Method Article

יכולת שחזור ודיוק משופרים של כימות תפוקה גבוהה של נתוני גידול חיידקים באמצעות קורא מיקרו-פלטות

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מוצג פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה למדידת נתוני צמיחה, כולל עקומות צמיחה, קצב צמיחה וקצב צמיחה מקסימלי. הפרוטוקול אומת ותוקף באמצעות שני חיידקים המייצרים ביופילם. ניתן להרחיב את התוצאות והגישה המיושמת במחקר זה לפרוטוקולים אחרים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות קוראי מיקרו-פלטות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול חוזר, אמין ובעל תפוקה גבוהה לניטור צמיחת חיידקים בצלחות של 96 בארות ולניתוח קצב הגידול המרבי. נקבעו עקומות הצמיחה ושיעורי הגידול המקסימליים של שני מיני חיידקים. נבדקו נושאים הכוללים (i) עיבוי מכסה, (ii) תיקון אורך מסלול, (iii) גודל החיסון, (iv) מרווח זמן הדגימה ו-(v) הטיה מרחבית. יכולת החזרה של הפרוטוקול הוערכה באמצעות שלושה שכפולים טכניים בלתי תלויים, עם סטיית תקן של 0.03 בין הריצות. שיעורי הגידול המקסימליים של Bacillus mycoides ו-Paenibacillus tundrae נקבעו כ±-0.99 h-1 ±-0.03 h-1 ו-0.85 h-1 ±-0.025 h-1, בהתאמה. חיידקים אלה מאתגרים יותר לניטור אופטי בשל זיקתם להתקבץ יחד. מחקר זה מדגים את החשיבות הקריטית של גודל החיסון, תיקון אורך הנתיב, התחממות המכסה, מרווחי זמן הדגימה וההטיה המרחבית של לוח הבאר כדי להשיג נתונים אמינים, מדויקים וניתנים לשחזור על קוראי מיקרו-לוחות. ניתן להרחיב את הפרוטוקול שפותח ואת שלבי האימות שלו לשיטות אחרות באמצעות קוראי מיקרו-פלטות ופרוטוקולים בעלי תפוקה גבוהה, מה שמפחית את השגיאות המולדות של החוקרים ואת עלויות החומר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח עניין במניפולציה מולטי-אומיקס, כולל מחקרי מנגנון ומטבוליזם של חיידקים, מדגיש את החשיבות של שיטות אוטומטיות בתפוקה גבוהה כגון רישום נתוני גדילה 1,2. נתוני גדילה הכוללים פרמטרים קינטיים, כגון שיעורי גדילה מקסימליים, יכולים לסייע באפיון תגובות חיידקים לתנאים פיזיקליים, כימיים ואנטיבקטריאליים שונים. נתוני קצב הגדילה הם משתנה תגובה סטנדרטי המשמש לחשיפת קשרים פוטנציאליים בין גנוטיפלפנוטיפ 1 או להצביע על הבטיחות המיקרוביאלית וחיי המדף של תוצרת מזון 3,4. טכניקות כגון אבולוציה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: יש לבצע את כל השלבים בפרוטוקול זה בתנאים סטריליים (כלומר, בין שתי להבות או ארון בטיחות ביולוגית). כל החומרים והכלים עוברים חיטוי למשך 20 דקות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה. ידיים עטויות כפפות מחוטאות, נשמרות רטובות בחומר חיטוי ידיים או בתמיסת אלכוהול 70% למשך דקה אחת לפחות, ולא מוסרות מארון הבטיחות לאחר מכן. אחרת, יש לחזור על הליך החיטוי לפני הכנסת הידיים בחזרה לארון הבטיחות. זהירות: ודא שחומר החיטוי מתאדה לחלוטין לפני השימוש בלהבה פתוחה.

הערה: שני חיידקים בודדו מסינון ביולוגי של מי שתייה כפי שהוסבר קודם לכן27 בשל יכולתם לייצר ביופילם. הם ז....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימות קריאת OD וגורם תיקון אורך נתיב
דגימות מפוצלות של תרבית B. mycoides נלקחו בנקודות זמן שונות ונמדדו באמצעות קורא המיקרו-פלטות והספקטרופוטומטר (איור 1A). צעד זה ננקט כדי לאמת את התוצאות במכשירים שונים. נתוני OD600 היו בקורלציה אך לא תואמים (איור 1B). המתאם היה ליניארי עם שיפוע של 0.55 (רווח בר-סמך 95%: 0.53-0.58, R2 = 0.99), מה שמצביע על היסט קבוע (שיפוע) בין שני המכשירים. מבחן טוהר ההתאמה מצא את שורש השגיאה .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוראי מיקרו-פלטות מאפשרים להשיג שיעורי צמיחה עקביים וניתנים לחזרה. טכנולוגיה זו ממזערת טעויות אנוש ומאפשרת דגימה בתפוקה גבוהה. כמות התרבית הקטנה הנדרשת לדגימה הופכת גישה זו לחלופה אטרקטיבית ובעלות נמוכה לספירת תאים באמצעות צלוחיות או מבחנות. קוראי Microplate מאפשרים גודל מדגם גדול, מגדילים את העוצמה הסטטיסטית ובהמשך מאפשרים חישובי קצב צמיחה אמינים תוך שמירה על עלויות ועבודה נמוכות.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט למדידה וניתוח נתוני גידול. הפרוטוקול אומת עם B........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC) / יו"ר המחקר התעשייתי של הליפקס לאיכות וטיפול במים (מענק מס. IRCPJ 349838-16). צוות המחברים רוצה גם להודות לעזרתה של אניטה טיילור בסקירת מאמר זה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צנטריפוגה Eppendorf5810 R
- 15 מ"ל תרמו-פישר - מדעי 339650
צינורות צנטריגוגה סטריליים - 50 מ"ל תרמו-פישר - מדעי 339652
לולאת חיסון חד פעמית סטרילית, 10 ומיקרו; לקול-פארמר UZ-06231-08
צלוחיות Erlenmeyer סטריליות - 250 מ"ל קול-פארמר   UZ-34502-59זכוכית 
איזופרופנול תרמו-פישר - מדעי 396982500≥ 99.0
מאגר פוספט מי מלח סיגמא-אולדריץ'P4417
טיפים פיפט 1,000 ומיקרו; LThermoFisher- מדעי   UZ-25001-76
קצות פיפט 10 מ"ל תרמו-פישר - מדעי UZ-25001-83
טיפים לפיפט 200 ומיקרו; LThermoFisher- מדעי UZ-25001-85
טיפים לפיפט 5 מ"ל תרמו-פישר - מדעי   UZ-25001-80
פיפטור 1,000 ומיקרו; לקול-פארמר UZ-07909-11
פיפטור 10 מ"לקול-פרמר UZ-07909-15
פיפטור 200 ומיקרו; לקול-פארמר   UZ-07909-09
פיפטור 5 מ"ל קול-פארמר UZ-07859-30
מרק סויה טריפטי  Millipore22091מתאים למיקרוביולוגיה
צינורות צנטריפוגה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
  2. Sparkes, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial GrowthMicroplate ReaderHigh Throughput QuantificationGrowth Rate Analysis96 Well PlatesPathlength CorrectionInoculation SizeSampling IntervalSpatial BiasTechnical Replication
Video Coming Soon

Related Articles