הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של אברוני שמרים עם סמני חלבון פלואורסצנטיים

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63846

⸱

20 באפריל 2022

 ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Metabolism & Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים את השימוש בקבוצה של סמני אברונים מבוססי חלבון פלואורסצנטי בהדמיית תאים חיים של השמרים הניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

תקציר

השמרים הניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הם מערכת מודל קלאסית לחקר תפקוד הדינמיקה של האברונים. בעבודות הקודמות שלנו, בנינו סמנים מבוססי חלבון פלואורסצנטי עבור אברונים עיקריים ומבנים אנדומברניים, כולל הגרעין, הרטיקולום האנדופלזמי (ER), מנגנון גולגי, אנדוזומים, ואקולים, מיטוכונדריה, פרוקסיזומים, טיפות שומנים ואוטופאגוזומים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליכים לשימוש בסמנים אלה בשמרים, כולל הכנת DNA לטרנספורמציה של שמרים, בחירה והערכה של טרנספורמציות, תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית והתוצאות הצפויות. הטקסט מיועד לחוקרים שנכנסים לתחום חקר אברוני השמרים מרקעים אחרים. שלבים חיוניים מכוסים, כמו גם הערות טכניות לגבי שיקולי חומרה של מיקרוסקופ ומספר מלכודות נפוצות. הוא מספק נקודת התחלה לאנשים לצפות בישויות תת-תאיות של שמרים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. ניתן להשתמש בכלים ובשיטות אלה כדי לזהות לוקליזציה תת-תאית של חלבונים ולעקוב אחר אברונים מעניינים בהדמיית זמן-lapse.

מבוא

מידור תת-תאי לאברונים הקשורים לממברנה הוא עיקרון נפוץ בארגון תאים אוקריוטיים. כל אברון ממלא פונקציות ספציפיות. כמו בהיבטים רבים אחרים של ביולוגיה אאוקריוטית, השמרים הניצנים, Saccharomyces cerevisiae, היו מערכת מודל קלאסית להבהרת העקרונות הבסיסיים של ארגון הדינמיקה של אברונים. דוגמאות כוללות את התגליות המכוננות במסלול הפרשת החלבון, מסלול ייבוא החלבון הפרוקסיזומלי ומסלול האוטופגיה 1,2,3.

בתנאים טיפוסיים עשירים בחומרים מזינים, תאי שמרים הגדלים במהירות מכילים רשתית אנדופלזמית (ER), גולגי מוקדם, גולגי מאוחר/אנדוזומים מוקדמים, אנדוזומים מאוחרים, ואקואולים ומיטוכונדריה. כמה פרוקסיזומים, טיפות שומנים ואוטופאגוזומים (אפילו פחות מהשניים הראשונים, בעיקר מסוג שלפוחית Cvt, הנמצאים בתנאים עשירים בחומרים מזינים4) קיימים גם הם, אך אינם בולטים כפי שהיו בתנאי תרבות ספציפיים (מדיה עשירה בשומנים, אמצעי רעב וכו'). בהשוואה למודלים איקריוטיים נפוצים אחרים, תאי שמרים הם קטנים למדי; הקוטר של תא שמרים טיפוסי הוא בסביבות 5 מיקרומטר, בהשוואה לעשרות מיקרומטרים עבור רוב תאי בעלי החיים והצומח. כתוצאה מכך, באותו שדה הדמיה המכיל בדרך כלל תא בעל חיים נצמד יחיד, ניתן לראות בדרך כלל עשרות תאי שמרים בשלבים שונים של מחזור התא. מלבד הבדלי הגודל, למורפולוגיה של אברוני השמרים יש גם כמה מאפיינים מוזרים. ברמה האולטרה-מבנית, שמרים ER מורכבים מיריעות וצינורות, כמו במערכות אחרות. במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ER שמרים מתבטא כשתי טבעות עם כמה מבנים מחוברים ביניהם. הטבעת הפנימית היא ה-ER הגרעיני, הרציף עם המעטפת הגרעינית, והטבעת החיצונית היא ה-ER ההיקפי, שהיא רשת צינורית השוכנת מתחת לקרום הפלזמה5. בדומה לתאי צמחים אך שונה מתאי בעלי חיים, אברון היברידי, גולגי המאוחר/אנדוזום מוקדם, יושב בצומת בין מסלול ההפרשה למסלול האנדוציטי 6,7. מבחינה מורפולוגית, מנגנוני גולגי שמרים מפוזרים בציטופלזמה. ווקואולים מקבילים מבחינה תפקודית לליזוזומים בתאי בעלי חיים. לעתים קרובות הם תופסים חלקים גדולים מהציטופלזמה ועוברים ביקוע ואיחוי תכופים. מלבד השימוש בסמני קו-לוקליזציה פלואורסצנטיים, ניתן להבחין בין קרום הווקולר ל-ER הגרעיני על ידי שני קריטריונים לפחות: קרום הווקולר בדרך כלל מעוגל יותר מה-ER הגרעיני, והמראה המערער של הוואקואול ב-DIC בולט יותר מזה של הגרעין.

באופן שגרתי, אנו משתמשים בקבוצה של סמנים מבוססי חלבון פלואורסצנטי כדי לדמיין את האברונים שהוזכרו לעיל בתאי שמרים חיים (טבלה 1). הנאמנות והפונקציונליות של סמני אברונים אלה אומתו בניסוי 7,8. מבני סמנים אלה נועדו להכניס קלטות כימרה של חלבון פלואורסצנטי לגנום השמרים. כפי שמתואר להלן, כהכנה להתמרת שמרים, שברי DNA ליניאריים נוצרים על ידי עיכול אנזימטי או הגברת PCR 7,8. מקטעי ה-DNA הליניאריים משולבים בגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. עבור פלסמידים המתוארים בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשלושה סוגים של עיצוב. בסוג הראשון, המכסה את רוב הפלסמידים, ניתן לעתים קרובות להשיג שנאים הנושאים עותקים מרובים של המבנה. זה בדרך כלל לא רצוי מכיוון שהוא מציג וריאציות אקספרסיביות ואולי פונקציונליות על פני טרנספורמציות. יש לזהות טרנספורמציות בעותק יחיד באמצעות הדמיה כמתואר בפרוטוקול זה, על ידי אימונובלוטינג או על ידי בדיקות PCR שתוכננו בקפידה. בסוג השני, המכסה את GFP-Sed5, GFP-Pep12 ו-GFP-Atg8, רק אינטגרציה של עותק יחיד מיוצרת בתאי שמרים הפלואידים. גם הסוג הראשון וגם הסוג השני שומרים על העותק האנדוגני של גן הסמן שלם בגנום. סוג שלישי של עיצוב פלסמיד, המכסה את Sec7-2GFP ו-Vph1-2GFP, נועד להציג דפיקות C-terminal, מה שמוביל לכך שהכימרות הן העותק היחיד של גן הסמן המתאים.

כאן אנו מתארים את ההליך לשימוש בסמני אברונים אלה, מספקים תמונות מיקרוסקופיה למופת ודנים באמצעי זהירות המיועדים לחוקרים חדשים בהדמיית אברוני שמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בניית מתח שמרים

