Method Article

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לפענח את המנגנונים המולקולריים המורכבים המווסתים את ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין, זהו נכס נהדר לניטור תגובות בודדות לחיות בתנאים מבוקרים היטב. כדי לעשות זאת, ניסויים חיים של נימה אחת הופיעו במהלך 20 השנים האחרונות, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), וסיפקו שפע של תוצאות מפתח. בשנת 2011, על מנת להרחיב עוד יותר את האפשרויות של ניסויים אלה וכדי למנוע ממצאים בעייתיים חוזרים ונשנים, הצגנו מיקרופלואידיקה פשוטה במבחנים אלה. מחקר זה מפרט את הפרוטוקול הבסיסי שלנו, שבו חוטי אקטין בודדים מעוגנים בקצה אחד למשטח הכיסוי הפסיווי, מתיישרים עם הזרימה, ויכולים להיחשף ברצף לתמיסות חלבון שונות. אנו גם מציגים את הפרוטוקולים עבור יישומים ספציפיים ומסבירים כיצד ניתן ליישם כוחות מכניים מבוקרים, הודות לגרירה הצמיגית של הפתרון הזורם. אנו מדגישים את האזהרות הטכניות של ניסויים אלה ומציגים בקצרה התפתחויות אפשריות המבוססות על טכניקה זו. פרוטוקולים והסברים אלה, יחד עם הזמינות של כיום של ציוד מיקרופלואידיקה קל לשימוש, אמורים לאפשר למי שאינם מומחים ליישם בדיקה זו במעבדותיהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההרכבה והפירוק של חוטי אקטין ורשתות חוטי אקטין נשלטים על ידי מספר תגובות ביוכימיות ותלויים בהקשר המכני. על מנת לקבל תובנה על מנגנונים מורכבים אלה, זה לא יסולא בפז כדי להיות מסוגל לצפות בתגובות בודדות על חוטים בודדים (במספרים גדולים מספיק). במהלך העשורים האחרונים, התצפית על חוטי אקטין דינמיים בזמן אמת, בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), התגלתה כטכניקה מרכזית וסיפקה רשימה מרשימה של תוצאות שלא ניתן היה להשיג באמצעות בדיקות ביוכימיות של תמיסה בתפזורת1.

כדי להשיג זאת, יש לשמור על חוטי אקטין בעלי תווית פלואורסצנטית קרוב לפני השטח של כיסוי המיקרוסקופ תוך חשיפתם לתמיסות של חלבונים קושרי אק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תא מיקרופלואידי

