הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

1 באפריל 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.

תקציר

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. כאן מסופקות שתי דוגמאות להקשרים פיזיולוגיים-רלוונטיים שבאמצעותם ניתן לחקור זרחון של חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכבר תרבית שמקורם במדפי פלטה משניים E13.5. כדי להתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של פוספופרוטאינים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות ניתנות לניתוח וכימות נכונים של פוספופרוטאינים בעקבות כתמים מערביים של ליזאטים של חלבון של תאים שלמים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

מבוא

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים - מדפי palatal המשני - מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.51.

שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים 2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH5. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג'וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים6, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע7, 8,9,10. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג'וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים11. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל12. לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)18,19.

האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25, ו-Sox926 הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעיניתשלו 27. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ"א ו/או על ספציפיות הרצף28. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד31. באמצעות הנ"ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.

אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 - הן ראשוניים32 והןמונצחים 33 . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים1, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו - in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.

בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של הקמפוס הרפואי אנשוץ של אוניברסיטת קולורדו ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות המוסדיות. נקבות 129S4 עכברים בגיל 1.5-6 חודשים ושוכנו בטמפרטורה תת-תרמונוטריאלית של 21-23 מעלות צלזיוס שימשו לקצירת עוברים. זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול מיוצגת באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי כל החומרים, הציוד, התוכנה, הריאגנטים ובעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קצירת עוברי עכבר E11.5

  1. המתת ממתת עכברה הרה 11.5 ימים לאחר זיהוי תקע הנרתיק במהלך הזדווגות מתוזמנת בתא CO2 באמצעות קצב זרימת CO2 המאושר על ידי IACUC הנדרש לכ-50% תזוזה (2.95 ליטר לדקה בתא 360ב-3 ) ומשך החשיפה (ראו טבלת חומרים). בצע פריקה צווארית כשיטה משנית של המתת חסד. המשך מיד לנתיחה.
  2. הניחו את גוף העכבר על לוח ניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול.
  3. פתח את חלל הבטן על ידי צביטה והרמת העור הקדמי לפתח הנרתיק עם מלקחיים ישרים של Semken וחיתוך העור המורם ושכבות הבסיס עם מספריים כירורגיים בעלי להב ישר בזווית של 45° משני הצדדים כדי ליצור צורת "V" המשתרעת על כל משטח לרוחב בערך באמצע הדרך בין הקדמיים והאחוריים.
  4. באמצעות מלקחיים Semken, לאחוז באחת מקרני הרחם ולחתוך מתחת לאובידוקט ומעל צוואר הרחם עם המספריים הכירורגיים. חותכים את המסומטריום כדי לאפשר הסרה מלאה של קרן הרחם.
  5. העבר את קרן הרחם המנותקת ל-10 מ"ל של היסטולוגיה מלוחים עם חיץ פוספט (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 מונובסי, 10.14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] בצלחת פטרי 10 ס"מ.
  6. הסר את קרן הרחם השנייה בצד הנגדי של חלל הבטן באמצעות אותו הליך המתואר בשלבים 1.4-1.5.
  7. מניחים את צלחת הפטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את שתי קרני הרחם על קרח אם לא ממשיכים מיד לניתוח של עוברים בודדים (כלומר, אם נקבת עכבר שנייה תנותח).
  8. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, נתחו בזהירות כל עובר מקרני הרחם עם מלקחיים עדינים של Dumont #5. לאט לאט משכו את המיומטריום, את ההחלטה ואת הכוריאון. קורעים ומסירים את השחרטום השקוף יחסית המקיף את העובר, וחותכים את חבל הטבור המחבר את העובר לשליה.
  9. מעבירים כל עובר מנותח ל-2.5 מ"ל של היסטולוגיה PBS בבאר בודדת של צלחת תרבית תאים בת 12 בארות על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה או כף עובר.
    הערה: אם אתם עובדים עם המלטה שעשויה להכיל עוברים של יותר מגנוטיפ אחד, שמרו את השן המקיף כל עובר לצורך גנוטיפ על ידי הצבת כל אחד מהם בצינור מיקרו-צנטריפוגה בעל תווית מוקדמת של 0.5 מ"ל על קרח.