  1. השג פלסמידים של סמן וזן שמרים מתאים.
    הערה: הפלסמידים זמינים מ-Addgene. פרוטוקול זה משתמש ב-TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) ו-DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) כדוגמאות. שיקול חשוב אחד לבחירת הזנים, מלבד אופי השאלה המדעית, הוא התאימות של סמני הבחירה. פלסמידים של סמני האברונים המתוארים כאן משתמשים ב-URA3 ו-TRP1 כסמני הבחירה. לכן, הגנוטיפ של הזן הנמען צריך להיות ura3 ו-trp1. אחרת, צריך לשנות את הזן או את הפלסמידים.
  2. הכינו מדיה שמרים לפי המתכונים הבאים.
    הערה: SMD (דקסטרוז מינימלי סינתטי; 2% גלוקוז, 0.67% בסיס חנקן שמרים (YNB) ללא חומצות אמינו, 30 מ"ג/ליטר אדנין, 30 מ"ג/ליטר ליזין, 30 מ"ג/ליטר מתיונין, 20 מ"ג/ליטר היסטידין, 20 מ"ג/ליטר אורציל, 50 מ"ג/ליטר טריפטופן, 50 מ"ג/ליטר לאוצין). SMD+CA (SMD בתוספת 0.5% חומצות קסאמינו). YPD (תמצית שמרים, פפטון דקסטרוז; 1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז). SD-N (דקסטרוז סינטטי ללא חנקן; 0.17% YNB ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתי, 2% גלוקוז). אנא עיין בסעיף הדיון לשיקולים על בחירת המדיום.
  3. לפני שלב הטרנספורמציה, צור שברי DNA ליניאריים על ידי עיכול אנזימטי או הגברת PCR של פלסמיד סמן אברון.
    הערה: טבלה 1 מפרטת את אתרי אנזימי ההגבלה ופריימרים PCR ליצירת שברים ליניאריים מפלסמידים של סמן האברון.
  4. תאי שמרים מגדלים במדיום YPD נוזלי והופכים שמרים עם שבר DNA ליניארי.
    הערה: ניתן לבצע טרנספורמציה של שמרים בשיטה הקונבנציונלית המבוססת על LiAc9 או בשיטות אחרות לבחירה. רצוי לכלול בקרות מתאימות לטרנספורמציה, בפרט, בקרה שלילית ללא פלסמיד או DNA שמקורו בפלסמיד.
  5. דגירה על צלחת בחירה מתאימה (למשל, לבחירת URA3 , השתמש במדיום SMD-Ura) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
    הערה: לוקח בערך יומיים עד שמושבות בודדות מופיעות.
  6. כדי לאמת ביטוי כימרה פלואורסצנטית ומספר עותק אינטגרציה, בחר שמונה מושבות מלוח הבחירה, פס מחדש על לוחות בחירה טריים ודגר ב-30 מעלות צלזיוס.

2. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: פרוצדורות כלליות והדמיה בנקודת זמן אחת

  1. תאי שמרים תרבית לילה במדיום נוזלי SMD בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול.
  2. למחרת בבוקר, מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית שמרים ב-600 ננומטר (להלן OD600) בספקטרופוטומטר או בקורא צלחות.
    הערה: עם תרגול מסוים על חיסון שמרים, בדרך כלל ניתן להבטיח ש-OD600 מכל הדגימות נמוך מ-2 בשלב זה. אם זה בסופו של דבר גבוה יותר, רצוי לדלל יותר בשלב הבא ולאפשר יותר זמן לתאי השמרים להתאושש.
  3. מדללים את תרבית השמרים לכ-0.2 OD600 באמצעות מדיום טרי.
  4. המשך בתרבית עד ש-OD600 יגיע ל-0.8-1.0 בקירוב.
    הערה: זמן ההכפלה של השמרים הוא כ-1.5-2 שעות.
  5. הניחו כיסוי על גבי נייר טישו על משטח ישר, מרחו 5 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל concanavalin A על הצד העליון של זכוכית הכיסוי, והמתינו 5 דקות (איור 1A)10.
    הערה: ניתן לבצע שלב הכנה זה מבעוד מועד.
  6. מעבירים 100 מיקרוליטר תרבית שמרים לצד העליון של זכוכית הכיסוי, וממתינים 5 דקות.
  7. שלב את זכוכית הכיסוי עם שקופית זכוכית תומכת, כאשר תאי השמרים דחוסים ביניהם; לחץ בכוח המתאים כדי לאבטח את הקובץ המצורף.
    הערה: נדרש תרגול מסוים כדי למצוא את הלחץ הנכון, כך שתאי שמרים יוצרים שכבה אחת לא ניידת אך אינם נמעכים (איור 1B). המדיום הנוזלי יידחף החוצה וייספג על ידי נייר הטישו הבסיסי במהלך שלב זה.
  8. התקן את שקופית הדגימה על שלב המיקרוסקופ. אתר והתמקד בתיקון של תאי שמרים באמצעות ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) או ניגודיות פאזה (PC).
    הערה: אל תשתמש בקרינה כדי לאתר תאים; אחרת, האות עלול להיות מולבן לפני איסוף הנתונים.
  9. הגדר באופן ידני שלוש קבוצות של פרמטרים לאיסוף ערימות z של תמונות: חתך z, ערוצי הדמיה ופרמטרי חשיפה.
    הערה: ראה איור משלים 1 לדוגמאות ממשק משתמש גרפי של הגדרות פרמטרים בתוכנה מסחרית אחת. המראה המדויק שונה בין פלטפורמות תוכנה, אך האפשרויות פחות או יותר זהות.
    1. חתך Z: אסוף פרוסות ב-0.5 מיקרומטר דריכה ל-15 פרוסות (מכסה עומק של 7 מיקרומטר, מספיק בדרך כלל לתאי שמרים הפלואידים רגילים).
    2. ערוצי הדמיה: בחר DIC או PC עבור קווי מתאר של תאים ותעלות פלואורסצנטיות מתאימות לפי הצורך.
    3. עוצמת אור עירור וזמן חשיפה: הגדר את עוצמת אור העירור וזמן החשיפה בהתאם לדגימה.
      הערה: כנקודת התחלה, השתמש ב-100% עבור עוצמת אור עירור ו-100 אלפיות השנייה עבור זמן החשיפה; הפחת את עוצמת האור אם פוטו-הלבנה הופכת ברורה עם התקדמות איסוף z-stack או אם האות חורג מיכולת הקלטת המצלמה (כלומר, רוויית האות); הגדל את עוצמת האור אם יחס האות לרעש נמוך.
  10. רשום את הגדרות ההדמיה והשתמש באותן הגדרות עבור כל הדגימות להשוואה.
    הערה: אל תשתמש בהגדרה "אוטומטי" עבור איסוף נתונים ותצוגה חזותית של תמונה. חשוב לרשום את ההגדרות בהערת מעבדה כדי שניתן יהיה ליישם מחדש את אותם פרמטרים בדיוק בחזרות ניסויים עתידיות. לחלק מיישומי התוכנה השולטים במיקרוסקופ יש את היכולת לשמור ולהחיל מחדש הגדרות; למרות זאת, רצוי להקליט את ההגדרות באופן עצמאי מכיוון שפרופילי תוכנה עלולים להימחק או להשתנות שלא במתכוון על ידי עמיתים לעבודה.
  11. שמור את הנתונים בתבנית אוסף רב-ערוצי של 16 סיביות.
    הערה: אל תשמור כתמונות RGB של 8 סיביות (או 24 סיביות, אם סופרים את כל שלושת הצבעים). עיין בסעיף תצוגה חזותית של תמונה (סעיף 4) למגבלות של פורמט 8 סיביות.
  12. עבור לאזור אחר לגמרי עבור אוסף אוסף התמונות הבא.
    הערה: ייתכן שאזורים סמוכים חוו פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות. כתוצאה מכך, ערימת התמונות שנאספה מאזורים אלה עלולה להטעות.

3. הדמיית זמן-lapse

הערה: ההליך של הדמיית זמן-lapse שונה מזה של הדמיית נקודת זמן בודדת בשני תחומים: הכנת דגימה ופרמטרים של הדמיה.

