הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

5.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63870

⸱

12 ביולי 2022

 , 
1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

תקציר

דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא מולקולת דנ"א תוך-מיטוכונדריאלית קטנה, מעגלית, דו-גדילית, המקודדת 13 תת-יחידות של שרשרת הובלת האלקטרונים. שלא כמו הגנום הגרעיני הדיפלואידי, רוב התאים מכילים הרבה יותר עותקים של mtDNA, החל מפחות מ-100 ועד למעלה מ-200,000 עותקים, תלוי בסוג התא. מספר עותק MtDNA משמש יותר ויותר כסמן ביולוגי למספר מצבים ניווניים ומחלות הקשורות לגיל, ולכן, מדידה מדויקת של מספר עותק mtDNA הופכת לכלי מרכזי הן במסגרות מחקר והן בהגדרות אבחון. מוטציות ב-mtDNA, המתרחשות לעתים קרובות כפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) או כמחיקות, יכולות להתקיים בכל העותקים של ה-mtDNA בתוך התא (המכונה הומופלסמיות) או כתערובת של עותקי mtDNA שעברו מוטציה ו-WT (המכונים הטרופלזמה). מוטציות mtDNA הטרופלזמיות הן הגורם העיקרי לפתולוגיה מיטוכונדריאלית קלינית, בין אם במחלות נדירות או במספר גדל והולך של מחלות נפוצות מאוחרות כגון מחלת פרקינסון. קביעת רמת ההטרופלזמה הקיימת בתאים היא שלב קריטי באבחון מחלות מיטוכונדריאליות נדירות ובמחקר שמטרתו להבין הפרעות נפוצות מאוחרות שבהן המיטוכונדריה עשויה לשחק תפקיד. מספר עותק MtDNA והטרופלזמה נמדדו באופן מסורתי על ידי בדיקות כמותיות (q)מבוססות PCR או ריצוף עמוק. עם זאת, ההקדמה האחרונה של טכנולוגיית ddPCR סיפקה שיטה חלופית למדידת שני הפרמטרים. הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות קיימות, כולל היכולת למדוד מספר עותק mtDNA מוחלט ורגישות מספקת כדי לבצע מדידות מדויקות מתאים בודדים גם במספרי העתקה נמוכים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המתאר את המדידה של מספר עותק mtDNA בתאים בודדים באמצעות ddPCR, המכונה ייצור טיפות PCR מעתה ואילך, עם אפשרות למדידה בו זמנית של הטרופלזמה בתאים עם מחיקות mtDNA. כמו כן נדונה האפשרות להרחיב שיטה זו למדידת הטרופלזמה בתאים עם SNPs mtDNA.

מבוא

דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא גנום דנ"א מעגלי קטן (כ-16.5 קילובייט) השוכן במטריצה המיטוכונדריאלית המקודדת 37 גנים, הכוללים שני rRNA, 22 tRNA ו-13 גנים המקודדים חלבונים1. בניגוד לגנום הגרעיני, המכיל עותק אחד (הפלואידי) או שניים (דיפלואידים) של כל גן לכל תא, mtDNA נמצא במספר עותקים במיטוכונדריה של כל תא, החל מעשרות עותקים (למשל, זרעונים בוגרים) ועד מאות אלפי עותקים (למשל, ביציות)2,3. תוצאה של ריבוי עותקים זה היא שמוטציות בגנום mtDNA, שעשויות להתקיים כפולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים (SNPs), מחיקות או כפילויות, יכולות להימצא ברמות משתנות בכל תא נתון, ולהוות בין 0% ל-100% מכלל אוכלוסיית ה-mtDNA של התא. קיומם של גנומים mtDNA מסוג בר ומוטנטי באותו תא נקרא הטרופלזמה, ומוטציות mtDNA הטרופלסמיות פתוגניות הן הגורם העיקרי למחלות מיטוכונדריאליות, עם מספר תסמונות נוירולוגיות נפוצות הקשורות למוטציות mtDNA הטרופלזמיות בסיסיות4.