2. ניתוח תהליכים מקסילריים מעוברי עכבר E11.5

  1. הכינו שלוש צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילות 10 מ"ל של PBS היסטולוגי ושמרו אותן על קרח לשימוש בסיבוב בין עוברים.
  2. העבירו עובר אחד מבאר בודדת של צלחת תרבית התאים בת 12 הבארות לאחת מצורות הפטרי בקוטר 10 ס"מ עם PBS היסטולוגי על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה או כפית עובר.
  3. תחת מיקרוסקופ הניתוח, להפריד כל תהליך מקסילרי מהפנים באמצעות המלקחיים העדינים. ראשית, חתכו את הצד הקדמי של תהליך מקסילרי אחד לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין תהליך האף הצדדי לבין התהליך המקסילרי (איור 2A).
  4. שנית, חותכים את הצד האחורי של התהליך המקסילרי לאורך ההזחה הטבעית המפרידה בין התהליך המקסילרי לבין התהליך המנדיבולרי (איור 2A).
  5. שלישית, כדי להפריד לחלוטין את התהליך המקסילרי, בצע חיתוך אנכי מהצדדים הקדמיים לאחוריים של התהליך המקסילרי בצד העין של התהליך המקסילרי שבו ההזחות הטבעיות שהוזכרו לעיל מסתיימות (איור 2A-C).
  6. חזור על שלושת החתכים הללו עבור התהליך המקסילרי בצד הנגדי של הפנים.
  7. באמצעות פיפטת פסטר בגודל 9 אינץ' עם נורת לטקס קטנה של 2 מ"ל, מעבירים את זוג התהליכים המקסילריים המנותחים ואת טיפתה קטנה של כ-30 מיקרול' של PBS היסטולוגי לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ על קרח (איור 2D).
  8. בצע את השלבים 2.3-2.7 עבור כל עובר, תוך סיבוב שלוש צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילות PBS היסטולוגי על קרח בין עוברים. הניחו זוגות בודדים של תהליכים מקסילריים מנותחים בצלחות פטרי נפרדות בקוטר 35 מ"מ על קרח.
    הערה: ניתן לבצע הפרדה בין התהליך המקסילרי אקטודרם ומזנכים (שלבים 2.9-2.17) לאחר ניתוח התהליכים המקסילריים של כל העוברים בהמלטה. אם רצויים תהליכים מקסילריים שלמים המכילים הן את האקטודרם והן את המזנכים, המשך לשלב 2.18 להלן.
  9. הכינו 250 μL של 2% טריפסין טרי בתרבית רקמה PBS ו-250 μL של 10% סרום בקר עוברי (FBS) בתרבית רקמה PBS ואחסנו על קרח.
  10. מניחים טיפה שנייה, קטנה, של כ-30 μL של 2% טריפסין בצלחת פטרי 35 מ"מ בנפרד מהטיפה הראשונה, הקטנה, של PBS היסטולוגי המכילה את התהליכים המקסילריים. העבר את זוג התהליכים המקסילריים לטיפה הקטנה של 2% טריפסין באמצעות פיפט הפסטר (איור 2D).
  11. דגירה של המנה על קרח למשך 15 דקות.
  12. מוציאים את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ מהקרח ומניחים מתחת למיקרוסקופ הניתוח.
  13. באמצעות המלקחיים העדינים, משכו באיטיות ובזהירות את שכבת האקטודרם מכל תהליך מקסילרי (איור 2E).
    הערה: אם האקטודרם אינו נפרד מהמזנכים ביריעה שלמה, יש לדוג ב-2% טריפסין בטמפרטורת החדר (RT) למשך עד 5 דקות נוספות לפני שתמשיכו בהפרדה. אם הרקמה מתחילה להתפורר ב-2% טריפסין, העבירו את התהליכים המקסילריים ל-10% FBS כמתואר להלן כדי לנטרל את הטריפסין ולסיים את ההפרדה בין האקטודרם למזנכים.
  14. לאחר שהתהליך המקסילרי אקטודרם ומזנכים מופרדים (איור 2F), העבירו את הרקמות הרצויות מזוג התהליכים המקסילריים לטיפה שלישית, קטנה, של כ-30 מיקרול' של כ-10% FBS - בנפרד משתי הטיפות הקטנות הקודמות - באמצעות פיפטת הפסטר (איור 2D).
  15. הניחו את צלחת הפטרי 35 מ"מ על קרח כדי לעצור את הטריפסיניזציה.
  16. דגירו את רקמות התהליך המקסילרי על קרח ב-10% FBS למשך דקה-שתיים, ולאחר מכן העבירו את הרקמות משני התהליכים המקסילריים לטיפה רביעית, קטנה, של כ-30 μL של PBS היסטולוגיה קדם-צ'ילית על קרח - בנפרד משלוש הטיפות הקטנות הקודמות - באמצעות צינור הפסטר (איור 2D).
  17. דגירה של רקמות התהליך המקסילרי בהיסטולוגיה PBS למשך דקה אחת תוך סיבוב עדין של ההיסטולוגיה PBS סביב רקמות התהליך המקסילרי עם קצה פיפטת הפסטר כדי להבטיח שכל ה- FBS נשטף מהרקמה.
  18. העבר את זוג רקמות התהליך המקסילרי לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן 1.5 מ"ל על קרח באמצעות צינור פסטר, ובכך למזער את העברת ההיסטולוגיה PBS. הסר כל עודף היסטולוגיה PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם צינור פסטר.
  19. בצע את השלבים לעיל כדי לנתח את התהליכים המקסילריים מכל עובר בהמלטה.
  20. לעבד את הדגימות באופן מיידי כדי לבודד את החלבון של התא השלם lysates (להלן) או לאחסן ב -80 °C (80 °C) לטווח ארוך. לפני אחסון לטווח ארוך, הקפיאו את צינור המיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל באמבטיה של 100% EtOH על קרח יבש למשך 5 דקות.

3. בידוד חלבון של תאים שלמים ליאסטים מתהליכים מקסילריים של עכברים

  1. אם תהליכים מקסילריים הוקפאו בעבר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותם על קרח.
  2. הוסף 0.1 מ"ל של חיץ ליזה NP-40 קר כקרח (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% גליצרול, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; מאוחסן ב-4 °C) עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (1x קוקטייל מעכב מיני פרוטאז מלא [מומס במים; מאוחסן בטמפרטורה של -20 °C], 1 mM PMSF [מומס באיזופרופנול; מאוחסן ב-4 °C], 10 mM NaF [מאוחסן ב-20°C-; הימנע מהקפאה/הפשרה], 1 mM Na3VO4 [מאוחסן ב-20°C-], 25 mM β-גליצרופוספט [מאוחסן ב-4 °C]) שנוספו מיד לפני השימוש בקרח.
    הערה: לחלופין ניתן לבצע פיצול תאים כדי לבודד שברים ציטופלסמיים, גרעיניים, ממברנה או חלבונים מיטוכונדריאליים.
  3. פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטמן 200 μL.
  4. מערבולת במשך 10 שניות, ולאחר מכן פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטמן 200 μL. הימנעו מיצירת בועות.
  5. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות תוך סיבוב הקצה מעל הקצה באמצעות משוט 1.5 מ"ל/2 מ"ל עם אקדח צינור.
  6. צנטריפוגה הדגימות ב 13,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (74 °F).
  7. אספו את ה-supernatant לצינור מיקרו-סנטריפוג' חדש בגודל 1.5 מ"ל על קרח עם פיפטמן של 200 מ"ל.
  8. כימתו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון, באמצעות 10 μL של חלבון lysate + 10 μL של מאגר ליזה NP-40 עבור דגימות ניסיוניות ו-3-5 דילולים של אלבומין בסרום בקר (שבר V) (BSA) במאגר ליזה NP-40 בטווח של 0.25-2.0 מ"ג/מ"ל כתקני חלבון.
  9. המשך עם נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) (שלב 5) או להקפיא במהירות את הליזאטים הנותרים על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.

