מאמר שיטה

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

4.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63952

⸱

23 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Syracuse University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול להיווצרות מכלולים של מיקרוטובולים בצורת טקטואידים תוך שימוש ב-MAP65, קרוסלינקר מיקרוטובולים על בסיס צמחי, ו-PEG כסוכן צפיפות.

תקציר

השלד הציטוסקלטון אחראי על הארגון הפנימי העיקרי ועל הארגון מחדש בתוך התא, כל זאת ללא מנהל שינהל את השינויים. זה במיוחד המקרה במהלך מיטוזה או meiosis, שבו microtubules ליצור את הציר במהלך חלוקת התא. הציר הוא המנגנון המשמש להפרדת חומר גנטי במהלך חלוקת התאים. לקראת יצירת צירים המאורגנים בעצמם במבחנה, פיתחנו לאחרונה טכניקה לשילוב מחדש של מיקרו-טובולים למכלולים דמויי ציר עם קבוצה מינימלית של חלבונים הקשורים למיקרוטובולים וסוכני צפיפות. באופן ספציפי, נעשה שימוש ב- MAP65, שהוא קרוסלינקר מיקרוטובול אנטי-פאראלי מצמחים, הומולוג של Ase1 משמרים ו- PRC1 מאורגניזמים יונקים. לינקר צולב זה מארגן בעצמו מיקרו-טובולים לתוך מכלולים ארוכים, דקים, דמויי צירים, המאורגנים בעצמם. מכלולים אלה דומים גם לטקטואידים של גבישים נוזליים, ומיקרוטובולים יכולים לשמש כמזוגנים מזוקליים. כאן מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים מיקרוטובולים אלה, כמו גם לאפיון צורת המכלולים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניידות המרכיבים באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הפוטו-הלבנה.

מבוא

חלוקת תאים באמצעות מיטוזה היא אחד התהליכים הביולוגיים החשובים ביותר לקיום חיים. חוטי המיקרוטובול, המורכבים מדימרים של טובולין, הם מרכיבים מבניים חיוניים של תהליך זה. המנגנון הארעי שנוצר במטפאזה כאשר הכרומוזומים מתיישרים במרכז התא נקרא הציר המיטוטי בשל צורתו, שהוא כמו ציר של נול המכוסה בחוטים (איור 1A). באורגניזמים רבים מבוסס היטב שמיקרוטובולים משמשים במטפאז כדי לדחוף ולמשוך כרומוזומים מרוכזים למרכז התא, ליישר אותם ולחבר אותם למיקרוטובולים שימשכו אותם זה מזה באנאפאזה (איור 1B,C). צורות הציר הן במיוזה (איור 1B) והן במיטוזה (איור 1C), שנוצרו ממיקרוטובולים חופפים רבים שאינם עטופים סביב הציר המרכזי כמו חוט אלא פועלים במקביל לממשק. יצירת מבנים מבוססי מיקרו-טובולים אלה דורשת חלבונים קשורים המקשרים קשרים זה לזה ואנזימים נלווים שיכולים לשמש כמנועים כדי לעזור לדחוף ולמשוך את הכרומוזומים1.

מחקרים על צירים מיוטיים הראו שהמיקרוטובולים קצרים, דינמיים וחופפים במערכים מקושרים 2,3,4,5,6 (איור 1Di). בשל הארגון הפיזי של המיקרוטובולים הקצרים האלה, הציר המיוטי דומה לטקטואיד גבישי נוזלי (איור 1E). ואכן, הודגם כי צירים מתלכדים ומתמזגים, כפי שניתן היה לצפות מטקטואידים של גבישים נוזליים5.

מחקרים רבים שראשיתם בשנות ה-60 של המאה ה-20 השתמשו בקיבוע, בקטעים סדרתיים ובמיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לקבוע כי ישנם שני סוגים של מיקרוטובולים בתוך הציר המיטוטי 7,8,9,10. הסוג הראשון נקרא מיקרוטובולים קינטוצ'ור, המחברים את מוט הציר לקינטוכור. הסוג השני נקרא מיקרו-טובולים אינטר-קוטביים או קוטביים, שגדלים מעבר לכרומוזומים וחופפים באזור האמצע (איור 1Dii)8,9,10. סוג שלישי נקרא מיקרוטובולים אסטרליים, שנמצאים מחוץ לציר ומחברים את הקטבים לקצה התא; ארגונים מיקרו-טובים אלה נמצאים מחוץ לתחום הדיון הנוכחי. לאחרונה נערכו מחקרים על האינטראקציה בין אוגמין6 לבין קומפלקס טבעות גמא-טובולין המשפיעים על מרכזי נוקלאציה של מיקרוטובולים, וכתוצאה מכך נוצר ציר מיטוטי עם מיקרוטובולים קצרים יותר כמו באיור 1D.

מאחר שמיקרו-טובולים ארוכים יותר מכפי שהם רחבים, עם יחס גובה-רוחב גבוה ונוקשות גבוהה, הם דומים לגרסאות מוגדלות של מולקולות גביש נוזלי. בפיזיקה של חומר רך, אטומים ומולקולות הוערכו באמצעות אינטראקציות מינימליות כדי להסיק את המנגנונים הפיזיקליים של מעברי פאזה, כולל נוקלאציה והמסת גבישים11. באופן דומה, מיקרוטובולים הם עצמים מזוקליים שהם גרסאות מוגדלות של מולקולות גבישיות נוזליות, מה שנותן תובנות על הפיזיקה של הדינמיקה של גבישים נוזליים, כולל נוקלאציה וצמיחה של הפאזות הנמטיות מאלו האיזוטרופיות. יתר על כן, כפי שפורט לעיל, הציר המיוטי מציג תכונות כמו אלה של טקטואיד גבישי נוזלי, מצב נמאטי שנובע וצומח מהמצב האיזוטרופי של מולקולות גבישיות נוזליות 3,4,5. עבור טקטואידים, נוקלאציה וצמיחה הם כמו של גבישים אחרים (כלומר, דורשים ריכוז גבוה יחסית של מזוגנים [המולקולות היוצרות גבישים נוזליים]). צורת ה"ציר" הייחודית של הטקטואיד מגיעה מהיישור המקומי של מזוגני הגביש הנוזלי שמתיישרים לפאזה הנמטית (איור 1E). הם אינם יכולים ליצור גביש מעוגל מכיוון שהמולקולות הן מאוד אסימטריות. בהתחשב באופיים של המיקרוטובולים, זה אולי לא מפתיע שמכונות הציר המיטוטיות העשויות מריכוז מקומי גבוה של מיקרוטובולים הן גם בעלות אותה צורה, בין אם הן נקראות טקטואיד או ציר. טקטואידים יכולים להיות דו-קוטביים, עם קטבים בקצוות המחודדים (איור 1Ei), או הומוגניים, עם קטבים ביעילות באינסוף (איור 1Eii).

בהתחשב בחשיבות של היווצרות צירים, נעשו מאמצים לקראת היווצרות צירים מאורגנת עצמית במבחנה על ידי הדגמת עיבוי מיקרוטובולים לתוך צרורות באמצעות מינים יוניים12,13, סוכני צפיפות היוצרים אינטראקציות דלדול14,15, וחלבוני קישור צולבים ספציפיים של מיקרוטובולים 13,16,17,18,19, 21. באופן מפתיע, למרות שסוכנים אלה כולם פועלים כדי להגדיל את הריכוז המקומי של מיקרוטובולים, לעתים קרובות הם גורמים לחבילות מיקרוטובולים ארוכים אך לא לטקטואידים. אחת הסיבות לכך שצרורות אלה ארוכים יכולה להיות שגם המיקרוטובולים המרכיבים אותם ארוכים. עבודות אחרונות באמצעות מיקרוטובולים קצרים יותר דיווחו גם על צרורות ארוכים יותר שאינם מחודדים בסוף15; במקרה זה, הצרורות מוחזקים יחד עם חלבונים מוטוריים הגורמים להרחבה של הצרורות, ובכך הופכים אותם לארוכים יותר. מיקרוטובולים קצרים עם קרוסלינקרים שאינם מורחבים נחוצים למכלולים מחודדים דמויי ציר, כפי שמתואר כאן.

לאחרונה, פיתחנו טכניקה המאפשרת יצירת טקטואידים של מיקרוטובולים באמצעות ה-crosslinker האנטי-פאראלי, MAP65, בנוכחות מיקרו-טובולים יציבים22. המיקרוטובולים היו צריכים להיות קצרים, אך מעטים הרגולטורים הידועים באורך המיקרוטובולים שיכולים להכביד על מיקרוטובולים מפני חוסר יציבות דינמית או חישול מקצה לקצה. במקום זאת, GMPCPP שימש לגרעין וייצוב החוטים לאחר הגדילה. זה איפשר ליצור צפיפות גבוהה של מיקרוטובולים קצרים שיכולים להתארגן בעצמם לטקטואידים. טקטואידים אלה היו הומוגניים כאשר צפו בהם תחת דו-פרצופיות. בנוסף למיקרו-טובולים קצרים, נעשה שימוש ב-crosslinker אנטי-פאראלי ספציפי, MAP65, כדי ליצור את הטקטואידים (איור 2). MAP65 הוא חלבון הקשור למיקרוטובולים צמחיים במשפחת ה-PRC1/Ase1 של קרוסלינקרים מיטוטיים23. MAP65 קיים כדימר, עם זיקה חזקה להיקשר לעצמו כמו גם למיקרוטובולים24. שלא כמו הציר המיוטי והטקואידים שנצפו עם חוטי אקטין 25,26,27, שהם דו קוטביים ובעלי תכונות דמויות נוזל של גבישים נוזליים, טקטואידים מיקרוטובולים נצפו כמוצקים כמו 22,28.

כאן, מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים microtubule ואפיון צורת המכלולים ואת הניידות של המרכיבים באמצעות טכניקות מבוססות פלואורסצנציה.

פרוטוקול

הערה: אלא אם כן צוין אחרת, חלקים מהניסוי יכולים להתבצע על ספסל מעבדה תוך לבישת ציוד מגן מתאים (כפפות).

1. סילאניזציה של כסות

הערה: יש לערוך סילאניזציה של כיסויים כדי להשתמש בהם עם ציפוי מברשת הפולימרים המשמש בניסויים אלה. זהו טיפול סילאניזציה הידרופובי המאפשר לקופולימר בלוק עם בלוק מרכזי הידרופובי להיקשר וליצור מברשת פולימר. הצעדים הבאים צריכים להתבצע במכסה אדים כדי למנוע חשיפה לאדים רעילים בעת לבישת כפפות. דימתילדיכלורולסילן הוא רעיל ביותר ויש לטפל בו בזהירות מרבית.

  1. יש לשטוף את הכיסויים עם ddH2O, 70% אתנול ו-ddH2O לפי הסדר. מייבשים אותם במגבונים מעבדתיים ללא מוך בין כל שטיפה. זה מסיר אבק וחלקיקים מסיסים במים או אורגניים מפני השטח לפני הטיפול.
  2. הניחו את הכיסויים במדף המחזיק כיסויי מתכת והעבירו את המדף למכונת UV-Ozone (UVO). הקרינו את הכיסויים עם UVO למשך 20 דקות כדי להסיר כל פלואורסצנציה ברקע. ניתן להשתמש בתא פלזמה במקום UVO.
  3. באמצעות פינצטה, העבר את הכיסויים ממתלה המתכת המשמש לטיפול UVO אל מתלה מתכת אחר המשמש לסילאניזציה. אל תשתמש באותם מדפים עבור שניהם, מכיוון שזה יגרום לרמות גבוהות של חמצון כאשר UVO מוחל. נקו מראש את המדפים עם מים ואתנול, כך שלא יישארו שאריות כימיקלים משימושים קודמים.
  4. טבלו את המדף עם הכיסויים במיכל עם 100% אצטון למשך שעה אחת. יש לשטוף את המיכל 3x במי ברז ולאחר מכן 3x עם ddH2O כדי להסיר את כל האצטון.
  5. יש לטבול את המדף עם הכיסויים ב-100% אתנול למשך 10 דקות. יש לשטוף את המיכל 3x במי ברז ולאחר מכן 3x עם ddH2O כדי להסיר את כל האתנול.
  6. טבלו את המדף עם הכיסויים 3x ב-ddH2O למשך 5 דקות כל אחד.
  7. טבלו את המדף עם הכיסויים ב-0.1 M KOH (50 מ"ל של 1 M KOH ב-450 מ"ל של ddH2O) למשך 15 דקות. יש לשטוף את המיכל 3x במי ברז ולאחר מכן 3x עם ddH2O כדי להסיר את כל KOH.
  8. טבלו את המדף עם כיסויים 3x ב- ddH2O למשך 5 דקות כל אחד.
  9. יש לייבש את המדף באוויר עם הכיסויים למשך הלילה במכסה אדים או במכסה גלימה למינרי.
  10. לאחר ייבוש מוחלט של המדף והכיסויים, טבלו אותם במשך 5 דקות ב-2% דימתילדיכלורוסילן (DDS) שנלקחו במיכל אחר המשמש במיוחד לסילאן. אל תתנו לשום דבר שאינו יבש לבוא במגע עם הסילאן.
  11. לטבול את המדף ולכסות 2x במיכל עם 100% אתנול למשך 5 דקות. יש לשטוף את המיכל 3x במי ברז ולאחר מכן 3x עם ddH2O.
  12. טבלו את המדף וכיסויים 3x ב-ddH2O למשך 5 דקות כל אחד.
  13. יש לייבש את המדף באוויר עם הכיסויים למשך הלילה במכסה אדים או במכסה גלימה למינרי.
  14. לאחר שלב ייבוש אחרון זה, העבירו את הכיסויים בחזרה לקופסאות כיסוי באמצעות פינצטה. ניתן להשתמש בכיסויים אלה ב-1-2 החודשים הקרובים. כיסויים ישנים יתחילו לאבד את הציפוי שלהם ויש להשליך אותם.

2. הכנת טובולין

הערה: הטובולין שנרכש מגיע כאבקה ליופילית שאינה מתויגת או מסומנת בפלואורופורים. טובולין ליופילי מאוחסן במקפיא של −80 מעלות צלזיוס. ההליך הבא משמש כדי לערבב טובולין ללא תווית עם טובולין מסומן ביחס כי הוא טוב להדמיה.

  1. מוציאים מהמקפיא −80 מעלות צלזיוס אליקוט אחד של טובולין ללא תווית המכיל 1 מ"ג של אבקת טובולין ליופילית ושומרים אותה על קרח. הוסיפו 200 μL של PEM-80 קר לצינור כדי להביא את ריכוז הטובולין ל-5 מ"ג/מ"ל. שמור אותו על קרח במשך 10 דקות כדי להמיס את כל הליופילט.
  2. מוציאים מהמקפיא −80 מעלות צלזיוס אליקווט אחד של טובולין מסומן ברודמין המכיל 20 מיקרוגרם של אבקת טובולין ליופילית ושומרים אותה על קרח. הוסיפו 4 μL של PEM-80 קר לצינור כדי להביא את ריכוז הצינורולין ל-5 מ"ג/מ"ל. שמור אותו על קרח במשך 10 דקות כדי להמיס את הליופילט במלואו.
  3. לאחר ההמסה, יש להוסיף 100 μL של תמיסת טובולין ללא תווית לתמיסת 4 μL של טובולין המסומן ברודמין. פיפט 6x-7x לאט מאוד לערבב. אם אגרגטים נראים לעין, צנטריפוגה של הצינורולין הסולוביאלי למשך 10 דקות ב-90,000 x g כדי להסיר אגרגטים על ידי השלכת הכדור ושמירה על הסופרנאטנט. תערובת טובולין זו תגרום לכ-4% עם תווית טובולין.
  4. מקפיאים את 100 ה-μL הנותרים של טובולין ללא תווית לחנקן נוזלי (LN2) ומאחסנים אותו ב-−80 מעלות צלזיוס כדי שישמשו לתערובות טובולין נוספות.
  5. קחו את תערובת טובולין המסומנת ואליקוטים לשבעה צינורות עם 15 μL כל אחד. ניתן להשתמש בכל אליקוט עבור תא ניסוי יחיד. הקפיאו את האליקוטים הנותרים ואחסנו אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לניסויים עתידיים.

3. טיהור MAP65

הערה: MAP65 אינו זמין מסחרית, ולכן יש לטהר אותו עבור עבודה זו. הפרוטוקול הורחב בעבר במספר פרסומים23,29.

  1. הפוך את הפלסמיד MAP65 ואת הפלסמיד GFP-MAP65 לזן חיידקי BL21 לביטוי חלבונים.
  2. לגדל חיידקי BL21 לצפיפות אופטית של 0.6-1 ב-600 ננומטר. לגרום לייצור חלבונים באמצעות מפעיל ה-lac ולגדל את החיידקים במהלך הלילה.
  3. מטילים את התרביות ומשקרים את החיידקים.
  4. אספו את הליזאט לאחר הצנטריפוגה ודגרו אותו עם חרוזים שיש להם יון ניקל זמין כדי לקשור את תג 6x-histidine.
  5. יש לאלף את החלבון באמצעות אימידזול ולהתפלותו.
  6. מקפיאים את החלבון בחנקן נוזלי ומאחסנים אותו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לשימוש תוך שנה.

4. הרכבה של תאי זרימה

הערה: ניסויים מבוצעים בתאי זרימה העשויים ממגלשת זכוכית ומזכוכית כיסוי סילונית (איור 3).

  1. קח מגלשת זכוכית ונקה אותה באמצעות ddH2O, אתנול, ו- ddH2O לפי הסדר. יש לייבש עם מגבון מעבדה ללא מוך בין כל שטיפה.
  2. השתמש בפיסת סרט הדבקה דו-צדדי כדי ליצור נתיב זרימה. באמצעות ידיים עם כפפות, חתכו את הקלטת לאורך של כ-25-30 מ"מ. פצל את הקלטת לאורך כדי ליצור שתי רצועות דקות יותר. הניחו את שתי רצועות הטייפ על המגלשה עם כ-5-8 מ"מ ביניהן.
    הערה: מכיוון שעובי הקלטת מתוקנן לכ-80-100 מיקרומטר, רוחב הנתיב בין פיסות הקלטת יקבע את עוצמת הקול בתא.
  3. הניחו את הכיסויים הסלאניים על גבי נתיב הזרימה. אטמו את המגלשה והכיסוי לרצועות הטייפ הדו-צדדיות על ידי לחיצה עדינה על אזור הקלטת בגב העט. הקפידו לקבל חותם טוב על כל האזור; הקלטת צריכה להפוך משקיפות לבהירה כאשר החותם נעשה היטב.
  4. הסר את הקלטת הנוספת בקצוות, והשאר רק 1 מ"מ מהכניסה לתא הזרימה על ידי חיתוך הסרט עם סכין גילוח.
  5. תייג את התא במידע על הפרמטרים הניסיוניים, לפי הצורך.

5. ניסויים טקטואידיים

הערה : לאחר שנוצרים כל הריאגנטים והאספקה, ניתן להשתמש בהם כדי לגרום ולפלמל טקטואידים של מיקרוטובולים בתא הזרימה.

  1. אסוף את כל הריאגנטים לשימוש. להפשיר אותם על קרח ולאחסן אותם על קרח תוך כדי עבודה. הכינו מספר תאי זרימה לניסויים.
  2. השתמש בתא זרימה אחד עבור כל ניסוי. מצפים את משטחי תא הזרימה במברשת פולימר על ידי זרימה ב-20 μL של 5% חומרים פעילי שטח קו-פולימריים שאינם יוניים (טבלת חומרים) המומסים ב-PEM-80, עם טיפות קטנות בשני קצות התא כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בפנים. שמרו את זה בתא לח (כלומר, צלחת פטרי עם מגבון מעבדה רטוב ללא מוך) עד שיהיה מוכן לשימוש (לפחות 5-7 דקות).
  3. בצינור סטרילי, ערבבו את הדברים הבאים כדי ליצור את תערובת Tubulin-MAP: 9.5 μL של PEM-80; 4 μL של 10 mM GMPCPP; 4 μL של 5% פלורוני-F127; 1 μL של 1M DTT; 1 μL של גלוקוז; 2 μL של פוליאתילן גליקול (PEG); 12 μL של תערובת טובולין של 5 מ"ג/מ"ל (ריכוז סופי של 13.6 μM) משלב 2.5.; ו-5.5 μL של מלאי עבודה של MAP65 כאשר 10% הוא GFP-MAP65 להדמיה. המשיכו לרכוב על קרח תוך כדי ערבוב.
    הערה: מומלץ להשתמש בפיפטת תזוזה חיובית לטיפול בתמיסת PEG הצמיגית. ניתן להשתמש בפיפטות רגילות לאחר חיתוך הקצה כדי להגדיל את הפתח; עם זאת, שיטה זו פחות מדויקת.
  4. מערבבים 5x-6x על ידי צנרת.
  5. רגע לפני שמוסיפים לתא, מוסיפים 1 μL של תמיסה מעורבת מראש של גלוקוז אוקסידאז (0.5 מ"ג/מ"ל) וקטלאז (0.15 מ"ג/מ"ל) (דאוקסי) לתערובת Tubulin-MAP ומערבבים 7x-8x. חלקו את הנפח הכולל של התמיסה (40 μL) לשני חלקים שישמשו בתאים נפרדים.
  6. הזרימו את תערובת טובולין-MAP לתוך התאים. מכיוון שלתאים כבר יש חומר פעילי שטח קו-פולימרי שאינו יוני, לא ניתן להוסיף יותר נוזלים מבלי להסיר את הנוזל הישן. לשם כך, השתמש בפיסת נייר סינון או במנגב מעבדה ללא מוך בקצה השני של התא כדי להסיר נוזל באמצעות פעולה נימית.
  7. לאחר שהדגימה נמצאת במלואה בתוך החדר, אטמו את שני הקצוות של התא באמצעות אפוקסי של 5 דקות ושמרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות כדי לגרום ולגדל טקטואידים של מיקרוטובולים.

6. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

  1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי להדמיית הטקטואידים.
    הערה: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת של השתקפות פנימית או מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב טובות להסרת פלואורסצנציה ברקע מטובולין חופשי, אך טקטואידים נראים גם על ידי אפי-פלואורסצנציה רגילה ואפילו מיקרוסקופיית אור מועברת ברגע שהם נוצרים, מה שהופך את ההליך הזה לנגיש ללא ציוד מיוחד.
  2. השתמש במטרה של מפתח צמצם מספרי (NA) של 1.2 NA ומעלה עם הגדלה של פי 60 ומעלה כדי לאסוף מספיק אור בפלואורסצנציה. מטרות אלה דורשות לעתים קרובות טבילה ב- ddH2O או בשמן.
  3. הקלט תמונות באמצעות CMOS או מצלמת CCD. השתמש בגודל פיקסל יעיל במצלמה של 108 ננומטר.
    הערה: גודל הפיקסל תלוי במצלמה ובהגדלה שבה נעשה שימוש, שבמקרה זה הייתה פי 60 או 100x עם מפתח צמצם מספרי גבוה (1.2 או 1.49 NA). ניתן להשתמש במרחיבי תמונה נוספים לפני המצלמה כדי להשיג את גודל הפיקסלים הדרוש.
  4. שמור את הדגימה על 37 °C (74 °F) באמצעות תא סביבתי המוגדר לטמפרטורה זו. לחלופין, השתמשו בתנורי חימום שלבים אחרים, כולל מחממי שלב אוויר חם וצווארונים אובייקטיביים מבוקרי טמפרטורה עם מים חמים במחזור.
  5. השתמש במקורות עירור המתאימים לפלואורסצנציה הדרושה. עבור רודמין טובולין, השתמש בלייזר של 561 ננומטר עם הספק של לפחות 1 mW בדגימה, ועבור GFP-MAP65, השתמש בלייזר של 488 ננומטר עם לפחות 1 mW של הספק בדגימה.
    הערה: אם אתה משתמש במיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית רחבת-שדה, השתמש בקוביית מסנן רודמין עם עירור: 540 ± 12.5 ננומטר, דיכרואי: 545 ננומטר ± ניתוק של 12.5 ננומטר, ופליטה: מעבר באורך 575 ננומטר, וקוביית מסנן GFP עם עירור: 480 ± 15 ננומטר, דיכרואית: 505 ננומטר ± ניתוק של 15 ננומטר, ופליטה: מעבר באורך 515 ננומטר.
  6. צלם לפחות 10 תמונות של אזורים שונים כדי לצלם מעל 100 טקטואידים. צלם תמונות בערוצים האדומים והירוקים ושמור אותן כתמונות tiff של 16 סיביות לניתוח. ודא שעוצמת התאורה וזמני החשיפה הם כאלה שקנה המידה של העוצמה של המצלמה אינו רווי.

7. התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת תמונות (FRAP)

הערה: כדי לחקור את הניידות של המרכיבים הפנימיים של הטקטואידים, נעשה שימוש ב-FRAP. FRAP עובד על ידי הלבנת תמונות של חלק נבחר של טובולין מסומן ברודמין וטקטואיד MAP65 המסומן ב-GFP ולאחר מכן התבוננות בהתאוששות הפלואורסצנציה עם הזמן באזור זה. קצב ההתאוששות תלוי בתחלופה של המינים המצולמים. קצב תחלופה זה יכול להיות תלוי בתגובות דיפוזיה וקשירה. עבור MAP65 מחייב את הטקטואידים, ניתן להעריך את שערי החליפין המחייבים. FRAP מבוצע באמצעות מערכת לייזר נוספת של 405 ננומטר שיכולה לסרוק את הלייזר בכל צורה שהיא. ישנן אפשרויות רבות לביצוע FRAP, כולל שימוש במנורה ובצמצם המועברים כדי להלבין תמונה של אזור מקומי14.

  1. בחר טקטואיד מבודד בתא כדי ליצור אזור עניין (ROI) המכסה חלקים מהטקטואידים והפתרון שמסביב.
  2. השתמש במיקרוסקופ עם לייזר נוסף של 405 ננומטר עבור FRAP כדי להלבין גם את הטובולין וגם את MAP65 בו זמנית. לחלופין, ניתן להשתמש במנורה בהירה דרך תחנת השדה של הקשתית14. התאם את העוצמה הספציפית של מערכות ההלבנה הפוטו-הלבנה באופן אמפירי כדי למנוע פגיעה בחלבונים במהלך ההלבנה.
  3. הקלט את הטקטואיד כסרט סדרת זמן במשך 30-60 שניות לפני ההלבנה כדי לקבל מידע על העוצמה שלפני האקונומיקה. הקלט גם את הערוצים האדומים וגם את הערוצים הירוקים.
  4. פוטו-אקונומיקה את הטקטואיד על-ידי חשיפת ההחזר על ההשקעה עם הלייזרים או עם המנורה למשך זמן רב ככל שנדרש כדי לצלם אקונומיקה מבלי לפגוע בטקטואיד. לקבוע את העוצמה והזמן באופן אמפירי.
  5. המשך להקליט את הסרט בשני ערוצי הצבעים במשך 5-10 דקות לאחר הלבנת תמונות או עד שנראה כי ההתאוששות הגיעה לשיווי משקל.
  6. בדוק באופן חזותי את ערוץ GFP-MAP65 לשחזור.

8. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח כמותי של תמונות הטקטואידים בוצע כדי ללמוד על ההשפעות של שינויים סביבתיים המוטלים באמצעות סוכני צפיפות שונים, תנאים יוניים והוספת גורמים אחרים.