שני פרמטרים מרכזיים התורמים לסבירות של מוטציית mtDNA הטרופלסמית הגורמת למחלה קלינית הם רמת ההטרופלזמה ומספר עותק mtDNA. מוטציות הטרופלזמיות רבות מציגות אפקט סף, כאשר הפנוטיפים הביוכימיים והקליניים מתגלים רק מעל רמה הטרופלסטית מסוימת, בדרך כלל סביב 80%5, ולאחר מכן מחמירים ככל שההטרופלסמיות עולה עוד4. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון את מספר העותקים של mtDNA הנמצאים בתא, שכן הדבר ישפיע על מספר הגנומים מסוג mtDNA פראי (כלומר, 'בריאים') הנמצאים ברמה הטרופלסטית נתונה. מחקרים בחולים במחלות מיטוכונדריאליות הדגישו את החשיבות של יחסי הגומלין האלה בין הטרופלזמה לעותק מספר5,6, ו- Filograna et al. דיווחו לאחרונה על עלייה במספר עותקי mtDNA המקלים על הסימפטומים למרות הטרופלזמה ללא שינוי במודל עכבר של מחלת המיטוכונדריה7.

בעוד שנעשה הרבה בשנים האחרונות כדי לשפר את ההבנה של פתוגנזה והעברה של מחלות הנגרמות על ידי הטרופלזמה mtDNA, רוב העבודה הזו נעשתה ברמה של רקמות ולא תאים, השוואת רמות הטרופלסמיות ממוצעות של רקמות ומדידות מספר עותקים שנרכשו מביופסיות רקמה בתפזורת ודגימות דם. כמה טכניקות מבוססות היטב, כגון מיקרודיסקציה של לכידת לייזר, מאפשרות מדידות כאלה ברמה התאית 8,9; עם זאת, ההתפוצצות האחרונה של שיטות ניתוח חד-תאיות בתפוקה גבוהה, או מה שמכונה "אומיקס חד-תאי"10, יצרה דרישה לשיטות שיכולות למדוד במדויק את הפרמטרים החיוניים האלה של mtDNA ברמת התא הבודד.

שיטת ה-PCR לייצור טיפות מנצלת את ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה המיקרופלואידית כדי לשפר את השיטות הקיימות לכמויות ריכוזי דנ"א לא ידועים באמצעות הגברת PCR של אמפליקוני מטרה ספציפיים בדגימת DNA11. בניגוד ל-qPCR, שבו הדנ"א של הדגימה מוגבר בתגובה אחת, כאשר הקצב היחסי של הצטברות תוצר ה-PCR משמש כקריאה, שיטה זו מפצלת את הדגימה הראשונית לאלפי טיפות בודדות, ובכך ממדלת את מולקולות הדנ"א של הדגימה לתגובות נפרדות מרחבית12. תגובת ה-PCR הבאה ממשיכה בכל טיפה בנפרד, כאשר מוצר ה-PCR מצטבר רק בטיפות המכילות את דנ"א המטרה. התוצאה של תגובה זו היא פלט דיגיטלי בצורת מאגר של טיפות המכילות עותק של דנ"א המטרה ותוצר PCR מוגבר, או שאינן מכילות דנ"א מטרה. באמצעות בדיקות דנ"א פלואורסצנטיות או צבע קושר דנ"א דו-גדילי (ds), ניתן לספור את הטיפות המכילות תוצר מוגבר, וניתן להשתמש ביחס בין טיפות 'חיוביות' ל'שליליות' כדי לחשב את המספר המוחלט של עותקי הדנ"א שהיו נוכחים בדגימה הראשונית. מדידה מוחלטת זו, בניגוד למדידה היחסית המתקבלת מתגובת qPCR, היא גורם המפתח המאפשר שימוש במתודולוגיה זו למדידה מדויקת של מספר עותק mtDNA והטרופלזמה בתאים בודדים11, ומספר מחקרים אחרונים כבר השתמשו בטכנולוגיית PCR לייצור טיפות למטרה זו13,14 . מאמר זה מציג שיטה למדידת מספר עותק mtDNA והטרופלזמה למחיקה בתאים בודדים מרקמות אנושיות ועכבריות כאחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE ואושרו על ידי גוף הביקורת האתית לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג' (AWERB).

הערה: כל שלבי ההכנה לדוגמה לפני יצירת הטיפות חייבים להתבצע באזור עבודה נקי לפני PCR, באופן אידיאלי בארון מעוקר UV במידת האפשר. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בציוד PCR ספציפי לייצור טיפות (ראה טבלת חומרים), ובעוד שהשיטה הכללית צריכה להיות ישימה למערכות אחרות, מומלץ לעיין בהנחיות היצרן לגבי ריכוזי פריימר/בדיקה, תנאי מחזור PCR וכו', שכן הם עשויים להיות שונים מאלו שתוארו כאן. קווי תאים/תאים ראשוניים ששימשו במחקר זה היו כדלקמן: תאי HeLa אנושיים (שהושגו באופן מסחרי), תאי HEK 293T אנושיים (שהושגו באופן מסחרי), תאי פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים (התקבלו מהביובנק של ניוקאסל), cybrids אנושיים (WT & ΔH2.1 מחיקה15, שהתקבלו מ- C. Moraes, אוניברסיטת מיאמי), פיברובלסטים עובריים של עכברים (מונצחים, מעכברים C57Bl/6, שהתקבלו מג'יי סטיוארט, אוניברסיטת ניוקאסל), תאי נבט קדמוניים של עכברים (שהתקבלו מעוברי עכברים C57Bl/6), וביציות MII של עכברים (התקבלו מנקבות בוגרות C57Bl/6 עכברים). כל התאים שגודלו בתרבית נשמרו ב-DMEM של גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) בתוספת 10% סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. תאי עכבר ראשוניים ששימשו במחקר זה בודדו מבעלי חיים שהוחזקו על פי חוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) 1986 תחת רישיון פרויקט משרד הפנים P6C97520A.

1. תכנון וסינתזה של פריימר וערכות בדיקה המכוונות לרצפי DNA בעלי עניין

הערה: ניתן לבצע PCR של ייצור טיפות גם באמצעות צבע קשירה dsDNA במקום הגששים הספציפיים למגבר.

  1. תכנן את רצפי הפריימר והבדיקה בהתאם להנחיות שניתנו על ידי יצרן המערכת. רצפי פריימר ובדיקה מאומתים המתאימים למדידת מספר העתק/מחיקה של mtDNA חד-תאי הן בתאי 16,17 אנושיים והן בתאיעכבר 18 מסופקים בטבלה 1. בעת בחירת רצפי יעד חלופיים, שקול את הנקודות הבאות.
    1. הכפילו שתי ערכות פריימר/בדיקה בבדיקת PCR אחת, אך ודאו ששתי הבדיקות משתמשות בגשושית אחת המסומנת ב-FAM ובבדיקה אחת המסומנת ב-HEX, כך שניתן יהיה להבחין בין אמפליקוני המטרה על ידי קורא הטיפות. פרוטוקול זה מציג בדיקת בדיקה דו-צדדית. עם תכנון ניסויי זהיר, ניתן להגדיל את הריבוב עד ארבעה יעדים, ופלטפורמות חלופיות יכולות להשיג ריבוב בממדים גבוהים יותר.
    2. בעת ריבוב קבוצות פריימרים/בדיקות המכוונות לרצפי mtDNA נפרדים, ודא שהאמפליקונים הנוצרים על-ידי שתי קבוצות הפריימרים אינם חופפים.
    3. בעת מדידת הטרופלזמה בדגימות הנושאות מחיקות mtDNA, ודא שאמפליקון מטרה אחד נופל בתוך האזור הצפוי שנמחק והשני נופל מחוץ לאזור המחיקה הצפוי.
      הערה: תנאי מחזור PCR אופטימליים עבור מבחנים חלופיים עשויים להיות שונים מאלה המצוטטים בשלב 5.1; עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים על אופטימיזציה של הבדיקה.

2. בידוד של DNA מתאים בודדים

הערה: ניתן להשתמש בשיטה זו גם עבור דגימות קטנות בתפזורת של עד 100 תאים.

  1. אסוף תאים בודדים בשיטה מתאימה, כגון מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS)19 או לכידת מיקרו-דיסקציה20 בלייזר, בנפח קטן ככל האפשר לתוך כלי קיבול מתאים (לדוגמה, צלחת 96 בארות). שימוש בצבע כדאיות של תאים לפני או במהלך בידוד של תא בודד ימזער את הסבירות לבידוד תאים מתים. מיין את התאים הבודדים ישירות למאגר הליזיס אם תרצה בכך ואחסן בטמפרטורה של -80°C (עד 6 חודשים) לפני הניתוח.
  2. Lyse התאים בנפח קטן (<10 μL) של חיץ תזה מתאים (המאגר המשמש במחקר זה מתואר בשלב 2.2.1.).
    הערה: כל הנתונים שהתקבלו מתאים במחקר זה הם מליזאטים חד-תאיים או ממאגרים של 20 תאים (גודל המדגם נקבע במקראות האיורים). היווצרות יעילה של תחליב שמן/טיפות במהלך שלב ייצור הטיפות של פרוטוקול PCR לייצור טיפות יכולה להיות מושפעת באופן משמעותי מנוכחות חומרי ניקוי בדגימה; לכן, מומלץ לאמת את התאימות של כל מאגרי התזה התאית עם יצירת טיפות בריכוז הקלט המיועד לפני שתמשיך בדגימות ניסיוניות ותשתמש בנפח המעשי הקטן ביותר של מאגר תזה. פרוטוקול התזה הבא מביא להשפעה מינימלית על יעילות ייצור הטיפות.
    1. הכינו את חיץ התזה המכיל 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1% TWEEN-20 ו-200 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאינאז K.
    2. הוסף 2.5 μL של חיץ הליזיס לכל דגימה, אטם את הצלחת עם חותם צלחת דבק, ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות ב 1,000 x g במשך דקה אחת ב 4 °C.
    3. דגירה של הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על התרמוציקלר כשהמכסה המחומם מוגדר ב-105 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיבוי של נוזל על כיסוי הצלחת.
    4. הוסף 7.5 μL של מים ללא נוקלאז לכל דגימה כדי לקבל נפח דגימה סופי של 10 μL, אטם מחדש את הצלחת, ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימות ב 1,000 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (60 °F).
    5. דגירה על התרמוציקלר ב-80°C למשך 15 דקות (מכסה מחומם מוגדר ל-105°C) כדי להשבית את Proteinase K.
    6. צנטריפוגה את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשמור על קרח.
  3. המשך לשלב 3 להלן.
    הערה: ניתן לאחסן ליזטים של תאים בטמפרטורה של -20°C לפני המשך שלב 3; עם זאת, השתמשו בדנ"א טרי במידת האפשר כדי למנוע את הסיכון למחזורי הפשרה בהקפאה וכתוצאה מכך לפגיעה בדנ"א.

3. הכנת דוגמאות

הערה: ודא שמשכפלים טכניים של דוגמאות ופקדים שאינם תבניות (NTCs) כלולים בכל לוח בדיקה כדי להבטיח את דיוק התוצאות. הטווח הדינמי של בדיקת ה-PCR של דור הטיפות הוא עד 120,000 עותקים של אמפליקון המטרה לכל תגובה. עבור ליזטים של דגימת תאים בודדים או קטנים בתפזורת, לא סביר שיהיה צורך בדילול, וניתן להזין את תערובת הליזאט ישירות לתגובה למדידת מספר עותק mtDNA (לדוגמה, ניתן לפצל דגימת ליזאט של 10 μL ולהריץ אותה במשולש עם קלט של 3 μL ישירות לתוך כל בדיקה). עם זאת, שימוש בליזאט לא מדולל מתאים עם מספרי mtDNA גבוהים מאוד (למשל, ביציות) או המכיל מספר גדול יותר של תאים (למשל, 50-100) עשוי לחרוג מטווח דינמי זה. במקרים כאלה, נדרש דילול סדרתי ראשוני כדי לזהות מקדם דילול מתאים שימנע רוויה של הבדיקה עבור אותו סוג תא ספציפי /מספר תא (ראה תוצאות מייצגות לפרטים נוספים).

  1. הפשיר את כל הריאגנטים על קרח, מערבולת, והסתובב לזמן קצר לפני השימוש.
  2. הכינו את תערובת האב (בניכוי דנ"א לדוגמה) על קרח כמתואר ב-(טבלה 2).
    הערה: אם מודדים רק אמפליקון מטרה אחד, הוסיפו 2.55 מיקרוליטר נוספים של מים נטולי נוקלאז לכל דגימה כדי להשיג את הנפח הסופי של 22 μL. הכינו מספיק תערובת אב למספר הדגימות וה-NTCs שיש לנתח, בתוספת מספיק כדי לקחת בחשבון את כל הבארות ה'ריקות' הנדרשות על צלחת ה-PCR של ייצור הטיפות (ראו השלב הבא).
  3. מערבבים את תערובת המאסטר המוכנה לזמן קצר כדי לערבב ולאליקוט את הנפח הנדרש (22 μL פחות נפח DNA קלט) לתוך כל באר של צלחת PCR 96-well דור טיפות. סדרו את הדוגמאות בעמודות מלאות על צלחת 96 הבאר; מלא בארות ריקות בעמודות לא שלמות עם תערובת אב והשתמש בהן כ- NTCs.
  4. הוסף את הדנ"א של הקלט לכל באר דגימה ומאגר מים/אלוציות ללא נוקלאז לבארות NTC כדי להביא את הנפח הכולל של כל אחת מהן עד 22 μL.
  5. אטמו את הצלחת עם חותם צלחת דבק והניחו על שייקר ב-2,000 סל"ד למשך דקה אחת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. מניחים את הצלחת על קרח וממשיכים לשלב 4.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות מוכנות על קרח ולהגן עליהן מפני אור לפרקי זמן קצרים (למשל, 1-2 שעות) לפני שממשיכים ביצירת טיפות.

4. יצירת טיפות

הערה: עיין באיור 1A עבור הסכימה של סיפון המכשירים של מחולל הטיפות המוזכר בסעיף זה.

  1. הפעל את מחולל הטיפות.
  2. בדוק שבקבוק של שמן מייצר טיפות נטען למיקום E של סיפון המכשיר. אם תתבקש, בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי להחליף את הבקבוק.
  3. לחץ על קביעת תצורה של לוח לדוגמה במסך המגע. בחר את כל העמודות בלוח הדגימה המכילות דוגמאות/ריקים.
    הערה: הזנת שם הלוחית ופרטי הניסוי בשלב זה היא אופציונלית ואינה נדרשת כדי להמשיך בהגדרת הניסוי.
  4. לחץ על אישור כדי לאשר את תצורת הצלחת; אורות כתומים יאירו על סיפון המכשיר כדי לציין מיקומים שבהם יש לטעון חומרים מתכלים.
  5. טען את מחסניות מחולל הטיפות כדי למקם את B על סיפון המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים.
  6. הניחו שוקת פסולת קצה ריקה למצב C על סיפון המכשיר.
  7. הסר את המכסים מתיבות קצה המסנן וטען כדי למקם את D על במת המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים.
  8. הסר את חותם לוח ההדבקה מצלחת הדגימה וטען למיקום F של סיפון המכשיר כך שהאור יהפוך לירוק.
  9. מניחים צלחת 96-well של אוסף טיפות ריקות לתוך בלוק קריר (מקורר מראש ב-20°C-) וטוענים למיקום G של סיפון המכשיר כך שהאור יהפוך לירוק.
  10. לחץ על התחל יצירת טיפות במסך המגע של המכשיר.
  11. לחץ על התחל הפעלה במסך המגע של המכשיר. מכסה המכשיר ייסגר באופן אוטומטי. לאחר האתחול, הזמן שנותר עד להשלמת יצירת הטיפות יוצג על מסך המגע של המכשיר.
  12. לאחר השלמת יצירת הטיפות, בדקו את צלחת איסוף הדגימות באופן חזותי כדי לוודא ששכבת תחליב טיפות נמצאת מעל שלב השמן בכל באר (איור 1B).
    הערה: אם שכבת תחליב טיפות אינה נראית לעין, אל תמשיך הלאה עם הניסוי ובדוק אם אירעו שגיאות שייתכן שאירעו במהלך השלבים הקודמים של הפרוטוקול.
  13. נקו את החומרים המתכלים המשומשים מסיפון המכשירים ורוקנו את שוקת פסולת הקצה.
  14. הפעילו את איטום הצלחת, הגדירו את הטמפרטורה ל-180°C ואת זמן האיטום ל-5 שניות, ואפשרו למכשיר להגיע לטמפרטורת ההפעלה.
  15. הכניסו את צלחת איסוף הדגימות למחזיק צלחת האיטום של הצלחת והניחו חותם נייר כסף טרי על גבי הצלחת כשהקו האדום פונה כלפי מעלה. היזהרו לא לגעת בחלק התחתון של חותם נייר הכסף.
    הערה: יש לאחסן את מחזיק הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) ולהכניסו למגירת איטום הצלחת רק כאשר מופעל חותם רדיד אלומיניום כדי למנוע מעבר חום לצלחת איסוף הדגימה.
  16. כאשר איטום הלוחות הגיע לטמפרטורת הפעלה, לחץ על הוצא במסך המגע של המכשיר; המגירה תיפתח באופן אוטומטי.
  17. הכניסו את מחזיק הצלחות למגירת איטום הצלחות ולחצו על Seal. המגירה תיסגר אוטומטית ולאחר מכן תיפתח שוב לאחר סיום האיטום.
  18. החלף את הצלחת האטומה בבלוק הקר, כבה את איטום הצלחת והמשך מיד לשלב 5.
    הערה: בשלב זה, הטיפות אינן יציבות, לכן יש לוודא ששלב ה-PCR מתחיל תוך שעה אחת מרגע סיום יצירת הטיפות.

5. פי.סי.אר

  1. הניחו את צלחת איסוף הטיפות האטומה על גבי רוכב PCR המצויד בבלוק באר בעומק 96 והפעילו את פרוטוקול המחזור התרמי המתואר בטבלה 3.
    הערה: הגדר את טמפרטורת המכסה המחומם ל-105 °C ואת נפח הדגימה ל-40 μL. שלבי הדנטורציה והחישול/הארכה חייבים לכלול קצב עליית טמפרטורה של 2 °C/s כדי להבטיח שלשמן יהיה זמן לשיווי משקל לטמפרטורה הנכונה.
  2. המשך לשלב 6.
    הערה: לאחר השלמת פרוטוקול המחזור התרמי, הטיפות יציבות יותר, וניתן לאחסן את הצלחת עד 4 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלב הבא.

6. קריאת טיפות

  1. הפעל את קורא הטיפות ואת המחשב המחובר.
  2. בדוק את רמות הנוזלים בבקבוקי הפסולת של קורא הטיפות וקורא הטיפות ומלא/רוקן אותם, בהתאמה, במידת הצורך.
  3. טען את הלוחית המכילה את דגימות ה- post-PCR לתוך מחזיק צלחת קורא הטיפות, הנח את הכיסוי על גבי המחזיק והצמיד אותו למקומו באמצעות מהדקי הנעילה השחורים. אין להסיר את מכסה נייר הכסף מצלחת הדגימה.
  4. לחץ על לחצן פתיחה/סגירה במכסה של קורא הטיפות כדי לפתוח אותו.
  5. טען את מחזיק לוח קורא הטיפות המכיל את לוח הדגימה לתוך תא הקורא ואתר אותו היטב על הבסיס המגנטי.
  6. לחץ על הלחצן פתח/סגור במכסה של קורא הטיפות כדי לסגור אותו.
  7. פתח את ממשק תוכנת הניתוח, בחר בכרטיסייה הוסף צלחת והכן צלחת דגימה חדשה באופן הבא:
    1. לחץ על הוסף צלחת ולאחר מכן על קביעת תצורה של צלחת.
    2. בכרטיסייה 'נתוני לוחית', הזינו שם לוחית, בחרו Supermix לבדיקות (ללא dUTP) מהתפריט הנפתח Supermix והזינו שם קובץ תחת ' שמור קובץ נתונים בשם'.
    3. בכרטיסיה בחירת בארות סמן את הבארות שיש לנתח ולחץ על כלול בארות נבחרות.
      הערה: שלבים 6.7.4 – 6.7.7 הם אופציונליים.
    4. בכרטיסייה באר מידע , בחר את הבארות שיש להוסיף להן ביאורים.
      הערה: עיין באיור 1D לקבלת דוגמה לממשק הכרטיסיה ' מידע טוב' .
    5. בחר כימות ישיר (DQ) מהתפריט הנפתח סוג ניסוי , אכלס את התיבות תיאור דוגמה, סוג דגימה ושם יעד והוסף הערות באר ו/או הערות צלחת לפי הצורך.
    6. לחץ על החל. המידע בשדות יוחל על הבארות שנבחרו.
    7. חזור על שלבים 6.7.4-6.7.6 עד שכל בארות הדגימה יוערו.
  8. לאחר השלמת תצורת הצלחת, לחץ על התחל הפעלה.
  9. בסיום הריצה, יש להשליך את צלחת הדגימה הריקה ולרוקן את בקבוק הפסולת של קורא הטיפות במידת הצורך.
  10. המשך לשלב 7.

7. ניתוח התוצאות

הערה: קורא הטיפות מודד את עוצמת הפלואורסצנטיות בערוץ FAM ו-HEX עבור כל טיפה בדגימה. בבדיקה מוצלחת, טיפות מתחלקות לאחת משתי קטגוריות עבור כל בדיקה: שלילית (כלומר המטרה לא הייתה נוכחת בטיפה) או חיובית (כלומר המטרה הייתה נוכחת בטיפה). לפני ניתוח הדגימות, ודא שכל באר מכילה >10,000 טיפות ויש לה שתי אוכלוסיות נפרדות בבירור של טיפות פלואורסצנטיות נמוכות (שליליות) וטיפות פלואורסצנטיות גבוהות (חיוביות) בכל ערוץ (איור 2A).

  1. בחר בכרטיסיה ניתוח נתונים ופתח את הקובץ לניתוח מתפריט קבצי הנתונים שלי .
  2. לחץ על הכרטיסיה משרעת 1D לניסויים בצבע יחיד או על הכרטיסיה משרעת דו-ממדית לניסויים בשני צבעים.
  3. החל סף פלואורסצנטי על כל ערוץ כדי להבדיל בין הטיפות החיוביות והשליליות. תוכנת הניתוח תנסה להחיל סף אוטומטי על בסיס מדגם אחר מדגם וערוץ אחר ערוץ, אך אם נראה שהדבר נכשל, או נראה לא מדויק, החל באופן ידני את הסף באופן הבא:
    1. בחר את הבארות הדורשות סף.
    2. החל ידנית את הסף במרחב הברור בין האוכלוסייה החיובית והשלילית במתווה המשרעת באמצעות הכלי מצב קו סף . בעת הגדרת ערכי סף ידניים בתצוגה דו-ממדית, ודא שהכוונת ממוקמת כך שארבע אוכלוסיות הטיפות (שלילי כפול, FAM חיובי יחיד, HEX חיובי יחיד וחיובי כפול) מופרדות בבירור.
      הערה: ניתן לבצע ספיגה היטב או להחיל אותה על מספר בארות בו-זמנית.
  4. לאחר החלת סף על כל הדוגמאות, ייצא את התוצאות כקובץ .csv לניתוח נוסף על ידי לחיצה על הכרטיסייה טבלת נתונים, לחיצה על ייבוא/ ייצוא ובחירה באפשרות ייצוא נתונים גלויים ל- CSV. הזן שם קובץ מתאים ולחץ על שמור.
  5. חשב את מספר עותק mtDNA בדגימה הראשונית באופן הבא:
    מספר העתקה = ריכוז יעד mtDNA × 22 × 1/שבריר מסך קלט ליזאט
    הערה: אם נעשה שימוש בשתי בדיקות מיטוכונדריאליות, הריכוז של שתי המטרות הוא ממוצע לפני ביצוע החישוב. עבור דגימות המכילות יותר מתא אחד, מספר ההעתקה לכל תא מחושב על-ידי חלוקה במספר התאים בדגימה. חשוב להשתמש בערך 'ריכוז' (כלומר, מספר עותקים למיקרוליטר) כפול נפח הדגימה הראשוני של 22 μL, ולא בערך 'עותקים לכל 20 μL' המחושב בקובץ .csv, שכן יש לקחת בחשבון את עותקי mtDNA שנותרו בעודף של 2 μL הנדרש על ידי מחולל הטיפות בעת חישוב מספר העותק המוחלט של הדגימה הראשונית.
  6. עבור תאים הנושאים מחיקות mtDNA הטרופלזמיות, חשב את מספר העותק באמצעות התוצאות מיעד mtDNA מחוץ לאזור שנמחק (כלומר, המטרה הקיימת הן במולקולות mtDNA שנמחקו והן במולקולות MTDNA WT). ההטרופלזמה של המחיקה מחושבת באמצעות ריכוזי היעד בתוך האזור שנמחק והיעד מחוץ לאזור שנמחק באופן הבא:
    figure-protocol-1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר יצירת הטיפות, ניתן לראות שכבה ברורה של טיפות אטומות מרחפת מעל שלב השמן בכל באר (איור 1B). היווצרות טיפות יכולה להיות מושפעת לרעה על ידי נוכחות של דטרגנטים בליזאט קלט בעת ביצוע ניסויים על תאים בודדים. באמצעות פרוטוקול התזה המתואר ב-2.1.2., תפוקות טיפות מעל הרמה המומלצת של 10,000 מושגות באופן שגרתי, למרות נוכחות של כמות שיורית קטנה של TWEEN-20 בדגימה הסופית (איור 1C). עם זאת, במאגרי תזה אחרים, כגון buffer RLT Plus, רואים ירידה דרמטית במספר הטיפות שנוצרו (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן ישים על פני מגוון רחב של סוגי תאים ומינים בנוסף לאלה שנדונו לעיל, אם כי אופטימיזציה זהירה של עיצובי בדיקה חדשים תהיה המפתח להבטיח שהדיוק והחזרתיות של השיטה נשמרים כאשר מתרחקים משילובי פריימר/בדיקה שאומתו בעבר. כאשר עובדים עם תאים בודדים, חיוני לוודא שאיסוף הדגימות מתבצע בצורה מדויקת ככל האפשר (למשל, שימוש בפרמטרים מחמירים של תא בודד בעת מיון תאים לפי FACS) כדי להבטיח שהתוצאות המתקבלות משקפות באמת את אלה של תאים בודדים, וכן שכל עבודת ההכנה מתבצעת באזור נקי לפני PCR כדי להפחית את הסיכון להתרחשות זיהום....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

תודה לד"ר ל. בוז'ילובה על הייעוץ לגבי הניתוח הסטטיסטי של נתוני PCR של דור טיפות. תודה לד"ר ה. ג'אנג על שסיפק את הביציות ששימשו להפקת נתונים באיור 3C ובאיור 4B. עבודה זו בוצעה על ידי SPB ביחידה לביולוגיה מיטוכונדריאלית של המועצה למחקר רפואי (MC_UU_00015/9), אוניברסיטת קיימברידג', ומומנה על ידי מלגת מחקר ראשית של Wellcome Trust המוחזקת על ידי PFC (212219/Z/18/Z).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת 50% Tween-20Novex3005
שמן אוטומטי לייצור טיפות Bio Rad1864110פורמולציה מסחרית של שמן המשמשת לייצור תחליב שמן/טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.1)
מכונת C1000 PCR עם בלוק באר עמוקBio Rad1851197תרמו-ציקלר PCR המצויד בבלוק חימום באר עמוקה, המשמש לליזה תאים (פרוטוקול שלב 2.1.2.) ורכיבה על אופניים PCR (פרוטוקול שלב 5)
בלוק קירור צלחת איסוףBio Rad12002819בלוק קירור השומר על דגימות מקוררות במהלך יצירת טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)
ddPCR צלחות 96 בארות Bio Rad1200192596 בארות צלחות קצות פיפט המיועדות לשימוש במחולל הטיפות QX200 AutoDG, המשמשות להכנת דגימה (פרוטוקול שלב 3.4) ואיסוף טיפות (פרוטוקול שלב 4.3)
שמן קורא טיפות ddPCR Bio Rad1863004פורמולציית שמן מסחרית המשמשת את קורא הטיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 6.1)
ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP)Bio Rad1863023סופר-מיקס מסחרי לשימוש בניסויי ddPCR תוך שימוש בבדיקות (בשימוש בפרוטוקול שלב 3.3)
DG32 מחסניות מחולל טיפות אוטומטיות Bio Rad1864108מחסניות מיקרופלואידיות המשמשות במחולל הטיפות QX200 AutoDG ליצירת תחליב שמן/טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)
סרום בקר עובריGibco10270-106סרום בקר עוברי מוסמך
כיסויי צלחות נייר כסף Bio Rad1814040כיסויי צלחות נייר כסף המשמשים לאיטום לוחות איסוף טיפות לאחר יצירת טיפות (בשימוש בשלב פרוטוקול 4.6)
תאי HEK 293TTakara632180תת-שיבוט מסחרי של קו תאי הכליה העובריים האנושיים שעברו טרנספורמציה, HEK 293, המבטא את תאי HeLa אנטיגן Large-T SV40
ECACC93021013תאי קרצינומה אפיתלואידים של צוואר הרחם האנושי
DMEMGibco133453644.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, עם L-גלוטמין ונתרן פירובט
סייברידים אנושייםשל עכבר אוניברסיטת מיאמי
 אוניברסיטת ניוקאסלהונצחה מעכברי
מים ללא נוקלאזAmbionAM9937
אטמי צלחת PCRPierceSP-0027אטמי צלחת דבק שקופים, בשימוש רק בייצור טרום טיפות (יש להשתמש באטם נייר כסף בשלב 4.6)
פחי פסולת קצה פיפטBio Rad1864125פח איסוף חד פעמי המשמש לאיסוף טיפות שהושלכו במחולל הטיפות QX200 AutoDG (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)
טיפים למערכת AutoDG Bio Rad1864120קצות פיפט מסוננים המיועדים לשימוש במחולל טיפות QX200 AutoDG (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)
תאי פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשונייםניוקאסל
IDTN / Aרצפי פריימר/בדיקה מדויקים יהיו תלויים בבדיקה. פריימרים ובדיקות ששימשו במחקר זה ניתנים בטבלה 1
תמיסת Proteinase K 20 מ"ג/מ"לAmbionAM2546
PX1 PCR אוטם צלחותBio Rad1814000מחיל אטמי נייר כסף על לוחות דגימת ddPCR לאחר יצירת טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.6)
תוכנת QX ManagerBio Rad12012172תוכנת הגדרה וניתוח של קורא טיפות (בשימוש בשלבים 6 ו-7 של פרוטוקול)
מחולל טיפות QX200 AutoDGBio Rad1864101מחולל טיפות מיקרופלואידי אוטומטי (בשימוש בפרוטוקול שלב 4)
קורא טיפות QX200קורא טיפות Bio Rad1864003(בשימוש בפרוטוקול שלב 6)
Trizma גבישים מוגדרים מראש pH 8.3SigmaT8943-100G
פיברובלסטים עובריים C57Bl/6 פריימרים/בדיקות ביובנק

מקורות

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
  3. D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
  6. Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146(2013).
  7. Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
  8. Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
  9. Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
  10. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  11. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).
  12. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  13. Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
  14. O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
  15. Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
  16. Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
  17. Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
  18. Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  20. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
  21. Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
  22. Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186(2016).
  23. Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
  24. Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
  25. Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
  26. Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
  27. Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
  28. Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
  29. Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).
  30. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  31. Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
  32. Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCRPCR
מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.