4. בידוד חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתאי מזנכים ראשוניים ו/או מונצחים של עכברים עובריים (MEPM)

הערה: בידוד ותרבית של תאי MEPM ראשוניים מעוברי עכבר E13.5 ותאי MEPM מונצחים תוארו בעבר 32,33,34. גירוי של תאים עם גורם גדילה (שלבים 4.1-4.7) יכול להתבצע לפני תזה תאית. אם רצוי תאים שאינם מגורה, המשך לשלב 4.8 להלן.

  1. שאפו למדיום הגדילה [מדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM) עם 50 U/mL של פניצילין, 50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 10% FBS] מתאי MEPM במפגש של כ-70% בצלחת תרבית תאים בגודל 6 ס"מ באמצעות פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחוברת למערכת ואקום.
  2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של תרבית רקמה PBS.
  3. הוסיפו 3 מ"ל של מדיום הרעבה בסרום [DMEM עם 50 U/mL של פניצילין, 50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 0.1% FBS] מתוכנן מראש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  4. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 23 שעות.
  5. החליפו את מדיום הרעב בסרום ב-3 מ"ל של מדיום רעב טרי ומתוכנן מראש בסרום.
  6. אינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה אחת.
  7. לעורר את התאים עם גורם הגדילה המועדף בריכוז שנקבע אמפירית למשך הזמן הרצוי.
  8. שאפו את המדיום מתאי MEPM במפגש של 80%-100% באמצעות צינור פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחובר למערכת ואקום.
  9. לשטוף את התאים פעמיים עם תרבית רקמה קרה כקרח PBS (1 מ"ל עבור צלחת תרבית תאים 6 ס"מ); הטה את הצלחת הצידה במהלך הכביסה האחרונה כדי להבטיח שכל תרבית הרקמה PBS שואפת.
  10. להפוך את התאים על ידי הוספת חיץ ליזה NP-40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש (0.1 מ"ל לצלחת תרבית תאים של 6 ס"מ) על קרח.
  11. דגירה של הצלחת על קרח למשך 5 דקות עם סיבוב בערך כל דקה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת.
  12. גרד את התאים מהצלחת באמצעות מרים תאים מקדים והעביר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח.
  13. דגירה של מתלי התא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך סיבוב הקצה על הקצה באמצעות משוט 1.5 מ"ל/2 מ"ל עם אקדח צינור.
  14. המשך עם שלבים 3.6-3.9 שתוארו לעיל.

5. כתם מערבי של חלבון תאי שלם ליסאט מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי MEPM עבור פוספופרוטאינים

  1. הכן דגימות ליזט של חלבון תא שלם עבור SDS-PAGE.
    1. קבעו את כמות החלבון שיש לטעון, בהתאם לשפע החלבון ברקמה/תא; 12.5 מיקרוגרם מספיקים בדרך כלל לחלבונים בעלי ביטוי חזק בליזאטים של חלבונים בתאים שלמים.
    2. הוסיפו נפח שווה של 2x מאגר לאמלי [20% גליצרול, 4% SDS, 0.004% ברומופנול כחול, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] עם 10% β-מרקפטואתנול שנוספו מיד לפני השימוש.
      אזהרה: β-mercaptoethanol הוא עור או עיניים קורוזיבי, רעיל, מסוכן אם נבלע, ויש לו רעילות מימית. ידית לבישת כפפות, מעיל מעבדה, מגן פנים ומשקפי בטיחות במכסה אדים כימי. להיפטר על פי הנחיות בריאות ובטיחות הסביבה.
    3. מערבבים על ידי מערבולות.
    4. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבטיה יבשה קטנה.
    5. מערבבים על ידי מערבולת ומניחים את הדגימות על קרח.
    6. צנטריפוגה ב 9,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. הניחו את הדגימות לזמן קצר על קרח לפני טעינתם לג'ל SDS-PAGE, או אחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.
  2. בצע SDS-PAGE באמצעות תא אלקטרופורזה עם ג'ל חלבון משודר מראש של 4%-15% ובופר אלקטרופורזה35.
  3. אלקטרו-טרנספר את החלבונים לממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) באמצעות מאגר העברה עם 0%-20% מתנול (0%-10% לחלבונים הגדולים מ-100 kDa; 20% לחלבונים פחות מ-100 kDa) שנוספו מיד לפני השימושב-35.
  4. לחסום את הממברנה ולחקור עבור פוספופרוטאין של עניין.
    1. לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה בתמיסת מלח משולשת אחת (TBS) [20 mM Tris, 0.137 M NaCl, pH 7.6] למשך 5 דקות בקופסת כתם מערבית.
    2. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של מאגר חוסם [1x TBS, 0.1% Tween 20, 5% w/v BSA; מעורבב היטב ומסונן דרך מסנן מזרקים 25 מ"מ עם נקבוביות של 0.2 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל עם קצה פיתוי] במשך שעה אחת בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
      הערה: אין להשתמש בחלב כחומר חוסם בעת אפיון פוספופרוטאינים מכיוון שהוא מכיל את קזאין הפוספופרוטאין, מה שעלול לגרום לאות רקע גבוה ולא ספציפי.
    3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T [1x TBS, 0.1% Tween 20] בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    4. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל בחסימת חיץ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות משוט 50 מ"ל עם אקדח צינור.
      הערה: עיין בגיליון נתוני הנוגדנים לקבלת הריכוז המתאים לכתם מערבי.
    5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-RT במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    6. דגירה של הממברנה ב-5 מ"ל של נוגדן משני מצומד חזרת מתאים (HRP) מדולל במאגר חוסם למשך שעה אחת בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    7. שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    8. דגירה של הממברנה במצע כתם מערבי משופר (ECL) [ערבוב נפחים שווים מבקבוקים 1 ו-2; 0.5 מ"ל מכל אחד מהם עבור ממברנות גדולות (8.6 ס"מ x 6.7 ס"מ) למשך דקה אחת, מה שמבטיח שהממברנה כולה חשופה ללא הרף למצע הכתם המערבי של ECL.
    9. לנקז את הקרום של עודף ECL מצע כתם מערבי ולהתפתח מיד באמצעות תמונה chemiluminescence.
  5. מפשיטים את הממברנה ומחפשים מחדש את סך החלבון המעניין.
    1. הניחו את קרום ה-PVDF בשקית שקופה עם ציפוי פוליאתילן המכיל 5 מ"ל של חיץ הפשטה [2% SDS, 62.5 mM Tris HCl pH 6.8] עם 8 μL/mL של β-mercaptoethanol שנוספו מיד לפני השימוש.
    2. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה בתנור הכלאה ב-11 סיבובים לדקה.
    3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-RT במשך 5 דקות כל אחת ב-TBS-T בקופסת כתמים מערבית עם תסיסה על שייקר מסלולי.
    4. המשך עם שלבים 5.4.2-5.4.9 שתוארו לעיל.
  6. צפיפות רצועת הכתמים המערבית הכמותית באמצעות תוכנת ImageJ, מנרמלת את רמות החלבון הזרחני המעניין לרמות של החלבון הכולל בעל העניין36.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר מנסים לאפיין את הזרחון של חלבונים שבודדו מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכיים פאלטליים בתרבית, התוצאות הייצוגיות יחשפו באופן אידיאלי פס מובחן וניתן לשחזור בעקבות כתם מערבי עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין הפועל בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה (איור 3) ). עם זאת, אם מתרחשת זרחון נרחב של החלבון, ייתכן שתהיה תזוזה קלה כלפי מעלה של רצועת הפוספופרוטאין בהשוואה לזו של רצועת החלבון הכוללת. יתר על כן, אם קיימים איזופורמים מרובים של חלבון ברקמה, שכל אחד מהם הוא זרחן, או שהחלבון נת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים לחקור אירועי איתות קריטיים התלויים בזרחון במהלך התפתחות קרניופציאלית באופן חזק וניתן לשחזור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה המבטיחים איסוף נכון של נתונים וניתוח תוצאות. בין אם מבודדים פוספופרוטאינים מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכים פאלטליים בתרבית, חובה לנוע במהירות וביעילות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על הקרח כאשר הם מסומנים. הטמפרטורה הנמוכה של הקרח מאטה את הפעילות המטבולית בתאים, ובכך מגנה על חלבונים זרחניים מפני פעילות פוספטאז38 ושומרת על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