  1. אפיון צורה טקטואידית
    1. לכמת את האורך והרוחב של הטקטואידים מהתמונות האדומות והירוקות שצולמו במיקרוסקופיה קונפוקלית.
    2. פתחו את התמונות באמצעות FIJI/ImageJ.
    3. אם נתונים גולמיים נלקחים ב- 16 סיביות, התאם את הבהירות והניגודיות במידת הצורך. בחר תמונה > התאם > הבהירות והניגודיות כדי להתאים את התמונה כך שתוכל לראות את הטקטואיד בבירור. התאם את הבהירות והניגודיות מבלי להחיל את ההגדרה כדי לא לשנות בטעות את נתוני העוצמה.
    4. לאחר שהטקטואידים נראים בבירור, בחרו טקטואידים טובים למדידה (איור 4Bi). ודא שהטקואידים נראים בבירור ללא חפיפה עם טקטואידים או אגרגטים אחרים ואינם מעוקלים או כפופים כדי להיות מסוגלים להשתמש בכלי מדידה בקו ישר.
    5. לאחר מכן, ודא שגודל הפיקסל הנכון מוגדר עבור התמונות. תמונות המיקרוסקופ מגיעות עם מטא נתונים על גודל הפיקסל. בעת שימוש במצלמה אחרת שאין לה מטה-נתונים או מערכות חיצוניות להרחבת תמונה שיכולות לשנות את גודל הפיקסלים האפקטיבי הצפוי, התאם את גודל הפיקסל באופן ידני. ב- FIJI/ImageJ, עבור אל ניתוח > הגדר קנה מידה כדי להגדיר את המרת הפיקסלים הנכונה.
    6. באמצעות הכלי 'קו ישר' מסרגל הכלים ב-FIJI/ImageJ, לחצו על קצה אחד של הטקטואיד וגררו את הסמן לקצה השני של הטקטואיד (איור 4Bii). לאחר בחירת החזר ההשקעה של השורה, בחר נתח > מדידה למדידת האורך. אם האורך אינו נמדד כברירת מחדל, הקפד להגדיר את המדידה כך שתכלול אורך בתיבת הדו-שיח ניתוח > הגדרת מדידות .
      הערה: בדרך כלל, בעת מדידה באמצעות הכלי קו ישר , הוא ייתן את האורך והזווית של הקו שצויר. כדוגמה, איור 4Bii מראה קו ישר שנמשך לצד הטקטואיד כדי להפוך את האחרון לנראה לעין, אך לבצע את המדידה ישירות על הטקטואיד.
    7. לאחר ביצוע המדידה, השתמש בכלי טקסט בסרגל הכלים כדי לתייג את הטקטואיד. צור תיבת טקסט, הוסף תווית מספר ובחר ערוך > ציור כדי לתקן את התווית בתמונה. שמור את התמונה כקובץ ROI נפרד.
      הערה: תיוג ושמירה של קובץ זה מאפשרת לחוקר לדעת איזו מדידה מתאימה לאיזה טקטואיד מהנתונים הגולמיים. הקפידו למדוד כל טקטואיד פעם אחת.
    8. לאחר מדידת הטקטואידים עבור התמונה כולה, שמור את הנתונים בחלון התוצאות בקובץ טקסט מופרד בפסיקים או בטאבים (באמצעות קובץ > שמור בשם) ופתח את הנתונים בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לנתח את הנתונים למספרים. אסוף את כל הנתונים יחד (נתוני תמונה גולמיים, תמונת ROI וקובץ טקסט של תוצאות) לתיקיה עם מוסכמה מתאימה למתן שמות כדי לשמור על הכל מאורגן.
      הערה: למרות שמדידות אורך טקטואיד מבוצעות ביד, בהתחשב בכך שרוחב הטקטואידים צר, עדיף להשתמש בשיטה שונה למדידת רוחב טקטואיד (ראה להלן) כדי להפחית את שגיאת המדידה.
    9. באמצעות ImageJ/FIJI, צייר אזור קו באמצעות הכלי קו ישר . ציירו את הקו כביסקטור מאונך לציר הארוך הטקטואידי (איור 4Bii).
    10. בחר נתח את פרופיל העלילה > כדי ליצור את פרופיל העוצמה של הביזקטור הליניארי (איור 4Biii). עלילה תופיע. כדי לאחזר ולשמור את הנתונים מהחלקה, בחר בלחצן רשימה בפינה השמאלית התחתונה; פעולה זו יוצרת את רשימת קבצי הטקסט של נתוני העוצמה לאורך הקו שצויר. שמור את קובץ הטקסט כקובץ .csv או .txt.
    11. פתח את קובץ הטקסט בתוכנית מתאימה כגון MatLab, Python (sciPy) או תוכניות אחרות. התאם את נתוני העוצמה עם פונקציית גאוס של הצורה: נוסחת הפונקציה הגאוסית, I(x)=B+Ae^((x-μ)²/2σ²)., כאשר I(x) הוא ערך גווני האפור לאורך, x; B היא רמת הרקע; A היא המשרעת של הגאוס; μ הוא הממוצע או המרכז של הגאוס; σ היא סטיית התקן של הגאוס.
    12. דו"ח 2σ כרוחב הטקטואיד. להעריך את עוצמת המיקרוטובולים בטקטואיד על ידי חישוב השטח שמתחת לגאוס (לא כולל הרקע).
      הערה: אם התמונות נמצאות בטווח העוצמה הליניארית של המצלמה והן מצולמות עם אותו זמן חשיפה ועוצמת עירור, ניתן להשוות עוצמות משולבות כדי להעריך את המספר היחסי של מיקרוטובולים בטקטואיד.
  2. ניתוח FRAP
    הערה: ניסויים לבדיקת הניידות של המיקרו-טובולים וה-MAP65 השתמשו ב-FRAP כדי לתעד את ההלבנה הספציפית ואת ההתאוששות של העוצמה כתוצאה מתנועה מולקולרית (איור 5A). הנתונים כומתו מנתוני סדרת זמן התמונה באמצעות ImageJ/FIJI.
    1. השתמש ב-ImageJ/FIJI כדי לפתוח את נתוני הסרט.
    2. רשום את הערימות (נתוני סדרות זמן) לאורך זמן כדי להסיר סחף. השתמש בתוסף StackReg יחד עם תוסף TurboReg הנלווה; לקבלת הוראות לשימוש בתוספים, עיין בקישורי האינטרנט המופיעים בטבלת החומרים. בחר תרגום כדי לשנות את מיקום המסגרות ובכך לרשום את התמונות.
    3. לאחר שהתמונות נרשמות להסרת סחף, סובב את התמונה כך שהטקואיד יהיה אנכי או אופקי במסגרת על-ידי בחירה באפשרות תמונה > שינוי צורה > סיבוב. בחר את הזווית לסיבוב והשתמש בתצוגה מקדימה כדי לקבוע אם הטקטואיד מסובב מספיק. כאשר התצוגה המקדימה מראה שהטקואיד הוא אנכי או אופקי, בחר אישור כדי לסובב את כל התמונות בסרט.
    4. השתמש בכלי בחירת מלבן בסרגל הכלים כדי ליצור מקטע מלבני מעל האזור המצולמן של הטקטואיד. תעד את העוצמה המשולבת של אזור ההחזר על ההשקעה עבור כל מסגרת באמצעות ערימות > תמונה > מחסנית מדידה. הגדר את סוג המדידה לצפיפות משולבת באמצעות ניתוח > הגדרת מדידות. שמור את נתוני העוצמה המנותחים המוצגים בחלון תוצאות כקובץ טקסט בתבנית .csv או .txt על-ידי בחירה בקובץ > שמור בשם.
      הערה: איור 5B מציג דוגמה לנתוני העוצמה הגולמיים של 16 סיביות שנמדדו עבור ערוצי המיקרו-טובול וה-GFP-MAP65 באזור האקונומיקה.
    5. מכיוון שהעוצמה הכוללת של התמונות תדעך עם הזמן באופן גלובלי עקב הלבנת תמונות הנגרמת על ידי הדמיה, יש לתקן את ההלבנה הגלובלית הזו. לשם כך, השתמש באותו גודל ROI (שלב 8.2.4.), והעביר אותו לאזור ברקע התמונה שבו לא נראים מיקרו-טובולים או MAP65. מדוד את העוצמה המשולבת של הערימה כמתואר בשלב 8.2.4. שמור את התוצאות כקובץ טקסט שני.
      הערה: איור 5B מציג דוגמה לנתוני העוצמה הגולמיים של 16 סיביות שנמדדו עבור ערוצי המיקרו-טובול וה-GFP-MAP65 באזור הרקע.
    6. כדי לתקן את דעיכת הרקע, חלקו את עוצמת האות על הטקטואיד בעוצמת הרקע לאותה נקודת זמן. חשב שתיקנתי (t) כ: משוואת עוצמה מתוקנת, I_corrected(t) = I_S(t) / I_BG(t) - 1, המשמשת בניתוח נתונים., כאשר IS (t) (האות) הוא המדידה שנעשתה על האזור המולבן ו- IBG (t) (הרעש) הוא המדידה שנעשתה באזור הרקע (איור 5C). פעולה זו מחשבת את יחס האות לרעש עבור כל מסגרת ומחסרה גם את הרעש.
    7. לאחר מכן, שנה את קנה המידה של הנתונים כך שינוע בין אפס לאחד באמצעות נוסחת עוצמת שינוי קנה מידה \( I_{\text{rescale}}(t) \) משוואה; שיטת נורמליזציה של נתונים., כאשר אנימציין ו- Iמקסימום מציינים, בהתאמה, את המינימום והמקסימום הגלובליים של הנתונים שתיקנתי לאורך כל הזמן (איור 5C).
    8. התאימו את הנתונים האלה לאקספוננציאל מתפורר של הצורה: דיאגרמת משוואת דעיכה מעריכית לניתוח ספקטרוסקופיה של ספיגה חולפת., כאשר A היא המשרעת של ההתאוששות ו-τ הוא ציר הזמן של ההתאוששות (איור 5C).

תוצאות

עם מספר קטן בלבד של רכיבים, דימרים של טובולין וקישורים צולבים של מיקרוטובולים, טקטואידים של מיקרוטובולים יכולים להיווצר (איור 2A). אף על פי שפרוטוקול זה מתאר דגירה לגרעין ולגידול מיקרוטובולים באינקובטור, ניתן לצפות בגרעין ובצמיחה ישירות מתחת למיקרוסקופ (שהם שלמים תוך 30 דקות) (איור 2B). ריכוז טובולין נשמר קבוע ב-13.6 מיקרומטר וקשירת MAP65-MT ב-10%.

איור 4 מייצג נתונים מוצלחים. הטקטואידים צריכים להיות גלויים הן עם לייזר של 561 ננומטר בתעלת טובולין והן עם 488 ננומטר בתעלת MAP65, החופפים באופן מושלם זה לזה (איור 4A). אחת התעלומות של המערכת הייתה שנראה שרוחב הטקטואידים אינו משתנה תחת מגוון שינויים ניסיוניים, כולל שינוי אורכי המיקרוטובולים, ריכוז MAP65 וחומרי הצפיפות (איור 4B)22,28. האורך משתנה הרבה יותר ותלוי הן באורכי המיקרוטובולים והן בריכוז MAP65 (איור 4B)22,28.

בעת ביצוע FRAP, נצפה כי האות MAP65 מתאושש, אך אות המיקרוטובול אינו מתאושש (איור 5). ההתאוששות ב-FRAP נובעת מהניידות והתנועה של העצמים המסומנים והמצולמנים. במקרה של MAP65, המולקולות המוכהות מתנתקות ומתרחקות מהמיקרוטובול, והמולקולות החדשות עוברות לאזור (איור 5). קשירת MAP65 נמצאת בשיווי משקל, כך שקצב הקשירה וההתנתקות שווה (נמדד במולקולות לשנייה). עבור המיקרוטובולים, לא נצפתה התאוששות המרמזת על כך שהמיקרוטובולים אינם מסוגלים לעזוב את הטקטואיד (איור 5A, Bi, C). יתר על כן, לא נראתה התפשטות של האזור הכהה, מה שמרמז על כך שהמיקרוטובולים הם חסרי תנועה מקומית ולא נוזלים בתוך הצורה הטקטואידית.

יישור כרומוזומים מטפאזי; מבנה ציר וארגון מיקרו-צינורות; תרשים מיקרוסקופיה.
איור 1: מודלים שונים של היווצרות צירים. ציר מיטוטי הוא מכונה העשויה ממיקרוטובולים ומהחלבונים והאנזימים הקשורים אליהם, אשר מיישרת ומפרידה את הכרומוזומים לשני תאי הבת החדשים במהלך חלוקת התאים. (A) תמונה של העתק ציר טיפה מימי הביניים המוקדמים עם חוט דק מהולנד. נתון זה שונה מתמונת ויקימדיה על ידי פיטר ואן דר סלויס30. (B) שחזור תלת-ממדי של מיקרו-טובולים בשלבים שונים של מיוזה מסוג בר II. מיקרוטובולים מוצגים בירוק, וכרומוזומים מוצגים באפור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. נתון זה שונה מ-Lantzsch et al.31. (C) תמונת מיקרוסקופיה של המיקרוטובולים בציר מיטוטי של תא Sf9 מתפצל. מוטות הציר והמיקרוטובולים של הציר מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. נתון זה שונה מ-Advani et al.32. (D) מודלים שונים של האופן שבו מיקרוטובולים של צירים מיטוטיים ומיוטיים מאורגנים. (i) המיקרוטובולים (הירוקים) שנצפו בעבר עבור צירים מיוטיים שנוצרו מתמציות ביצים של קסנופוס, הוסקו כקצרים ודינמיים לאורך כל הציר. זה דומה לארגון טקטואידי דו קוטבי בתוך גביש נוזלי. (ii) המודל הקנוני לארגון מיקרוטובולים בתוך ציר מיטוטי כולל שני סוגים של מיקרוטובולים: מיקרוטובולים אינטרפולריים או קוטביים (ירוק כהה) המתחברים לאזור האמצע סביב הכרומוזומים ומיקרוטובולים קינטוצ'ור (ירוק בהיר) אשר מקובצים ונמתחים מהקוטב לקינטוכור כדי לדחוף ולמשוך את הכרומוזומים. בכל התמונות, הכרומוזומים מוצגים בכחול שקוף, וקטבים ציריים מיוצגים בירוק כהה. (E) סכמות של מזוגנים (קווים ירוקים) בטקטואיד גבישי נוזלי עבור (i) טקטואידים דו קוטביים ו-(ii) טקטואידים הומוגניים. לטקטואידים דו קוטביים יש שני קטבים בקצה הטקטואיד, והמזוגנים מכוונים מחדש כדי להצביע על הקטבים האלה. לטקטואידים הומוגניים יש קטבים באינסוף, והמזוגנים אינם משנים כיוון לאורך הטקטואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שיטת היווצרות טקטואידים סכמטית וסדרות זמן; מיקרו-צינורות, קישור צולב MAP65, מיקרוסקופיה.
איור 2: עיבוי מיקרו-טובולים. (A) מיקרו-טובולים יכולים להיות ארוזים ומוצלבים על-ידי מגוון שיטות, כולל מינים יוניים, כוחות דלדול הנגרמים על-ידי סוכני צפיפות, וקישורים צולבים ספציפיים של מיקרוטובולים, כגון MAP65. (i) דימרים של טובולין וחלבוני MAP65 מעורבבים כדי לגרום ולגדל מיקרוטובולים. (ii) מיקרו-טובולים מתפרקים וצומחים מהטובולין, ו-MAP65 נקשר מיד למיקרוטובולים, למונומר MAP65 נוסף, או לשניהם וגורם לאגד. (3) מיקרוטובולים בצרורות המקושרים צולבים מגרגרים וגדלים. (iv) התצורה הסופית היא טקטואיד מיקרוטובול הדומה לציר. (B) סדרת זמן של טקטואידים מיקרוטובולים מתנודדים וגדלים במשך 105 דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. האיור הותאם מתוך Edozie et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תרשים תא זרימה עם כיסוי סילאני, לניתוח כיוון זרימת דגימה במיקרוסקופיה.
איור 3: מכלול תא זרימה. תא הזרימה נעשה באמצעות מגלשת זכוכית, זכוכית כיסוי סילאנית וסרט הדבקה דו-צדדי קבוע. האזור המסומן הצהוב הוא נתיב הזרימה שבו הדגימה זורמת ונצפית. נפח תא הזרימה הוא ~ 20 μL. אפוקסי שימש לאטום את קצות התא כדי למנוע מהדגימה להתאדות במהלך הדמיה ארוכת טווח במשך מספר שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתוח טקטואידים: ערוצי מיקרו-צינוריות ו-MAP65, תמונות ממוזגות, כימות אורך-רוחב, גרף.
איור 4: תמונות טקטואידיות וניתוח אורך ורוחב. (A) נתונים לדוגמה של טקטואידים שנוצרו כמתואר ומצולמים באמצעות קונפוקל דיסק מסתובב המציג (i) הדמיית תעלות מיקרוטובול הדמיה של טובולין המסומן ברודמין באמצעות לייזר של 561 ננומטר, (ii) הדמיית ערוץ GFP-MAP65 של ה-GFP באמצעות לייזר של 488 ננומטר, ו-(iii) תמונת שכבה ממוזגת מערוץ המיקרוטובול (magenta) וערוץ GFP-MAP65 (ציאן). אזורי חפיפה מוצגים כלבנים ומדגימים שהמיקרוטובולים וה-MAP65 מתמזגים בדיוק. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר עבור כל התמונות ב- (A). (B) כימות של אורך ורוחב טקטואידים. (i) תמונה של טקטואיד שיש לנתח ללא תוויות. סרגל קנה מידה = 5 μm. (ii) אותה תמונה כמו ב- (i), שבה מסומנות מדידות האורך (קו אחיד עם מכסי קו) והרוחב (קו מקווקו). סרגל קנה מידה = 5 μm. (iii) הרוחב נמדד על ידי לקיחת פרופיל העוצמה על פני הטקטואיד בביסקטור הניצב (קו מקווקו) המסומן ב- (ii). פרופיל העוצמה התאים לתפקוד גאוס כדי לחשוף את המשרעת והרוחב של הטקטואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתוח FRAP: מיקרו-צינוריות, סדרות זמן MAP65, תרשימי עוצמה. דינמיקת התאוששות פלואורסצנטית.
איור 5: נתונים וניתוחים מייצגים של FRAP. (A) נתוני סדרת זמן מיקרוסקופיה של (i) טקטואיד מיקרוטובולים ו-(ii) GFP-MAP65, ו-(iii) תמונת שכבה של שני הערוצים עם מיקרוטובולים במג'נטה וב-GFP-MAP65 בציאן שהולבנו בזמן 63 שניות ונצפו במשך 5 דקות נוספות. ) תעלת מיקרוטובול באזור הלבנה (מעגלי מג'נטה) והרקע (עיגולים אפורים כהים) ו-(ii) ערוץ GFP-MAP65 באזור המולבן (ריבועי ציאן) והרקע (ריבועים אפורים כהים). (C) הנתונים תוקנו עבור רעשי הרקע והורחבו מחדש עבור ערוץ המיקרוטובולים (מעגלי מג'נטה) וערוץ GFP-MAP65 (ריבועי ציאן). המיקרוטובולים אינם מתאוששים, אך ה-GFP-MAP65 כן יכול להתאים (קו אפור כהה) לדעיכה מעריכית עולה כדי למצוא את המשרעת ואת ציר הזמן של ההתאוששות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דיון

השיטות המתוארות כאן שימשו בכמה מאמרים ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים (איור 2)22,28. ניסויים אלה רלוונטיים מבחינה ביולוגית כדי לסייע בחשיפת העקרונות הארגוניים השולטים בצורה וביציבות של הציר המיטוטי או המיוטי ברוב סוגי התאים. בנוסף, מיקרוטובולים הם מזוגנים של גבישים נוזליים לדוגמה שיכולים לסייע בלמידה נוספת על האופן שבו גבישים נוזליים מגרגרים ומגדלים פאזות נמטיות משלבים איזוטרופיים.

להליך המתואר כאן יש מספר יתרונות לחקר ארגון עצמי של מיקרוטובולים. ראשית, הוא ניתן לשחזור רב, לאחר שבוצע במעבדה על ידי תלמידים רבים, כולל תלמידי תיכון, עם מעט ידע או הכשרה לפני תחילתו במעבדה. הטקטואידים הם דו-פרצופיים22, מה שמאפשר לצפות בהם באור מועבר בנוסף למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שהופך את השיטה הזו לנגישה למעבדות רבות ולהליך הניסויי הזה הניתן להתאמה למטרות חינוכיות, בנוסף למחקר מתקדם. לבסוף, תהליך זה פותח אפיקים להמשיך להבין ולחקור מערכות ביולוגיות בגישה רדוקציוניסטית מופשטת, ומאפשר להבין כיצד כל מצב, חלבון או תוסף נוסף יכול לשנות את הארגון העצמי של הטקטואידים, ואולי, בסופו של דבר, את הציר. מטרות לביומימיקריה טובה יותר כוללות פעילות, נזילות ומיון קוטביות נימה.

יכולים להיות מספר גורמים המשפיעים על הניסוי ומעניקים תוצאות בלתי צפויות. לדוגמה, אם הטקטואידים אינם נוצרים (איור 2) אך נצפים דפוסים דמויי מניפה, סביר להניח שה-MAP65 אינו קיים או אינו נקשר למיקרו-טובולים22,28. זה צריך להיות ברור גם בערוץ הפלואורסצנטי MAP65 מכיוון שה-GFP-MAP65 לא יהיה קשור למיקרוטובולים.

אם הטקטואידים לא נוצרים והרקע מופיע ככתמים על הזכוכית, זה יכול להיות בגלל ציפוי פני השטח. לאחר ביצועו, הסילאניזציה נמשכת חודש אחד בלבד על כיסויים. כאשר הוא מתפוגג, הטובולין יוכל להיקשר למשטח החשוף באופן לא ספציפי. כריכה זו תתרחש בדפוסים מוזרים.

אם הטקטואידים אינם נוצרים והטובולין נצפה באגרגטים של צורות וגדלים שונים, זה יכול להיות בגלל טובולין באיכות ירודה. טובולין יכול להיות צנטריפוגה כדי להסיר אגרגטים ראשוניים שיכולים להניע את הצבירה הזו מחוץ למסלול במקום פילמור מיקרוטובולים. אם המשטח נקשר לטובולין, הוא יכול גם לרוקן את הטובולין בתמיסה. ריכוזים נמוכים של טובולין, מתחת לריכוז הקריטי לפולימריזציה של מיקרוטובולים, עלולים לגרום לאגרגטים.

בניסויי FRAP, אם ערוץ MAP65 אינו מראה התאוששות כלשהי (איור 5), ייתכן שהלבנת הצילום צילמה את המיקרו-טובולים. Photodamage גורם להרס מקומי של החוטים. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה בערוץ המועבר. טקטואידים של מיקרוטובולים נראים בתעלה המועברת דרך אינדקס גבוה של אי התאמה של אי-התאמה לשבירה עם המים שמסביב. פוטו-דמה המושרה על-ידי אור יופיע כסימן צריבה או אובדן ניגודיות בהדמיית אור מועברת במיקום ההחזר על ההשקעה הנתונה להלבנת תמונות. אם זה קורה, יש להפחית את כוח הלייזר או האור כדי לעכב את הפוטו-דמה של החלבונים.

היו מספר אתגרים שנתקלו בהם בהליך ובגישה זו. בעיה אחת היא שמדדי האורך מבוצעים כעת ביד על ידי לחיצה על התמונה. שיטה זו, למרות שהיא פשוטה, עלולה לגרום לאי-ודאות גבוהה. מדידת הרוחב המשתמשת בחתך הרוחב ומתאימה לגאוס היא שיטה טובה יותר לכימות הגודל. ניתן להשתמש בשיטה דומה לאורך. בעיה שנייה היא שלפעמים, הטקטואידים, בגלל שהם כל כך ארוכים ודקים, יכולים להתכופף. זה הופך את כימות האורך לקשה יותר. ניתן לכמת את אורך קווי המתאר באמצעות קו מקוטע, אך יש אי-ודאות נוספת בכל פעם שמוסיפים מקטע.

מנקודת מבט מדעית, לגישה זו יש כמה אתגרים אחרים לשימוש בה כמודל לגבישים נוזליים או צירים. האתגר הראשון היה הצורה הארוכה והדקה של הטקטואידים שהמיקרוטובולים יוצרים (איור 3 ואיור 4). כפי שצוין בפרסומים קודמים22, טקטואידים מיקרוטובולים הם טקטואידים הומוגניים, לא דו קוטביים. משמעות הדבר היא שהמיקרוטובולים המרכיבים את הצורה אינם מכוונים מחדש כדי להצביע לעבר קצות המבנה. במקום זאת, כל המיקרוטובולים מקבילים לציר הארוך וה"קטבים" ממוקמים באינסוף. זה שונה מאוד מהטקטואידים שנצפו לגבישים נוזליים מולקולריים או אפילו לאקטין או דנ"א שיכולים לשמש גם כמזוזנים גבישיים נוזליים. במערכות אחרות אלה, הטקטואידים הם דו קוטביים, וכאשר מסתכלים עליהם בקטבים חצויים, הם מראים את הסימנים המובהקים של כיוון מחדש של המוטות.

אתגר מרכזי נוסף במערכת זו הוא שהמיקרוטובולים אינם משותקים בתוך הטקטואיד. זה ברור מניסויים וניתוחים של FRAP מכיוון שההתאוששות של המיקרוטובולים נמוכה מאוד. האופי המוצק שלהם הופך את הטקטואידים של המיקרוטובולים לפחות בעלי ערך כמו אנלוגים של גבישים נוזליים בקנה מידה גדול. הפאזה הנמטית של גביש נוזלי צריכה להיות בעלת תכונות נוזליות (נוזל) וקריסטליות (מאורגנות). למרות שהצורה נראית מתאימה לציר, חוסר התנועה הופך את המערכת לפחות מרגשת כציר מיטוטי מדגם. מצד שני, בעיה זו מספקת הזדמנויות לחקור כיצד ניתן לשנות את הניסויים כדי ליצור נזילות רבה יותר במערכת.

אתגרים מדעיים אלה מציעים הזדמנויות מרגשות שיאפשרו ידע חדש על המערכת. כדי להפוך את הטקטואידים המיקרו-טובולים לדו-קוטביים יותר, אפשר להשתמש במיקרו-טובולים קצרים יותר. עם זאת, יש אתגר נוסף, מכיוון שלמיקרוטובולים אין הרבה חלבוני מכסה מאופיינים היטב כדי לשלוט באורך כפי שעושה אקטין. השימוש בגרעין ובצמיחה דורש שימוש בריכוזים גבוהים מאוד של טובולין ו- GMPCPP כדי ליצור מיקרוטובולים קצרים. ריכוז טובולין גבוה גורם למספר גדול יותר של חוטים במערכת, מה שמקשה על הפרדת טקטואידים זה מזה. התוספת של כובעי מיקרוטובול חדשים, כגון DARPin33, עשויה לסייע במצב זה. את הבעיה השנייה של המיקרוטובולים להיות חסרי תנועה ניתן למתן על ידי תוספת של חלבונים מוטוריים, כגון kinesin-534, שהם טטרמרים של מנועים המשמשים מיטוזה. לחלופין, ניתן להשתמש בדמרים מלאכותיים של קינזין-1 דימרי15.

דרך נוספת להוסיף נזילות נוספת תהיה לאפשר למיקרוטובולים לבצע את חוסר היציבות הדינמית שלהם, את הגידול וההתכווצות של המיקרוטובולים. נכון לעכשיו, מיקרוטובולים שנזרעים עם חוטי GMPCPP יציבים ולאחר מכן עוברים חוסר יציבות דינמית הם הרבה יותר ארוכים מהרצוי כדי ליצור ציר או טקטואיד, מה שיגרום לארגונים ארוכים מאוד כמו מאווררים או חבילות. לכן, הוספת חוסר יציבות דינמית של מיקרוטובולים תצטרך להיעשות בזהירות כדי לשמור על הצורה הטקטואידית. תוספת של חלבונים ואנזימים נלווים שיכולים לשלוט באורך עשויה למתן בעיה זו. לדוגמה, סביר להניח שיהיה צורך בדה-פולימריזציה של קינזינים, כגון קינזין-1335, או ניתוק אנזימים, כמו קטנין36. ניסויים אלה מורכבים וקשים, אם כי הם יהיו בעלי תובנה רבה לא משנה מה התוצאות יחשפו. לא משנה לאיזה כיוון ילכו הניסויים העתידיים, הפלטפורמה שפותחה כאן ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים יכולה לחשוף מידע חדש על בסיס פיזיקלי של ארגון מיקרוטובולים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת רוס בקיץ 2021, במיוחד ק. אליס לינדזי, על עזרתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NSF BIO-2134215 שתמך בס 'סאהו, נ' גודבי, ה.ב. לי וג'.ל. רוס. מענק מקרן KECK (ריי אנדרסון, USD, lead PI) תמך באופן חלקי בר' סניף וב-P. Chauhan