  1. הכנת מדגם
    1. מצפים צלחת עם תחתית זכוכית 35 מ"מ ב-1 מ"ג/מ"ל קונקנבלין A וממתינים 5 דקות או יותר.
    2. מוסיפים לתבשיל 1.5 מ"ל תרבית נוזלית שמרים, ומחכים 5 דקות כדי לאפשר לתאי השמרים להתיישב על משטח הזכוכית.
    3. בעזרת פיפט, שאפו את המדיום הנוזלי מקצה המנה, ולאחר מכן שטפו בעדינות את כתם משקעי השמרים בכ-1 מ"ל של מדיום טרי כדי להסיר תאים מחוברים בצורה לא בטוחה.
    4. חזור על השטיפה 2-3 פעמים. שואבים בעזרת פיפט, ואז מוסיפים בעדינות 2 מ"ל מדיום תרבית טרי.
  2. פרמטרי הדמיה
    1. חתך Z: אוספים פרוסות ב-0.5 מיקרומטר ודורכים ל-15 פרוסות.
    2. ערוצי הדמיה: בחר לפי הצורך.
    3. עוצמת אור עירור וזמן חשיפה: השתמש במינימום הדרוש כדי להבחין במבנה התת-תאי הנחקר.
      הערה: עבור הדמיית זמן-lapse, פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות מתאורה חוזרת מגבילים את המספר הכולל של נקודות הזמן שניתן לאסוף. לכן, עוצמת העירור וזמן החשיפה מוגדרים בדרך כלל לערכים נמוכים כך שניתן יהיה לצלם יותר נקודות זמן.
    4. מרווח הדמיה: הגדר את מרווחי התזמון המתאימים לתהליך הביולוגי הנחקר.
      הערה: לדוגמה, היווצרות אוטופאגוזום בתנאי רעב אורכת כ-5-10 דקות; עדיף מרווח של דקה או פחות כדי לעקוב אחר הדינמיקה שלו. בתנאים עשירים בחומרים מזינים, מחזור תאי השמרים מתרחש בסולם השעות; ניתן להשתמש במרווח זמן ארוך יותר, כגון 10-20 דקות.
  3. אם קיימת חומרה מתאימה, שמור על טמפרטורת המנה על 30 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לדמות את רוב התהליכים הביולוגיים בתאי שמרים גם בטמפרטורת החדר (RT), למעט בקצב איטי יותר באופן כללי.

4. הדמיה של ערימות תמונות והערכת מספר עותק האינטגרציה

  1. התקן את תוכנת פיג'י או ImageJ להדמיה וניתוח תמונות11,12.
    הערה: פיג'י הוא אוסף כלים המבוסס על ImageJ, המתאים להדמיה ועיבוד של נתוני תמונה ביולוגיים למטרות כלליות. לעיבוד תמונה המפורט בפרוטוקול זה, ImageJ ללא תוספים נוספים מספיק.
  2. בחר פרמטרים מתאימים להצגת תמונה והשוואה.
    1. בפיג'י, פתח כמה תמונות z-stack.
    2. גרור את מיקום ה-z בכל ערימה לחלק האמצעי (או למיקומים אחרים אם המבנה הנחקר מוצג שם טוב יותר).
    3. עבור אל תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות ולחץ על איפוס.
    4. בחלון בהירות/ניגודיות (B&C), השתמש בפסי הגלילה כדי לשנות שני פרמטרים, ערכי מינימום ומקסימום, כדי להבחין בבירור במבנה הנבדק.
      הערה: בדרך כלל, הערך Minimum מוגדר כקרוב לערך הממוצע באזורים ריקים, והערך Maximum מוגדר כקרוב לערך המרבי בתמונה. ניתן להסיק ערכים אלה מההיסטוגרמה המוצגת (איור 2A). אם תחנת העבודה להדמיה מכוילת בצבע, ניתן להגדיר את הערך המינימלי מעט גבוה יותר כדי להסתיר אותות רקע נוספים.
    5. בחלון בהירות/ניגודיות (B&C), לחץ על הגדר ובחר בתיבת הסימון הפץ לכל שאר התמונות הפתוחות בחלון המוקפץ הגדר טווח תצוגה.
      הערה: פעולה זו מחילה את אותן הגדרות בהירות/ניגודיות (כולל ערכי המינימום והמקסימום) על כל התמונות הפתוחות, כך שניתן יהיה להשוות בין התמונות.
    6. הסתכל על פני תמונות שונות וגלול דרך מחסנית ה-z בכל אחת מהן. אם התמונות נראות טוב עם רקע כהה מתאים ומעט רוויות מוגזמות, רשום את הגדרות המינימום והמקסימום.
  3. לתמונות מרובות ערוצים, בחרו קביעות תצוגת תמונה לכל ערוץ:
    1. עבור אל Image > Color > Channels Tool, בחר את מצב גווני אפור בחלון המוקפץ ערוצים.
    2. עברו על כל ערוץ, בחרו את הבהירות/ניגודיות המתאימה לאותו ערוץ, ורשמו את ההגדרות.
    3. כאשר הבהירות/ניגודיות מותאמת, חזור לחלון ערוצים ועבור למצב מורכב להדמיה בו-זמנית של ערוצים מרובים.
      הערה: ניתן לשנות את הצבע המדומה עבור כל ערוץ באופן ידני בערוצים כדי להתאים להעדפות אישיות. תיבות הסימון מיועדות להצגה/הסתרה של ערוצים מסוימים.
  4. במידת הצורך, השתמש בתיבות הסימון בחלון ערוצים כדי להציג או להסתיר ערוצים מסוימים.
  5. אם תרצה, צור הקרנות מחסנית על-ידי מעבר אל Image > Stacks > Z Project.
    הערה: מספר מצבי הקרנה זמינים. עוצמה מקסימלית היא בחירה טובה להערכה מהירה. יש לקחת בחשבון את אופי המחקר כדי לקבוע אם יש להשתמש במצב הקרנה מסוים או בפרוסות בודדות לכימות. ניתן גם להגביל את ההקרנה לפרוסות z נבחרות כדי להפחית את ההפרעות של אור לא ממוקד.
  6. מסך לשנאי אינטגרציה של עותק יחיד.
    1. לאחר החלת אותן הגדרות בהירות/ניגודיות על כל התמונות הפתוחות, השווה את עוצמות התמונה על פני דגימות כדי להסיק את מספר שילוב הפלסמיד.
      הערה: יש לרכוש תמונות על ידי ביצוע ההליך הכללי להדמיה של נקודת זמן אחת, החל מתרבית לילה במדיום נוזלי. אינטגרציות מרובות עותקים (ראה מושבה 2 ו-3 באיור 2B לדוגמאות) נראות בהירות יותר באופן משמעותי מאלה של עותק יחיד (מושבה 1 באיור 2B). בניגוד לכך, עותקים בודדים נראים דומים זה לזה (איור 2B).
    2. בדוק תמונות משמונה שנאים עבור כל זן, והקפד להשתמש באותן הגדרות בהירות/ניגודיות .
    3. פס מחדש ושמור שלושה או יותר שנאים בעלי עותק יחיד למחקר הבא.
  7. ייצוא תמונות להצגה.
    1. עבור אל תמונה > שכפל כדי ליצור עותק של התמונה המעניינת ולתת לה שם לבחירתה.
    2. עבור אל תמונה > הקלד > 8 סיביות כדי להמיר את העותק המשוכפל מ-16 סיביות ל-8 סיביות ולשמור אותו לפי הצורך.
      הערה: שים לב שלאחר החלת זה, אם הגדרות הבהירות/ניגודיות לא נרשמו קודם לכן, אין דרך קלה לאחזר מידע זה, ולכן אין דרך קלה להחיל מחדש את אותה הגדרה בתצוגות חזותיות עוקבות של תמונה. זו גם הסיבה לכך שפעולת השכפול הקודמת מומלצת.
    3. כדי לפצל ערימת z לאוסף של תמונות נפרדות, עברו אל אוספי תמונות > > אוספים לתמונות ושמרו לפי הצורך.
      הערה: ניתן גם לחתוך תמונות לאזור קטן יותר בפיג'י.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מורפולוגיה ודינמיקה של אברונים נתונים לשינויים כאשר תאי שמרים מגיבים לאותות חיצוניים ופנימיים. כאן, אנו מספקים תמונות מייצגות של אברוני שמרים בשלב אמצע העץ (איור 3A,B). כפי שהוזכר קודם לכן, למספר אברונים יש את המאפיינים המורפולוגיים המובהקים שלהם, ולכן קל לזהות אותם ללא השוואה נרחבת עם סמני אברונים אחרים. אלה כוללים ER, מיטוכונדריה ווואואולים. שימו לב שבחלק מזני המעבדה, כולל אלה שאנו מראים כאן, מאזן הביקוע-היתוך של הווקואולים מוטה עד כדי כך שתאים רבים בשלב הלוג מכילים ואקואו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק התחלה פשוטה לאנשים הנכנסים מתחומי מחקר אחרים לחקור אברוני שמרים הדמיה. לפני שנעבור לנושאים ספציפיים, ברצוננו להדגיש פעם נוספת שצריך להימנע משימוש מופרז בתכונות אוטומטיות בתוכנות הדמיה. תמונות מיקרוסקופיה אינן רק תמונות יפות, הן נתונים מדעיים, ולכן יש להתייחס לרכישתן ולפרשנותן בהתאם. חשוב במיוחד שפרמטרים של איסוף תמונות ייבחרו באופן מצפוני, ויכירו את המושגים של תמונות 16 סיביות לעומת 8 סיביות.

פרוטוקול זה מפרט ארבע מדיות שמרים שונות: S...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת Xie על עזרתם הנדיבה בהכנת כתבי היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק 91957104), ועדת החינוך העירונית של שנגחאי (מענק 2017-01-07-00-02-E00035) והוועדה העירונית למדע וטכנולוגיה של שנגחאי (מענק 22ZR1433800).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AdenineSangon BiotechA600013
CasaminoacidSangon BiotechA603060
Concanavalin A מ-canavalia ensiformis (שעועית ג'קSigma AldrichL7647
D-GlucoseSangon BiotechA501991
פיג'יhttps://fiji.sc/
צלחתפטרי עם תחתית זכוכיתNEST706001Φ 35 מ"מ
ImajeJhttps://imagej.net/
מיקרוסקופ פלורסנט הפוךאולימפוסIX83 מצויד במטרת טבילת שמן UPLXAPO 100X, מקור אור Lumencor Spectra X ומצלמת Hamamatsu Orca Flash4.0 LT.
L-HistidineSangon BiotechA604351
L-לאוציןסנגון ביוטקA100811
L-ליזיןסנגון ביוטקA602759
L-מתיוניןסנגון ביוטקA100801
L-טריפטופןסנגון ביוטקA601911
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתCITOTEST10222222C22 מ"מ x 22 מ"מ, 0.16 אינץ'; 0.19 מ"מ
שקופיות מיקרוסקופCITOTEST1A510125 מ"מ x 75 מ"מ, 1– 1.2 מ"מ
פפטוןסנגון ביוטקA505247
UracilSangon BiotechA610564
VisiviewVisitron System GmbH
https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html תמצית שמריםסנגון ביוטקA100850
שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינוSangon BiotechA610507
YNB ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתיסנגון ביוטקA600505
)

מקורות

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
  2. Spang, A. Anniversary of the discovery of sec mutants by Novick and Schekman. Molecular Biology of the Cell. 26 (10), 1783-1785 (2015).
  3. Walter, T., Erdmann, R. Current advances in protein import into peroxisomes. The Protein Journal. 38 (3), 351-362 (2019).
  4. Farre, J. C., Subramani, S. Mechanistic insights into selective autophagy pathways: lessons from yeast. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (9), 537-552 (2016).
  5. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Zhu, J., et al. A validated set of fluorescent-protein-based markers for major organelles in yeast (Saccharomyces cerevisiae). mBio. 10 (5), 19(2019).
  8. Li, D., et al. A fluorescent tool set for yeast Atg proteins. Autophagy. 11 (6), 954-960 (2015).
  9. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods in Molecular Biology. 313, Clifton, N.J. 107-120 (2006).
  10. Caloca, B., et al. Comparison of concanavalin A and poly-l-lysine as cell adhesives for routine yeast microscopy applications. Yeast. , (2021).
  11. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Banfield, D. K., Lewis, M. J., Pelham, H. R. B. A SNARE-like protein required for traffic through the Golgi complex. Nature (London). 375 (6534), 806-809 (1995).
  14. Curran, B. P., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1163, Clifton, N.J. 1-14 (2014).
  15. Zhao, W., et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. , (2021).
  16. He, C. W., et al. Membrane recruitment of Atg8 by Hfl1 facilitates turnover of vacuolar membrane proteins in yeast cells approaching stationary phase. BMC Biology. 19 (1), 117(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Saccharomyces cerevisiae
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.