129S4 עכברים היו מתנה מד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. עבודה זו נתמכה בכספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)/המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (NIDCR) R01 DE027689 ו- K02 DE028572 ל- K.A.F., F31 DE029976 ל- M.A.R. ו- F31 DE029364 ל- B.J.C.D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
בלוק למיני אמבטיה יבשהמחקר International Corp400783
מערכת הדמיה ChemiDoc XRS+ עם תוכנת Image LabBio-Rad1708265כימילומינסנציה צילום
CO2 אינקובטור, מעיל אווירVWR10810-902
ניתוח לוח, 11 x 13 בפישרסיינטיפיק09 002 12
תא אלקטרופורזה, 4 ג'ל, למיני ג'לים טרומיים עם מודול מיני טרנס-בלוטביו-ראד1658030
תנור היברידיזציהפישר סיינטיפיקUVP95003001
מיקרוצנטריפוגה 5415 D עם רוטור F45-24-11 (אפנדורף)סיגמא אולדריץ'Z604062
אמבטיה יבשה International Corp400780
שייקר אורביטליVWR89032-092
מד pHVWR89231-662
ספק כוח למחבת קרח מלבנית SDS-PAGEBio-Rad1645050
, מקסי 9 Lפישר סיינטיפיק07-210-093
מיקרוסקופ סטריאו Stemi 508 עם מעמד K LAB, LED RING LIGHTZeiss4350649020000000מיקרוסקופ מנתח
VWR62344-641
אקדח צינורפישר סיינטיפיק11 676 341
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק02 215 414
אמבט מיםVWR89501-472
קופסת כתמים מערביתפישר סיינטיפיקNC9358182<
חזק> חומרים
כלי תרבית תאים, 6 ס"מפישר סיינטיפיק12-565-95
צלחות תרבית תאים, 12 בארותפישר סיינטיפיק07-200-82
מרימי תאיםפישר סיינטיפיק08-100-240
CO2AirgasCD USP50
צינורות חרוטיים, פוליפרופילן, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 מלקחיים עדיניםFine ScienceTools 11254-20
כף עוברFine ScienceTools 10370-17
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.5 מ"לVWR89000-010
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"לVWR20170-038
פיפט פסטר, 5.75 אינץ'פישר סיינטיפיק13-678-6A
פסטר, 9 אינץ'VWR14672-380
צלחות פטרי, 10 ס"מפישר סיינטיפיק08-757-100D
צלחות פטרי, 35 מ"מפישר סיינטיפיקFB0875711YZ
, שקיות, שקוף, פוליאתילן בטנהפישר סיינטיפיק01-812-25B
PVDF ממברנהפישר ScientificIPVH00010
מלקחיים SemkenFine ScienceTools 11008-13
נורת לטקס קטנה, 2 מ"לVWR82024-554
מספריים כירורגייםFine Science Tools14002-12
מסנן מזרק, 25 מ"מ, 0.2 μ m גודל נקבוביותפישר סיינטיפיק09-740-108
מזרק עם קצה לואר, 10 מ"לVWRBD309604
צינור העברהפישר סיינטיפיק13-711-22
ידית פתיחת קלטת כתם מערביתBio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr נייר כרומטוגרפיהפישר סיינטיפיק05-714-5
<חזק> ריאגנטים
4-15% ג'ל חלבון טרומי, 10 בארות, 30 ומיקרו; LBio-Rad4561083
β-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמא אולדריץ'G5422-25Gריכוז מלאי 1 M
β-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ'M3148-100ML
אלבומין סרום בקר, חלק V, נבדק הלם חוםפישר סיינטיפיקBP1600-100
ברומופנול כחולפישר סיינטיפיק
קוקטייל מעכב מיני פרוטאז שלםסיגמא אולדריץ'11836153001ריכוז מלאי 25x
ערכת בדיקת חלבון DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, גלוקוז גבוהGibco11965092
E7, נוגדן ראשוני בטא טובולין חד שבטי לעכבר, תרכיז 0.1 מ"למחקרים התפתחותיים בנק היברידומהE71:1,000
מצע כתמים מערבי ECLפישר סיינטיפיקPI32106טווח פיקוגרמה נמוך
ECL מצע כתמים מערבי ECLGenesee Scientific20-302Bטווח פמטוגרמה נמוך
מאגר אלקטרופורזה, 5 ליטרBio-Rad1610772 ריכוז מלאי 10x
אתנול, 200 הוכחה, 1 ליטרDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, Di Na מלח דיהידר. (Powd גבישי / אלקטרופור.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
סרום בקר עוברי, מאופיין, ממקור בארה"ב, 500 מ"לHyCloneSH30071.03
גליצרול (מוסמך ACS)Fisher ScientificG33-4
נוגדן משני מצומד HRP, עז נגד עכבר IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20,000
נוגדן משני מצומד HRP, עז אנטי ארנב IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20,000
תמיסת חומצה הידרוכלורית, 6N (מוסמך)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 חומר ניקוי לא יוניFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-גלוטמיןGibco25030081ריכוז מלאי 200 מ"מ
מתנולפישר סיינטיפיקA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) נוגדנים ראשונייםטכנולוגיית איתות תאים9102S1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB ליגנד רקומביננטיחולדה פישר סיינטיפיק520BB050
קולטן PDGF ובטא;טכנולוגיית איתות תאי3169S1:1,000
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140122ריכוז מלאי 100 יח'/מ"ל, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל
פניל-מתאןסולפוניל פלואוריד, 99%פישר סיינטיפיקAC215740100-PMSF; ריכוז מלאי 100 מ"מ
פוספו-p44/42 MAPK (Erk1/2) טכנולוגייתאיתות תאינוגדנים ראשוניים 9101S1:1,000, אנטי-פוספו-Erk1/2
קולטן פוספו-PDGF ואלפא; /קולטן PDGF ובטא;טכנולוגיית איתות תאיראשוניים 3170S1:1,000
אשלגן כלורי (גבישים לבנים)פישר סיינטיפיקBP366-500KCl
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (גבישים לבנים)פישר סיינטיפיקBP362-500KH2PO4
SDS solution, 10%Bio-Rad161-0416
נתרן כלורי (גבישי/ביולוגי, מאושר)Fisher ScientificS671-3NaCl
נתרן פלואוריד (אבקה/מאושר ACS)Fisher ScientificS299-100NaF; מנה לשימוש חד פעמי; ריכוז מלאי 1M
נתרן אורתוונדאט, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; ריכוז מלאי 100 מ"מ
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (גרגירי או אבקה/מאושר ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Tissue Culture, PBSFisher Scientific21-031-CV
מאגר העברה, 5 ליטרBio-Rad1610771ריכוז מלאי 10x
בסיס טריס (גבישים לבנים או אבקה גבישית/ביולוגיה מולקולרית)Fisher ScientificBP152-1
TrypsinBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western blot סמן משקל מולקולריBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareהמכונים הלאומיים לבריאות
Animals
Female 129S4 עכבריםמתנת ד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה ע"ש אייקן בהר סיני
מוצרי מיני מוצרי מחקר טיימר AC403140050, נוגדנים ראשוניים נוגדנים

מקורות

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blot
בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.