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2% דיכלורודימתילסילןGE Healthcare118945טיפול משטח סילאן הידרופובי. ניתן לעשות בו שימוש חוזר עד שלוש פעמים ולשמור בטמפרטורת החדר למשך שנה.
אפוקסי 5 דקותבוב סמית תעשיותלאיטום תאי ניסוי
אצטוןפישר32900HPLC100%
תאי BL21Bio LabsC2527Iתאי חיידקים מוכשרים המשמשים לביטוי MAP65
CatalaseSigmaC30-500MGחלק ממערכת ניקוי החמצן. ציר של 300 מ"ג/מ"ל מיוצר ב-ddH2O ומאוחסן ב-10 μ l aliquots ב-20° C עד שנה.
כיסויים (22 מ"מ x 22 מ"מ או 22 מ"מ x 30 מ"מ)פישר12544-APלתאי ניסוי
DithiothreitolSigma43815-5Gמולקולה קטנה המשמשת לשבירת קשרי דיסולפיד ולניקוי חמצן. מלאי 1M עשוי מאבקה (סיגמא) ב-ddH2O. התמיסה מוצעת ומאוחסנת ב-20 מעלות צלזיוס עד שנה. משתמשים באליקוטים 7-8 פעמים ואז מושלכים.
EGTASigmaE3889-10Gמרכיב בסיס חיץ טובולין
Eppendorf צינורות 0.5 מ"לEppendorf05 402 18להחזקת תמיסות ניסיוניות
אתנולFisher111000200200 הוכחה
נייר סינוןWhatman1004-110לניקוי ולמשיכת תמיסות דרך תאי ניסוי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם NA גבוה מטרותניקוןTi-E, W2 קונפוקלילניסויי הדמיה
מקפיא -20° CFisherbrand13986148לאחסון ריאגנטים
מקפיא -80° CThermo scientific328223H01-Cלאחסון חלבונים.
מיכלי זכוכית לסילניזציהמיכאלסלהכנת תאי ניסוי - טיפול במשקפיים כיסוי
מגלשות זכוכיתפישר12544-4לתאי ניסוי
גלוקוזסיגמאG7528-250Gחלק ממערכת ניקוי החמצן. ציר של 300 מ"ג/מ"ל מיוצר ב-ddH2O ומאוחסן ב-10 μ l aliquots ב-20°C.
גלוקוז אוקסידאזסיגמאG2133-250KUחלק ממערכת ניקוי החמצן. זה מאוחסן ב-4° C עד שנה.
GMPCPPJenna BioscienceNU-4055אנלוגי הניתן להידרוליזה איטית של GTP המשמש לפילמור וייצוב המיקרו-צינורות על ידי הפחתת חוסר היציבות הדינמית והריכוז הקריטי הספונטני עבור גרעין מיקרו-צינוריות כדי לקבל אורך עקבי. אנו רוכשים מלאי של 10 מ"מ מ-Jena Biosciences ומאחסנים אותו ב-20° C עד שנה.
גוף חימום למיקרוסקופעליונה שלב Okolabלניסויי הדמיה
ImidizoleSigmaI2399משמש לסילוק חלבון MAP65 מחרוזי ניקל לטיהור MAP65
KimwipesFisher34155לניקוי ולמשיכת תמיסות דרך תאי ניסוי.
KOHSigmaP250-5001 M ב-ddH2O, עשוי טרי למניעת החמצה לאורך זמן.
חנקן נוזליאיירגזNI 230LT22להורדת הקפאה. זה יכול לשמש גם לאחסון (לא מומלץ)
חלבון MAP65Ram DixitA חלבון הקשור למיקרו-צינוריות (MAP) במשקל מולקולרי של 65 kD שהוא צולב מיקרו-צינוריות אנטי-מקבילות. טיהרנו גרסה לא מסומנת ומסומנת GFP של MAP65-1 מ-Arabidopsis thaliana. אנו מערבבים את ה-GFP-MAP65 עם ה-MAP65 הלא מסומן כך ש-10% מהחלבון מסומן. מלאי העבודה הוא 10.8 μ פתרון M. פתרון עבודה זה מאוחסן ב-4° C ומחודש טרי כל שבוע. הפרוטוקול לטיהור ה-MAP65 וה-GFP-MAP65 ניתן בפרק השיטות הקודמות שלנו (26).
MgSO4SigmaMKCJ940מרכיב חיץ טובולין
NTA-חרוזי ניקלQiagen30210חרוזים הנדרשים לטיהור 6xHis מתויג חלבוני MAP65
OptomicroscanNikon405 nm מערכת לייזר שיכולה למקד את הלייזר בכל צורה רצויה של אזור עניין
PEM80מאגר בסיס פילמור טובולין ניטרלי לתמיסה העשויה מצינורות K של 80 מ"מ, pH 6.8, 1 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ EGTA, מאוחסן בטמפרטורה של 4° C עד שנה.
סרט דו צדדי קבוע3M - סקוטש34-8724-5691-7לתאי ניסוי
צלחת פטריפישרFB0875713לצינורות תא לח
SigmaP7643-100Gמרכיב בסיס חיץ טובולין
Pluronic-F127SigmaP2443-250Gבלוק-קופולימר עם שני בלוקים של תחמוצת פוליאתילן הידרופילית (PEO) בקצוות ובלוק מרכזי הידרופובי של ציפוי משטח הידרופובי של תחמוצת פוליפנילן (PPO) שאנו משתמשים בו כדי למנוע קשירת חלבון למשטח. Pluronic-F127 נרכש כאבקה (סיגמא) ומומס לתמיסה של 5% (w/v) ב-ddH2O בן לילה. לאחר המסה, ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שנה.
פוליאתילן גליקולאפימטריקס בע"מ19966 500 גרםחומר צפיפות המשמש ליצירת כוחות דלדול כדי להעלות את הטקטואידים לפני השטח ולסייע בארגון מיקרו-צינוריות. אנו יוצרים פתרון של 5% (w/v) של 100 kDa PEG ב-PEM80. הפתרון מאוחסן ב-4° C עד שנה ומונח על הנדנדה לפני השימוש. הוא צמיג, לכן אנו ממליצים להשתמש בפיפטה עם תזוזה חיובית כדי לעבוד איתו.
פיפטה תזוזה חיוביתEppendorfלפיפטינג נוזלים צמיגים
מתלים לכיסוייםמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72240להכנת תאי ניסוי - טיפול בכוסות כיסוי
מקרר 4° Cפישרברנדלאחסון ריאגנטים
טובולין עם תוויתשלד ציטולוגיTL590Mליופיליזציה עם תווית רודמין ממוח חזיר נרכש (שלד ציטו) ומאוחסן ב -80° C עד ללחות ב-PEM80 ושימוש עד שנה.
חלבון טובוליןCytoskeletonT240טובולין ליופיל 99% טהור ללא תווית ממוח חזיר נרכש (Cytoskeleton) ומאוחסן ב-80° C עד ללחות ב-PEM80 ושימוש עד שנה.
UV-OzoneJelightדגם 342להכנת תאי ניסוי - טיפול במשקפי כיסוי
StackregBiomedical Imaging Grouphttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/תוסף לרישום נתוני סדרות זמן להסרת סחיפה
TurboregBiomedical Imaging Grouphttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/תוסף לרישום נתוני סדרות זמן להסרת סחיפה
חממה

מקורות

  1. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
  2. Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
  3. Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
  4. Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
  5. Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
  6. Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
  7. Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
  8. Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
  9. Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
  10. Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
  11. Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. Principles of Condensed Matter Physics. , Cambridge University Press. (1995).
  12. Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).
  13. Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
  14. Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
  15. Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
  16. Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
  17. Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
  18. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).
  19. MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
  20. She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
  21. Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
  22. Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
  23. Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
  24. Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
  25. Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
  26. Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
  27. Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
  28. Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).
  29. Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
  30. Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022).
  31. Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903(2021).
  32. Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
  33. Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
  34. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  35. Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
  36. McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MAP65
הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.