Method Article

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העניין במיקרוסקופיה של אלקטרונים נוזליים (liquid-EM) הרקיע שחקים בשנים האחרונות כאשר מדענים יכולים כעת לצפות בתהליכים בזמן אמת בקנה מידה ננומטרי. רצוי מאוד להתאים מידע cryo-EM ברזולוציה גבוהה עם תצפיות דינמיות כמו אירועים רבים מתרחשים על צירי זמן מהירים - בטווח של אלפית השנייה או מהר יותר. ידע משופר על מבנים גמישים יכול גם לסייע בתכנון ריאגנטים חדשים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים, כגון SARS-CoV-2. חשוב מכך, צפייה בחומרים ביולוגיים בסביבה נוזלית מספקת הצצה ייחודית לביצועיהם בגוף האדם. מוצגות כאן שיטות שפותחו לאחרונה כדי לחקור את התכונות הננומטריות של מכלולי וירוסים בקרח נוזלי וזגוגי. כדי להשיג מטרה זו, דגימות מוגדרות היטב שימשו כמערכות מודל. מוצגות השוואות זו לצד זו של שיטות הכנת המדגם ומידע מבני מייצג. תכונות תת-ננומטר מוצגות עבור מבנים שנפתרו בטווח של ~3.5-Å-10 Å. תוצאות עדכניות אחרות התומכות במסגרת משלימה זו כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון וטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. באופן כללי, יישומים קורלטיביים אלה מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לשימוש בהם בבריאות האדם ובמחלות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הביו-רפואי משפר את הבנתנו את בריאות האדם ומחלותיו באמצעות פיתוח טכנולוגיות חדשות. הדמיה ברזולוציה גבוהה משנה את השקפתנו על עולם הננו - ומאפשרת לנו לחקור תאים ומולקולות בפירוט רב 1,2,3,4,5. מידע סטטי של רכיבים דינמיים כגון פולימרים רכים, מכלולי חלבונים או וירוסים אנושיים חושף רק תמונת מצב מוגבלת של הנרטיב המורכב שלהם. כדי להבין טוב יותר כיצד ישויות מולקולריות פועלות, יש לחקור במשותף את המבנה והתפקוד שלהן.

ההתקדמות האחרונה בייצור חומרים כגון גרפן דק אטומית או שבבים מבוססי סיליקון מספקת הזדמנויות חדשות לניתוח מבנה-תפקוד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופי אלקטרונים (TEMs). חומרים אלה יכולים ליצור תאים אטומים הרמטית להדמיית EM חיה 6,7,8,9,10,11. התחום החדש של liquid-EM, טמפרטורת החדר בקורלציה לקריו-EM, מספק תצוגות חסרות תקדים של חומרים קשים או רכים בתמיסה, ומאפשר למדענים לחקור בו זמנית את המבנה והדינמיקה של הדגימה שלהם. יישומי Liquid-EM כוללים הקלטות בזמן אמת של ננו-חלקיקים טיפוליים המקיימים אינטראקציה עם תאי גזע סרטניים, כמו גם שינויים במורכבות המולקולרית של פתוגנים נגיפיים12,13,14.

בדיוק כפי שההתקדמות המתודולוגית דרבנה את מהפכת הפתרון בתחום הקריו-EM, יש צורך בטכניקות ושיטות חדשות כדי להרחיב את השימוש ב-liquid-EM ככלי בעל תפוקה גבוהה עבור הקהילה המדעית. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לייעל את פרוטוקולי ההכנה של דגימות Liquid-EM. הרציונל מאחורי הטכניקות שפותחו הוא שימוש בעיצובי שבבים חדשים ובהתקני טעינה אוטומטית, המתאימים הן לאיסוף נתונים נוזליים והן לאיסוף נתונים קריו-EM (איור 1)7,14,15,16,17. המכלולים אטומים מכנית באמצעות תפסי רשת סטנדרטיים עבור מכשירים אוטומטיים, כגון ה-Krios, שיכולים להכיל דגימות מרובות בכל סשן או F200C TEM (איור 2). מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש בהדמיה ברזולוציה גבוהה מעבר ליישומי cryo-EM סטנדרטיים המדגימים מטרות רחבות יותר לניתוח חומרים בזמן אמת.