  1. בחר תבנית אב SU-8 עם מספר תבניות תא. תאים טיפוסיים הם בצורת צלב עם שלושה כניסות ושקע אחד, 20 מיקרומטר גובה ו-800 מיקרומטר רוחב (איור 1). תבניות מאסטר כאלה ניתן לרכוש מחברות חיצוניות או לעשות במעבדות אקדמיות (למשל, Gicquel, Y. et al.5).
  2. מניחים סרט הדבקה סביב קצה התבנית.
    1. שים כ 50 ס"מ אורך, 19 מ"מ רוחב, סרט משרדי שקוף סטנדרטי (ראה טבלת חומרים) על ספסל, צד דביק למעלה. מניחים את התבנית אנכית בקצה אחד ולאורך קו האמצע של הקלטת.
    2. מגלגלים את התבנית לקצה השני של הקלטת כדי ליצור גבול של 1 ס"מ סביב התבנית. קפלו מטה את הקלטת מעל תחתי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור כל הניסויים שתוארו לעיל, חוטי אקטין המסומנים באופן פלואורסצנטי צריכים להיות גלויים בבירור, עם ניגודיות טובה, המעידים על פלואורסצנציה נמוכה ברקע מפני השטח (איור 4, ראו קובץ משלים 1 לפתרון בעיות נפוצות). חוטי אקטין גם לא צריכים להיצמד לפני השטח: כאשר קצב הזרימה הדומיננטי נמוך, התנודות הצדדיות של חוטי האקטין צריכות להיות מורגשות כאשר מתבוננים בהם חיים ולאפשר לאדם לקבוע בבירור שהם מעוגנים על ידי אחד הקצוות שלהם בלבד. באופן דומה, בעת שימוש בהדמיית TIRF, התנודות האנכיות שלהם .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהשוואה לשיטות סטנדרטיות של נימה יחידה שבהן חוטי אקטין מעוגנים לפני השטח על ידי נקודות מרובות לאורכם או נשמרים קרוב אליו על ידי חומר צפיפות כגון מתילצלולוז, מיקרופלואידיקה מציעה מספר יתרונות. מכיוון שהאינטראקציות עם פני השטח הן מינימליות, נמנעות ההפסקות המלאכותיות שאינטראקציות אלה יכולות לגרום במהלך התארכות ודה-פולימריזציה. החוטים מיושרים על ידי הזרימה, מקבילים זה לזה, מקלים על ניטורם ומדידת אורכיהם. התמיסה סביב החוטים מתחדשת כל הזמן, וחושפת אותם לריכוזי חלבון קבועים. היכולת לעבור במהירות (<1 שניות, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לב' לאדו ולר'-מ'. מעבדת Mège לשימוש בציוד מנקה ה-UV שלהם, ו-J. Heuvingh ו-0. du Roure עבור האימון הראשוני שקיבלנו על הכנת תבניות על פרוסות סיליקון ומתן טיפים על microfluidics. אנו מכירים במימון מענק StG-679116 של מועצת המחקר האירופית (ל-A.J.) ומ-Agence Nationale de la Recherche מעניקים מוסקטין וקונפומין (ל-G.R.-L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&בטא;-קזאיןMerckC6905בשימוש באגרוף ביופסיה של 8 מ"ג/מ"ל
(עם בוכנה)Ted Pella15115-2ID 0.75 מ"מ, OD 1.07 מ"מ
ביוטין-BSAMerckA8549בשימוש ב-1 מ"ג/מ"ל
BSAMerckA8022בשימוש ב-50 מ"ג/מ"ל
Coverslip Mini-Rack
מחזיק טפלון		InvitrogenC14784ל-8 כיסויים
22x40 מ"מ
עובי #1.5		Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802רכיב ב-f-buffer
DTTEuromedexEU0006-Dב-f-buffer
Ester Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophore לתיוג אקטין ב-Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338לביוטינילט אקטין על Lys328
Hellmanex III Hellma9-307-011-4-507חומר ניקוי לניקוי זכוכית
ImageJNIHN /A תוכנת קוד פתוח
LaboportKNF811kn.18משאבת ואקום (ואקום אולטימטיבי: 240 mbar)
סרט קסם בלתי נראהסקוטש7100024666קלטת משרדית שקופה סטנדרטית
MicrewtubeSimportT341-6T2 מ"ל צינורות מאגר מיקרופלואידיים
מכשיר מיקרופלואידית חלק 1: יחידת זרימה SFluigentFLU-S-D-PCKBמד זרימה
מכשיר מיקרופלואידית חלק 2: Fluiwell-4C-2 מ"לFluigent14002001PCKמחזיק מאגר
מכשיר מיקרופלואידית חלק 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		בקר לחץ
דגם 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220מנקה אולטרה סגול
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO המשמש לתיוג אקטין
נויטראוודיןThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)לשימוש ב-1 מ"ג/מ"ל ב-PBS.
פולידימתילסילוקסן (PDMS) סילגארד 184 סיליקון אלסטומרדאו קורנינג1673921מכיל בסיס PDMS וחומר ריפוי
צינורות Polyetheretherketone (PEEK)MerckZ226661" כחול" תעודת זהות = 0.25 מ"מ
אקדח מכה בטיחותיצינור סליל פנאומטיקה700-Sאוויר מסונן
סיליקוןVWR228-0701Pחבר PEEK למצמד
קטטר נירוסטהPrime BioscienceSC22/15מוכנס לכניסות ויציאות PDMS לחיבור לצינורות PEEK
סרט תרמופלסטיסיגמא אולדריץ'PM996"פרפילם" סטנדרטי
אתנול אולטרה-טהורVWR64-17-5
אמבט ניקוי אולטרסאונדVWRUSC200THלהכיל כוסות 1 ליטר
מייבש ואקוםSP Bel-ArtF42022-0000להסרת ה-PDMS או הפתרונות
כיסויים צינורות מצמד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles