגימה, תוך הימנעות מבועות אוויר. שמור את התמיסה והדגימות על קרח (או גוש חום קר כקרח) כדי למנוע היווצרות ג'ל (דרגה גבוהה של פילמור) לפני הוספתם לדגימה.
5. לאחר שהדגימה שקועה במלואה בתמיסה, הנח כיסוי שטוח, שקוף ומכוסה בסרט על גבי הדגימה כמכסה לתא. השאירו את החדר על קרח או גוש חום קר כקרח למשך דקה נוספת לפני הדגירה בחממת לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
6. הוצא את תא הג'לציה על מגלשת הזכוכית מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. יש להקפיד על ג'ל לא שקוף לאחר הסרת המכסה. אחזר את הג'ל על ידי חיתוך בעזרת סכין גילוח או לחילופין, הכניס את מגלשת הזכוכית למאגר דנטורציה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הג'ל יפריד את עצמו ממגלשת הזכוכית.
7. דגרו את הג'ל המבודד במאגר דנטורציה בתנאי חום כדי להשיג דנטורציה והסרת שומנים נוספים. עבור דגימות תאים, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך שעה. עבור פרוסות מוח בעובי 150 מיקרומטר, דנטורציה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   הערה: הג'ל עלול להיות מתולתל כאשר הוא מודגר לראשונה עם מאגר דנטורציה בטמפרטורת החדר. זה נורמלי ויהפוך שטוח לאחר דנטורציה בטמפרטורה גבוהה. כאשר עובדים עם דגימות רקמה עבות יותר, יש צורך בזמן דנטורציה ארוך יותר.
8. לאחר הטיפול בחום, שטפו את הדגימה המפורקת 3x עם PBS למשך 10 דקות. בשלב זה, הג'ל היה אמור להתרחב בערך פי 1.5 מהגודל המקורי. דגרו את הג'ל השטוף במים טהורים במיוחד במיכל גדול (לפחות פי 20 מנפח הג'ל) כדי להשיג יחס התפשטות גבוה יותר. החלף את המים כל שעה 3x והשאיר את הדגימה בחושך למשך הלילה. הג'ל שנוצר מוכן לתמונה.
   הערה: יחס ההתפשטות תלוי במידה רבה בתכונות המכניות של המדגם המקורי. התקבלה הרחבה של פי 4.2 עבור דגימות התאים ופי 3.4 עבור דגימת רקמת המוח.

5. הדמיה ללא תווית של התפלגות חלבון אנדוגני בדגימות תאים ורקמות מורחבות

1. שמור את דגימות הג'ל המורחבות במים במהלך תהליך ההדמיה. הג'ל שביר לאחר ההרחבה ולכן יש לטפל בו בזהירות. הנח את הג'ל המורחב הנושא דגימה על שקופית מיקרוסקופ (בעובי 1 מ"מ) עם מרווח מיקרוסקופ עם גדלי פתיחה ועומקים מתאימים, מלא במים. כסו את המרווח בכיסוי (#1.5) וודאו שהוא אטום כהלכה כדי למנוע תנועת דגימה.
2. הנח את הדגימה עם התא או הרקמה המורחבת על הבמה הממונעת כשהכיסוי פונה למטרה. לחץ על Ocular בתוכנה כדי לשנות את נתיב האור לשדה בהיר ולהתאים את מיקום z באמצעות כפתור ידני.
3. הוסף שמן טבילה בחלק העליון של הדגימה והתאם את המעבה למיקום הנכון לתאורת Köhler תוך כדי צפייה בשדה בהיר עם הגדלה פי 25 מהמטרה. הזן 791.3 ננומטר בחלון אורך הגל OPO בלוח הלייזר כדי למקד את רטט החלבון CH₃ ב-2940 ס"^מ-1.
4. העבר את אור המיקרוסקופ משדה בהיר (חתיכת עין) למצב סריקת לייזר על ידי לחיצה על כפתור LSM ופתח את תריס הלייזר SRS על ידי לחיצה על כפתור התריס בלוח הבקרה של הלייזר. לחץ על כפתור LIVE בתוכנת המיקרוסקופ כדי להתחיל ברכישת תמונות בזמן אמת.
5. מצא את המיקוד הנכון על ידי שינוי ה-z תוך כדי התבוננות בתמונת ה-SRS תחת זמן השתהות פיקסלים קצר (12.5 מיקרון/פיקסל) ורזולוציית תמונה נמוכה (256 פיקסלים x 256 פיקסלים). לאחר מציאת מיקום ה-z האידיאלי, שנה את גודל הסריקה ואת זמן השהייה של הפיקסלים על ידי משיכת הסרגל המתאים בתוכנת המיקרוסקופ.
6. רכוש את התמונה על ידי לחיצה על כפתור LSM באמצעות מצב דגימת העל (1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים) עם זמן השתהות פיקסלים ארוך יותר (80 מיקרון/פיקסל) התואם את קבוע הזמן של מגבר הנעילה. רכוש תמונות נפחיות על ידי איסוף ערימת z בגודל צעד של 1 מיקרומטר בכיוון z. עבד ונתח את קובץ ה-OIR שנשמר מהתוכנה באמצעות ImageJ.
   הערה: הגדרת ה-SRS המפורטת דווחה לאחרונה ב-Mutlu et ^al.24. כאן, לייזר פיקו-שנייה מתכוונן עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ ורוחב פס של 2 ps למשאבה (770-990 ננומטר) וסטוקס (1031.2 ננומטר) נותב למיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר (מפורט בטבלת החומרים). מטב את החפיפה הזמנית והמרחבית של שתי הקרניים עבור אותות עם D₂O טהור. נדרש מאמץ מסוים כדי למצוא את ה-z הנכון עבור הדגימה המורחבת תחת שדה בהיר מכיוון שמקדם השבירה הומוגני מאוד בכל הג'ל.
7. קבע את הרזולוציה של VISTA על ידי צילום תמונת SRS של חרוזי פוליסטירן (100 ננומטר) באמצעות מטרה של פי 25 ומטרה של פי 60. הגדר את לייזר המשאבה ל-784.5 ננומטר, המתאים לשינוי ראמאן של 3050 ס"^מ-1, האופייני ל-C-H הארומטי מותח רעידות של פוליסטירן.
   הערה: אורך גל לייזר המשאבה המשמש כאן דומה לזה המשמש ב-VISTA לחלבונים.
8. עם המטרה של פי 60, חצי הגל המלא הניסיוני המקסימלי (FWHM, שהוא רוחב צורת הקו במחצית המשרעת) של תמונת החרוז היה 276.17 ננומטר. דגמו את הפונקציה של אובייקט החרוז כחצי עיגול.
   הערה: כאשר לפונקציה הגאוסית PSF יש c (σ) = 269 ננומטר/2.35, לתמונת החרוז המפותלת יהיה FWHM נמדד של 276.17 ננומטר. כתוצאה מכך, הרזולוציה של מערכת ה-SRS היא 269 ננומטר ×-1.22 = 328 ננומטר לפי קריטריון ריילי. מכיוון של-VISTA יש התרחבות ממוצעת של פי 4.2 של דגימות תאים, הרזולוציה האפקטיבית יורדת ל-328 ננומטר/4.2 = 78 ננומטר.

6. VISTA מתאם והדמיה פלואורסצנטית של דגימות רקמה עם תווית חיסונית ומורחבות

1. לאחר דנטורציה, דגירה מוקדמת של דגימות ההידרוג'ל המוטבעות (למשל, חתך עטרה של 150 מיקרומטר במוח) ב-1% (v/v) Triton X-100 (PBST) למשך 15 דקות. העבר את מאגר הדגירה ל-PBST עם נוגדן ראשוני בדילול של 1:100. אם יש צורך במטרות חלבון מרובות להדמיית מולטיפלקס, יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים המתאימים למטרות שונות לריכוזים מתאימים באותו קוקטייל ולדגור עם הדגימות בו זמנית.
2. דגרו את הג'לים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין ב-80 סל"ד למשך 16-18 שעות, ולאחר מכן שטיפה נרחבת 3 פעמים עם PBST למשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. הפוך את הג'ל במהלך הדגירה כדי למנוע תיוג נוגדנים לא הומוגני כאן ובכל הדגירות הבאות.
3. דגרו את הדגימות עם נוגדנים משניים של מטרות מינים מקבילים בדילול של 1:100 עם PBST ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות, מוגנים מפני האור. שטפו דגימות הידרוג'ל עם תווית 3x עם PBST למשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.
4. לדלל DAPI לריכוז סופי של 3 מיקרומטר ב-PBS. הוסף נפח מספיק של תמיסת DAPI להידרוג'ל הדגימה כך שהג'ל יהיה שקוע בתמיסה. יש לדגור למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין ב-80 סל"ד. שטפו את הדגימה פי 3 עם PBS.
5. הרחב את דגימות הג'ל עם התווית החיסונית על ידי דגירה עם נפח גדול של H₂O דו-יונים כפול. החלף את המים כל שעה ו-3x ודגר את הדגימות ב-H₂O למשך הלילה, מוגן מפני אור. במהלך התיוג, הג'ל צריך להתרחב פי 1.5 בהשוואה למאגר PBS.
6. הכן את דגימת ההדמיה כמתואר בשלב 5.1. הנח את דגימת ההדמיה על המיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר עם מטרת הטבילה במים 25x, 1.05 NA להדמיה פלואורסצנטית.
7. בחר את הערוץ המתאים עם לייזר העירור המתאים (405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-640 ננומטר) וצמד PMT בהתאם לנוגדנים הממוקדים בתפריט הנפתח בתוכנת המיקרוסקופ. לחץ על כפתור LIVE לרכישת תמונות בזמן אמת.
8. כוונן את מיקום המיקוד על ידי כפתור ידני בהתבסס על אות הקרינה בזמן אמת. בצע אופטימיזציה של עוצמת הלייזר, זמן השתהות הפיקסלים ורווח ה-PMT בתוכנת המיקרוסקופ בהתאם לאות הקרינה בזמן אמת כדי למנוע אות עמום או רוויה יתר.
   הערה: הערך את המראה והתכונות על סמך המבנים המדווחים של נוגדנים שונים כדי למנוע תגובתיות צולבת פוטנציאלית של נוגדנים וכדי למנוע דיבור צולב בין ערוצי פלואורסצנציה שונים.
9. לחץ על כפתור LSM כדי להתחיל לקבל תמונות SRS ותמונות פלואורסצנטיות מתואמות. ראשית, אסוף תמונות פלואורסצנטיות נפחיות על דגימות עם תווית חיסונית. לאחר סיום הדמיית הקרינה, העבר את נתיב האור של המיקרוסקופ למצב שקוף אינפרא אדום (IR).
10. שנה את ערוץ הזיהוי מ-PMT פלואורסצנטי ל-SRS בתוכנת המיקרוסקופ. פתח את התריס עבור לייזר SRS ובצע הדמיה נפחית SRS בשדה הראייה של אותה דגימה עם אותו טווח של z. הטווח הנורמלי הוא בין 100-200 מיקרומטר ויכול להגיע עד 700 מיקרומטר.
    הערה: קיימת סטייה כרומטית קלה הגורמת לשינוי במיקום z בין התמונות הפלואורסצנטיות לתמונות ה-SRS בגלל הפרש אורך הגל בלייזרי העירור. יש צורך בהשוואה ידנית זו לצד זו בין תמונות ה-SRS והפלואורסצנטיות של z-stack. חפש את התכונות התואמות המדויקות הן מה-SRS והן מערוץ הקרינה כדי להתאים במדויק למיקום z.

7. בנייה, הדרכה ואימות של ארכיטקטורת U-Net

הערה: התקנה בלינוקס מומלצת. נדרש כרטיס גרפי עם זיכרון RAM של >10 ג'יגה-בייט.

1. הגדרת הסביבה
   1. התקן את Anaconda או Miniconda ב-3-5.3.0-linux-x86_64. שכפל או הורד את הקבצים הבאים: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. צור סביבת Conda עבור הפלטפורמה באמצעות שורת הפקודה הבאה:
      conda env create -f environment.yml
2. אימון מודל החיזוי
   1. התאם את הספריות של תמונות SRS תואמות עם תמונות אמת קרקעיות בקובץ csv. מקם את הספריות של תמונות SRS תחת path_signal וקרקע תמונות אמת מתחת לעמודות path_target.
   2. שים את קובץ ה-csv בתיקיה data/csvs. שנה את התצורה בסקריפטים/train_model_2d.sh במידת הצורך. הפעל את הסביבה באמצעות שורת הפקודה:
      Conda הפעל את FNET
   3. התחל אימון מודל באמצעות שורת הפקודה:
      ./scripts/train_model_2d.sh <שם הקובץ של קובץ ה- csv> 0
      לאחר מכן תתחיל ההדרכה. ההפסדים עבור כל איטרציה יוצגו בשורת הפקודה ויישמרו עם המודל בתיקיה save_models/<שם הקובץ עבור קובץ ה-csv>.
3. אמת את התמונות בערכת ההדרכה ובערכת הבדיקות באמצעות שורת הפקודה:
   ./scripts/train_model_2d.sh <שם הקובץ של קובץ ה- csv> 0
   תוצאות החיזוי יישמרו בתוצאות התיקיה/שם הקובץ < של קובץ ה- csv>.

8. VISTA בשילוב עם תחזיות U-Net עבור ריבוי ספציפי לחלבון בתמונות ללא תוויות

1. שנה את קובץ ה-csv ב-data/csvs/<שם הקובץ של קובץ ה-csv>/test.csv. החלף את הספריות של path_signal ושל path_target בספרייה של תמונות SRS חדשות.
2. הסר את תוצאות החיזוי מההדרכה, שהיא תוצאות התיקיה/שם הקובץ < של קובץ ה- csv>. הפעל חיזויים באמצעות שורת הפקודה:
   ./scripts/train_model_2d.sh <שם הקובץ של קובץ ה- csv> 0
   תוצאות החיזוי יישמרו בתיקיה תוצאות/<שם קובץ של קובץ csv>/בדיקה.

תוצאות

לאחר קביעת עקרון העבודה של שיטת ההדמיה והניתוח, נעשה רישום תמונה כדי להעריך את יחס ההתפשטות ולהבטיח התרחבות איזוטרופית במהלך עיבוד הדגימה (איור 1A,B). גם דגימות לא מטופלות וגם דגימות VISTA צולמו תוך התמקדות ברטט הקשר ב-2940 ס"^מ-1, שמקורו ב-CH₃ של חלבונים אנדוגניים. בדגימות לא מטופלות, המבנים העשירים בחלבון כמו גרעינים היו כהים בגלל תכולת השומנים העצומה מהרקמות הסובבות²² (איור 1A). לאחר עיבוד דגימה הכ...

דיון

לסיכום, אנו מציגים את הפרוטוקול עבור VISTA, שהוא שיטה נטולת תוויות להדמיית מבנים תאיים ותת-תאיים עשירים בחלבונים של תאים ורקמות. על ידי התמקדות ב-CH₃ אנדוגני מחלבונים בתאים וברקמות משובצות הידרוג'ל, השיטה משיגה רזולוציית הדמיה יעילה עד 78 ננומטר בדגימות ביולוגיות ופותרת שחול קל באגרגטים וסיבים של הנטינגטין בפלאק Aβ. טכניקה זו היא המופע הראשון שמדווח על רזולוציה מתחת ל-100 ננומטר עבור שיטות הדמיה ללא תוויות²². בהשוואה לשיטות הרחבה קיימות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית	15710	מדולל ל-4% ב-PBS
25x מטרת טבילה במים	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD עכברים	עכברים מוטנטיים מרכזי משאבים ומחקר ומעבדת ג'קסון	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	אלצהיימר מוח
60x מטרת טבילה במים	אולימפוס	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
אקרילאמיד	סיגמא-אולדריץ'	A9099
אמוניום פרסולפט	סיגמא-אולדריץ'	A3678
אנטי-MAP2	טכנולוגיית איתות תאים	8707
טכנולוגיית איתות תאים	אנטי-NeuN	24307
כיסוי בורוסיליקט #1.5	פישר סיינטיפיק	1254581
C57BL/6J עכברים	מעבדת ג'קסון (JAX)	664	עכברים רגילים
D2O	Sigma-Aldrich	151882	לכיול SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
שקופית זכוכית 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ	VWR	16004-430
עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
עז נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
עז נגד חולדות IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
מבודדי סיליקון Press-To-Seal של Grace Bio-Labs	Sigma-Aldrich	GBL664108	מרווח מיקרוסקופ
Htt-97Q-GFP מתנת פלסמיד	מפרופ' ר. קופיטו ופרופ' F.-U.Hartl.
מיקרוסקופ סריקת לייזר	אולימפוס	FV3000	סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי
ליפופקטמין 3000	תרמו פישר	L3000001	חומר טרנספקציה
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (לקטין)	מעבדות וקטור	DL-1177-1
ספייסר מיקרוסקופ	גרייס ביו-לאבס	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	נקנה כתמיסה של 2% במים
ללא נוקלאז	תרמו פישר	10977-015
פניצילין-סטרפטומיצין	GIBCO	15140-122
חרוזי פולי-סטרן	סיגמא-אולדריץ'	43302	לאפיון רזולוציה
נתרן אקרילט	סיגמא-אולדריץ'	408220
נתרן דודציל סולפט	סיגמא-אולדריץ'	71725
מברשת צבע צמר רך #3	TANIS	000333
SRS לייזר	A.P.E	PICOEmerald	2ps רוחב
דופקtetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
בקבוק תרבית רקמות 25 סמ"ר	קורנינג	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
פינצטה	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	הוויברטום