במאמר הווידאו הנוכחי מוצגים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים בנוזל עם ובלי מחזיקי דגימה זמינים מסחרית. באמצעות מחזיק הדגימה המיוחד עבור liquid-EM, דגימות נוזליות דקות יכולות לספק מידע מבני הדומה לדגימות cryo-EM, כמו גם תובנות דינמיות של הדגימות. כמו כן הודגמו שיטות להכנת דגימות נוזליות באמצעות כלי autoloader עבור שגרות תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי על פני טכניקות אחרות הוא שייצור דגימות אוטומטי מאפשר למשתמש להעריך במהירות את הדגימות שלו עבור עובי אופטימלי ומינון אלקטרונים לפני איסוף הנתונים. טכניקת סינון זו מזהה במהירות אזורים אידיאליים להקלטות בזמן אמת בנוזל או בקרח12,14,18,19. לצורך קביעת מבנה תלת-ממדי, Liquid-EM עשוי להשלים את שיטות cryo-EM הוותיקות המיושמות ב- cryo-EM. קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול להשתמש בזרימות עבודה של Liquid-EM כדי לספק תצפיות חדשות ודינמיות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם.

דגימות וירוסים המשמשות בפרוטוקול זה כוללות תת-סוג וירוס מטוהר הקשור לאדנו 3 (AAV) שהושג במתנה ותורבית בתנאים סטנדרטיים12. כמו כן נעשה שימוש במכלולים תת-ויראליים לא זיהומיים של SARS CoV-2 שמקורם בסרום של חוליCOVID-19 12 והתקבלו ממקור מסחרי. לבסוף, חלקיקים דו-שכבתיים מטוהרים מסוג simian rotavirus (זן SA11) התקבלו ממעבדתה של ד"ר שרה מ. מקדונלד אסתמן באוניברסיטת ווייק פורסט וגודלו בתרבית בתנאים סטנדרטיים 6,17. חבילות התוכנה המתוארות כאן זמינות באופן חופשי והקישורים סופקו בסעיף טבלת חומרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טעינת מחזיק הדגימה עבור נוזל-EM

  1. נקו את שבבי הסיליקון ניטריד (SiN) על ידי דגירה של כל שבב ב-150 מ"ל של אצטון למשך 2 דקות ולאחר מכן דגירה ב-150 מ"ל של מתנול למשך 2 דקות. אפשרו לשבבים להתייבש בזרימת אוויר למינרית.
  2. פלזמה לנקות את השבבים המיובשים באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים של 30 W, 15 mA עבור 45 s באמצעות גז ארגון.
  3. טען שבב בסיס יבש לתוך קצה מחזיק הדגימה. הוסף ~ 0.2 μL של דגימה (0.2-1 מ"ג / מ"ל של מכלולים וירוס ב 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) לשבב הבסיס. לאחר שלב דגירה של 1-2 דקות, הניחו את השבב העליון על שבב הבסיס הרטוב המכיל את הדגימה.
  4. מהדקים את המכלול יחד ליצירת מארז אטום הרמטית, המוחזק במקומו מכנית על ידי שלושה ברגי פליז. לאחר איטום המכלול, יש לשאוב את הקצה ל-10-6 Torr באמצעות תחנת שאיבה יבשה עם שאיבה טורבו. המחזיק מוכן כעת להכנסתו ל- TEM.
    הערה: למחזיק הנבחר אין יכולות קירור והוא אינו משמש ל-cryo-EM.

2. ייצור מכלולי כריך שבב

הערה: ניתן להשתמש בשבבי SiN או צורן דו-חמצני (SiO) שונים ישירות מחבילות הג'ל שנשלחו. רשתות זהב מצופות פחמן עשויות לשמש גם ישירות כפי שסופקו.

  1. פלזמה לנקות את שבבים ורשתות פחמן באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים של 30 W, 15 mA עבור 45 שניות באמצעות גז ארגון.
  2. הוסף ~ 2 μL של דגימה הכלולה 50 mM HEPES, pH 7.5; 150 מ"מ NaCl; 10 מ"מ MgCl2; 10 mM CaCl2 לשבב משוחרר זוהר המונח על חבילת ג'ל. הסר תמיסה עודפת (~ 50%) באמצעות נייר סינון או פיפטה. לאחר שלב דגירה של 1-2 דקות, הוסיפו את רשת הפחמן הזוהרת לשבב הרטוב המכיל את הדגימה.
  3. הידק את המכלול יחד באמצעות מחזיק דגימה בעל הטיה אחת או קליפסים לרשת autoloader בטמפרטורת החדר כדי ליצור מארז אטום הרמטית. עבור מהדקי הטעינה האוטומטית, הנח את מכלול הכריך על תפס C התחתון, הנח את התפס העליון על גבי ההרכבה והשתמש בכלי ההידוק הסטנדרטי כדי לאטום את ההרכבה יחד.
    הערה: הליך ההידוק המבוצע כאן משתמש באותם שלבים כמו עבור הידוק רשת cryo-EM, אך בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן דגימות מהודקות במשך חודשיים או יותר לפני ההדמיה תוך שמירה על נוזלים במארז. לא נעשה שימוש בבדיקת דליפה עם מחזיק דגימה בטמפרטורת החדר או עם המטען האוטומטי.
  4. הדגימה מוכנה כעת להחדרה ל- TEM. בדוק דגימות המונחות במטעינים אוטומטיים בתנאי קריו או בטמפרטורת החדר.

3. הדמיית דגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעביר

  1. הדמיית נוזל-EM
    1. טען את מחזיק הדגימה ל- TEM המצויד באקדח פליטת שדה (FEG) ופועל ב- 200 kV.
    2. הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הנדנדה, הטיית הדגימה מ -15° ל +15° בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון Z כדי להתאים לעובי הדגימה. ומסייע להבטיח הגדלה מדויקת במהלך הקלטת התמונה.
    3. הקלט תמונות כסרטים בעלי מסגרת ארוכה באמצעות חבילת in situ המשולבת עם גלאי ישיר בעל מרווח פיקסלים של 6 מיקרומטר (וידאו 1 ווידאו 2). ניתן גם להקליט תמונות בודדות באמצעות חבילת התוכנה הטורית לאיסוף נתונים20, המיישמת שגרות הדמיה אוטומטיות. קבל תמונות בתנאים של מינון נמוך בהגדלה הנעה בין 28,000x-92,000x ו- 40 פריימים לשנייה.
    4. התאם את זמני החשיפה (0.25-1 שניות) כדי למזער את הנזק לקרן הדגימה. השתמש בטווח הפחתה של -1-4 מיקרומטר בהגדלה שצוינה. אם נתקלת בתמיסה עבה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר או בחר אזור עניין אחר.
    5. ודא שהתמיסה נמצאת בדגימות לאורך כל סשן ההדמיה על-ידי מיקוד קרן האלקטרונים באזור קורבן שאינו משמש לאיסוף נתונים, עד ליצירת בועות (איור משלים 1).
  2. הדמיית Cryo-EM
    1. טען את רשתות ה- EM החתוכות או כריכי השבב ל- TEM המצוידים ב- FEG ופועלים ב- 300 kV. הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ, באמצעות הליך דומה שתואר עבור הנוזל-TEM לעיל (שלב 3.1.2).
    2. הקלט תמונות בודדות באמצעות מערכת ניתוח חלקיקים בודדים המשולבת במערכת המיקרוסקופים תוך יישום שגרות הדמיה אוטומטיות. הקלט תמונות בתנאים של מינון נמוך באמצעות גלאי אלקטרונים ישיר לניתוח חלקיקים בודדים, בעל מרווח פיקסלים של 14 מיקרומטר בהגדלה של 59,000x ו-40 פריימים לשנייה.
    3. השתמש בטווח הפחתה של 1-4 מיקרומטר בהגדלה שצוינה. אם נתקלות בשכבות עבות של קרח זגוגי, השתמש בערכי הפחתה גבוהים יותר, או בחר אזור אחר לאיסוף נתונים.

4. ניתוח נתונים והשוואות מבנים תלת ממדיות

  1. ניתוח של נגיף הקשור לאדנו (AAV) בקרח נוזלי וזגוגי
    1. עבד סרטים עבור חלקיקי AAV בנוזל וקרח באמצעות תוכנית RELION-3.0821 או תוכנת עיבוד תמונה אחרת22. בצע תיקון תנועה באמצעות MotionCor2 v1.2.3.
    2. לאחר התיקון, חלץ חלקיקים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית בחבילת התוכנה של התוכנית. גדלים אופייניים של קופסאות הם 330 פיקסלים לדגימות נוזליות ו-350 פיקסלים לדגימות קרח.
    3. חשב שחזורים ראשוניים באמצעות סימטריית C1 באמצעות שגרת המודל הראשוני התלת-ממדי של התוכנה ו/או אפשרויות מודל ab-initio בחבילת התוכנה לעיבוד נתונים. בתוכנית, השתמש בפרמטר רגולציית של T = 4 ובגודל פיקסל של 1.01 Å עבור דגימות נוזליות ו- 1.13 Å עבור דגימות קרח.
    4. השתמש בערך מסיכה של 300 Å לאורך כל הליכי העידון. בצע פרוטוקולי עידון בתוכנת עיבוד הנתונים באמצעות סימטריית I1 כדי לקבל מפות EM מרובות. הרזולוציה המבנית הצפויה עשויה להיות בטווח של 4 Å ומעלה. השתמש בשקילות חלקיקים המיישמת סימטריה איקוסהדרלית ב-16,800 עבור נוזל ו-15,240 עבור קרח12,14.
      הערה: אומדני הרזולוציה מבוססים על הקריטריונים של מתאם מעטפת פורייה (FSC) בתקן הזהב.
    5. להסוות מפות EM ב~250 Å ולבחון את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה לניתוח מבנה מולקולרי23,24. באיור 3, פרוסות מוצגות במרווחים של ~5 ננומטר.
    6. חלץ יחידות משנה של חלבון קפסיד (VP1) ממפות EM לצורך השוואה. כמת שינויים דינמיים בין מבני EM בהתבסס על מדידות קוטר החלקיקים (איור משלים 2), ולאחר מכן הצג באופן חזותי באמצעות פונקציית המפה 'שינוי צורה' בתוכנה.
  2. ניתוח של מכלולים תת-ויראליים של SARS-CoV-2 בנוזל
    1. עבד סרטים באמצעות התוכנית RELION-3.08. נכון להיסחפות תמונה ולתנועה הנגרמת על-ידי קרן באמצעות MotionCor2 v1.2.3. נכון עבור פונקציית העברת הניגודיות (CTF) של המיקרוסקופ.
    2. השתמש בכלי הבחירה האוטומטי בתוכנית כדי לבחור מכלולים ויראליים בגודל קופסה של 800 פיקסלים. ליעילות חישובית, ניתן לשנות את קנה המידה של חלקיקים שחולצו ל-256 פיקסלים. השג מודל ראשוני באמצעות סימטריה C1 בתוכנית עם פרמטר רגולריזציה של T = 2 וגודל פיקסל 1.66 Å.
    3. בצע חידוד תלת-ממדי בתוכנית כדי לקבל מפת EM, דוגמה מוצגת ב~8.25 Å בהתאם לקריטריונים סטנדרטיים של FSC (איור 4). דמיינו מפות EM באמצעות תוכנת ניתוח המבנה המולקולרי עם פרוסות בנפח של 25 ננומטר, כפי שמודגם באיור 4.
  3. ניתוח של חלקיקים דו-שכבתיים (DLPs) של נגיף הרוטה בקרח הזגוגי
    1. עבד סרטים עבור DLPs rotavirus באמצעות תוכנות עיבוד תמונה אחרות. השתמש ב- MotionCor2 v1.2.3 כדי לתקן את הסחף בתמונות. השתמש בהערכת CTF של תיקון כדי לתקן את השפעות העדשה על התמונות.
    2. חלץ חלקיקים באמצעות כלי הקטיף האוטומטי בתוכנה בגודל קופסה של 950 פיקסלים. הפחת את גודל הקופסה לפי הצורך למטרות מחשוב.
    3. חשב מודלים ראשוניים באמצעות אפשרויות ab-initio וסימטריית C1. השתמש בפרמטרים של עידון, כולל גודל פיקסלים של 1.47 Å וערך מסיכה של 800 Å.
    4. בצע שגרות חידוד נוספות תוך כפיית סימטריה I1. תוצאות לדוגמה כוללות מפה של 10.15 Å EM, בהתאם לקריטריונים של FSC בתקן הזהב. סך כל החלקיקים שבהם נעשה שימוש היה 2050, שווה ערך ל-123,000 יחידות פרוטומר הודות לאופרטור הסימטריה האיקוסהדרלית (איור 5).
    5. מסווה מפות סופיות ב~750 Å והצג באופן חזותי תוצאות בחבילת התוכנה לניתוח מבנה מולקולרי. פרוסות לדוגמה דרך מפת EM מוצגות באיור 5 במרווחים של ~10 ננומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוזל-TEM הפועל ב-200 קילו-וולט שימש לכל ניסויי ההדמיה של נוזל-EM וקריו-TEM הפועל ב-300 קילו-וולט שימש לכל איסוף הנתונים של cryo-EM. תמונות מייצגות ומבנים של וירוסים מרובים מוצגים כדי להדגים את התועלת של השיטות על פני נבדקים שונים. אלה כוללים תת-סוג נגיף רקומביננטי הקשור לאדנו 3 (AAV), מכלולים תת-נגיפיים של SARS-CoV-2 שמקורם בסרום החולה, וחלקיקים דו-שכבתיים דו-שכבתיים של simian rotavirus (DLPs), זן SA11. ראשית, השוואות מודגמות עבור אותה דגימת AAV (1 מ"ג/מ"ל) שצולמה בתמיסת חיץ נוזלי (50 mM HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדמנויות חדשות מוצגות כדי לייעל את זרימות העבודה הנוכחיות של Liquid-EM על-ידי שימוש בכלים וטכנולוגיות אוטומטיים חדשים המותאמים מתחום cryo-EM. יישומים הכרוכים בטכניקת כריך השבב החדשה הם משמעותיים ביחס לשיטות אחרות מכיוון שהם מאפשרים ניתוח הדמיה ברזולוציה גבוהה בקרח נוזלי או זגוגי. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא ייצור דגימות עם עובי הנוזל האידיאלי כדי לדמיין פרטים מעודנים ברמה הננומטרית. אזורי עניין אידיאליים מזוהים בהגדלה נמוכה יותר על-ידי סינון המדגם כולו לפני יישום שגרות תפוקה גבוהה לאיסוף נתונים אוטומטי. אם ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. המחברת, מדליין ג'יי דרסל-דוקס, היא עובדת של פרוטוצ'יפס בע"מ ומייקל ספילמן הוא עובד של DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר לוק ה. ונדנברגה (בית הספר לרפואה של הרווארד, המחלקה לרפואת עיניים) על אספקת AAV-3 מטוהר. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והמכון הלאומי לסרטן (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 עד D.F.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אצטוןפישר סיינטיפיק  A11-11 ליטר
כלי חיתוך טוען אוטומטיThermoFisher ScientificN / Aגם ספק SubAngstrom
תפסי רשת טוען אוטומטיThermoFisher ScientificN/Aקליפסים עליונים ותחתונים
רשתות EM זהב מצופה פחמןElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50400 רשת, עובי 5 ננומטר
סרום חולים COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 מיקרוליטר סרום PCR+
מתנולפישר סיינטיפיק  A412-11 ליטר
Microwell-integrad שבביםProtochips, Inc.EPB-42A1-10מערכי חלונות 10x10 מ"מ שבבים
TEMWindowsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 חלונות גדולים, שבבי
TEMWindowsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 חלונות קטנים, בעובי 5 ננומטר
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W500 מ"מ x 100 מ"מ חלון
Whatman #1 נייר סינוןWhatman1001 090100 חתיכות, 90 מ"מ
<חזק>ציוד 
DirectView גלאי אלקטרונים ישיראלקטרוןישיר מרווח פיקסלים 6 מיקרון
Falcon 3 EC גלאי אלקטרונים ישירThermoFisher Scientificמרווח פיקסלים 14 מיקרון
תחנת משאבה יבשהGatan, Inc.  קצה מחזיק משאבה ל-10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher יחידתהכנת דגימות מדעית
PELCO easiGlow, יחידת פריקת זוהרטד פלה, בע"מ  מצב קוטביות שלילית
מחזיק דגימה Poseidon SelectProtochips, Inc.  תואם FEI; מחזיק דגימה
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 קילו וולט; נוזל-TEM
טיטאן קריוס G3ThermoFisher Scientific300 קילו וולט; Cryo-TEM
תוכנה זמינה בחינםאתר קישורהערות (אופציונלי)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/תוכנות עיבוד תמונה אחרות
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF מציאת תוכנית
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/חבילת תוכנה לניתוח מבנה מולקולרי
בעובי 10-nn מתקדמת https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes