מאמר שיטה

אסטרטגיית גליקומיקס לא ספציפית מבוססת פרוטאוליזה עבור גליקופרוטאינים חיידקיים

765 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63977

⸱

30 ביוני 2022

 ,  , 
1Human Health Therapeutics Research Center, National Research Council Canada

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג שיטה לניתוח גליקומיקה של גליקופרוטאינים על ידי שילוב של עיכול פרונאז E, פרמתילציה וניתוח ספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסוגלת לנתח את כל סוגי הגליקנים המקושרים ל- N, כולל N-גליקנים חיידקיים.

תקציר

גליקוזילציה של חלבון היא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום. פותחו טכניקות רבות לאפיון התפקידים הספציפיים של גליקנים, הקשר בין המבנים שלהם והשפעתם על תפקודי החלבונים. שיטה נפוצה לניתוח גליקנים היא שימוש במחשוף אקסוגליקוזידאז כדי לשחרר גליקנים המקושרים ל-N מגליקופרוטאינים או גליקופפטידים באמצעות פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F). עם זאת, הקשרים בין גליקן לחלבון בחיידקים שונים ואין אנזים זמין לשחרור גליקנים מגליקופרוטאינים חיידקיים. בנוסף, גליקנים חופשיים תוארו גם בתאי יונקים, חיידקים, שמרים, צמחים ודגים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה שיכולה לאפיין את מערכת הגליקוזילציה המקושרת ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני על ידי זיהוי גליקנים מקושרים לאספרגין (Asn) וגליקנים חופשיים שאינם מחוברים לחלבוני המטרה שלהם. בשיטה זו, סך החלבונים מ-C. jejuni עוכלו על ידי Pronase E עם יחס אנזים לחלבון גבוה יותר (2:1-3:1) וזמן דגירה ארוך יותר (48-72 שעות). לאחר מכן טוהרו ה-Asn-גליקנים והגליקנים החופשיים שהתקבלו באמצעות מחסניות פחמן גרפיטיות נקבוביות, פרמתילציה ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

מבוא

חלבון N-גליקוזילציה הוא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום באיקריוטים1. N-גליקנים ממלאים תפקיד חיוני בקיפול חלבונים ויש להם גם השפעה על מיון חלבונים בתעבורה ביוסינתטית2. ספקטרומטריית מסה נמצאת בשימוש נרחב בניתוח גליקנים המשתחררים על ידי מחשוף אקסוגליקוזידאז (גליקומיקס). הפפטידים הנותרים נטולי גליקוזיל (גליקופרוטומיקה) שימשו בדרך כלל לזיהוי רצפי הפפטידים הגליקוזיליים באיקריוטים3. הזיהוי של גליקנים המקושרים ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני הצביע על כך ש-N-glycosylation אינו מוגבל לאיקריוטים 4,5,6,7,8. עם זאת, עבור חיידקים, חסרים אקסוגליקוזידאזות או אנדוגליקוזידאזות יעילות לשחרור אוליגוסכרידים לניתוח גליקן.

פותחה גישה חלופית לאפיון אתרי גליקוזילציה ומבני גליקן בגליקופרוטאינים, המבוססת על שימוש בפרוטאוליזה לא ספציפית לעיכול עמוד השדרה של רוב הפפטידים ויצירת פסאודו-אוליגוסכרידים המכילים רק מעט חומצות אמינו. אנזימים שונים שאינם ספציפיים שימשו ליצירת פסאודו-אוליגוסכרידים ונמצא כי Pronase E הציע את העיכול היעיל והניתן לשחזור9. פיתחנו אסטרטגיית גליקומיקה המבוססת על Pronase E לניתוח C. jejuni N-גליקנים 10,11. הפסאודו-אוליגוסכרידים נותחו ישירות על ידי ספקטרומטריית מסה של אלקטרופורזה נימית (CE-MS) ו/או על ידי ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-TOF MS) לאחר פרמתילציה.

כאן, מתוארת שיטה אוניברסלית לניתוח גליקומיקה המשתמשת בעיכול ופרמתילציה לא ספציפיים של Pronase E כדי לחקור גליקוזילציה מהפתוגן הרירי C. jejuni. שיטה זו מסוגלת לאפיין גליקנים מקושרים ל-N המתבטאים הן על ידי מערכות אוקריוטיות והן על ידי חיידקים והיא שימושית גם בזיהוי מתווכים חדשים במסלולי גליקוזילציה מקושרים ל-N.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית של C. jejuni 11168H ומיצוי סך החלבונים

הערה: C. jejuni 11168H הוא נגזרת משובטת היפרמוטלית של NCTC 1116812.

  1. התחל את תרבית התאים על ידי החזרת נוזל התא (כ-0.15 גרם, NCTC) עם כ-5 מ"ל של מדיום תרבית מולר-הינטון. השתמש בכמה טיפות של צינור המרק הראשוני כדי לחסן צלחת אגר מולר-הינטון. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות תחת אטמוספירה מיקרואירופילית, כלומר 5% O2, 10% CO2 ו-85% N2.
  2. קצרו מדשאות חיידקים עם 1 מ"ל של מרק עירוי לב מוח (BHI). מדללים את הקציר כדי להגיע לכ-1 x 105 c.f.u./mL עם מרק BHI. לגדל תאים במשך 18 שעות עם טלטול (100 סל"ד) באטמוספירה מיקרואירופילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. קררו את התאים על ידי הנחת הצלחות על קרח למשך 10 דקות וקצרו תאים על ידי צנטריפוגה (4,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס). השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים 2x ב-3 ליטר של 0.1 M Tris-HCl קר כקרח (pH 7.8).
  4. השעו מחדש תאים (10, 8-10,11 תאי C. jejuni) ב-8 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl קר כקרח (pH 7.8) וליזה על ידי סוניקציה (טבלת חומרים). בצע סוניקציה באופן הבא: דופק של 4 שניות, 1 שניות כבוי, דקה אחת בכל פעם ושלוש פעמים בסך הכל. 
  5. צנטריפוגה ב-9,500 x גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולהעביר את הסופרנטנט לצינור אחר. דיאליזה של חלבונים בסופרנטנט 2x כנגד 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
  6. קבע את ריכוזי החלבון באמצעות בדיקת חלבון זמינה מסחרית13 (צריכה להיות בטווח שבין 4 ל-6 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
  7. ממיסים 1 מ"ג חלבונים ב-1 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) ומוסיפים 2.5 מ"ג של Pronase E לתמיסה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, ולאחר מכן הרתחת התמיסה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את האנזים.
  8. אחסן את תמיסת עיכול החלבון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.

2. טיהור באמצעות פחמן גרפיטי נקבובי (PGC)

  1. הפעל מחסניות PGC (100 מ"ג, 5 מ"ל) על ידי הוספת 1 מ"ל של 80% (v/v) אצטוניטריל (ACN) המכיל 0.1% חומצה טריפלואואצטית (TFA) וחזור על הפעולה פעמיים.
  2. שטפו את מחסנית ה-PGC עם 1 מ"ל מים פי 3.
  3. טען את עיכול הפרונאז E מ-1 מ"ג חלבון על PGC (הנפח תלוי בריכוז החלבון).
  4. שטפו את המחסנית פי 3 עם 1 מ"ל מים בכל פעם כדי להסיר מלחים.
  5. הסר Asn-גליקנים עם 1 מ"ל של 25% ACN ב-0.1% TFA, ואחריו 1 מ"ל של 50% ACN ב-0.1% TFA.
  6. אסוף את שני השברים וייבש את הדגימות עם רכז הוואקום המקורר (טבלת החומרים) להמשך עיבוד.
    הערה: השתמש בממיסים בדרגת MS לטיהור Asn-גליקן.

3. פרמתילציה של Asn-glycans

  1. יש להמיס Asn-גליקנים מיובשים עם 100 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בשפופרת של 1.5 מ"ל.
  2. הכן תמיסת DMSO-NaOH על ידי ערבוב שני כדורים של NaOH עם 2 מ"ל של DMSO. הוסף לדגימה 200 מיקרוליטר של תמיסת DMSO-NaOH ו-100 מיקרוליטר של מתיל יודיד.
  3. סוגרים היטב את הצינור ומערבבים בחום של 3,000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בעזרת מערבל מערבולת.
  4. מרווים את הפרמתילציה על ידי הוספת 1 מ"ל מים.
  5. יש להוסיף 1 מ"ל של כלורופורם ומערבולת למשך דקה אחת כדי לחלץ Asn-גליקנים שעברו מתילציה.
  6. צנטריפוגה ב-9,000 x גרם למשך 3 דקות. הסר את הסופרנטנט ושמור על שלב הכלורופורם התחתון עם Asn-גליקנים פרמתיליים.
  7. שוטפים את השכבה האורגנית על ידי הוספת 1 מ"ל מים עם מערבולת למשך דקה. צנטריפוגה ב-9,000 x גרם למשך 3 דקות והסר את הסופרנטנט. חזור על הפעולה פעמיים.
  8. מניחים את השלב האורגני במכסה אדים ונותנים לו להתייבש עם זרם חנקן בטמפרטורת החדר.
  9. אחסן Asn-גליקנים פרמתיליים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח ספקטרומטרי מסה.

4. ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרוספריי (ESI-MS) וניתוח ESI-MS/MS

  1. ממיסים Asn-גליקנים פרמתיליים ב-20 מיקרוליטר של 50% 2-פרופנול במים (v/v).
  2. בצע ניתוח CE-ESI-MS באמצעות נימי סיליקה חשופים בגודל 90 ס"מ עם זרימת נדן של 50% 2-פרופנול במים ב-1 מיקרוליטר לדקה.
    הערה: CE-MS היא מערכת המשלבת אלקטרופורזה נימית (CE) וספקטרומטריית מסה. CE מפרידים יונים על סמך ניידות היונים שלהם. בפרוטוקול זה, מערכת CE משמשת להכנסת נפח זעיר של דגימות וביצוע התפלה מקוונת.
  3. הגדר את מתח ה-ESI ל-5 קילו וולט במצב חיובי.
  4. טען דגימות Asn-glycan פרמתילציה ב-500 mbar למשך 0.2 דקות, המקביל לכ-100 nL.
  5. רכוש נתוני MS באמצעות ספקטרומטר מסה (טבלת חומרים) באמצעות פרמטרי הרכישה הבאים.
    1. עבור MS מלא, הגדר את זמן השהייה ל-2.0 ms לכל שלב של יחידה של 0.1 m/z. בניסויי MS2 ו-MS3 עם סריקת יונים משופרת (EPI), הגדר את מהירות הסריקה ל-4,000 Da/s, עם לכידה Q0. הגדר את זמן מילוי ההשמנה כדינמי ואת הרזולוציה של Q1 כיחידה. עבור ניסויי MS3 , הגדר את מקדם העירור כדי לוודא שנבחר רק השיא המונואיזוטופי עבור מבשר טעון יחיד. הגדר את זמני העירור ל-100 אלפיות השנייה.

5. ניתוח גליקנים פרמתילציה על ידי MALDI-TOF MS

  1. ממיסים Asn-גליקנים פרמתיליים ב-10 מיקרוליטר של 50% מתנול/מים (v/v).
  2. מערבבים 1 מיקרוליטר של Asn-גליקנים מומסים עם 2 מיקרוליטר של תמיסת חומצה 2,5-דיהידרוקסיבנזואית (10 מ"ג/מ"ל ב-50% אצטוניטריל/מים (v/v)).
  3. הוסף 1 מיקרוליטר של דגימה מעורבת לצלחת MALDI של 384 בארות והמתן עד שהדגימה תתייבש לחלוטין.
  4. הכנס את הצלחת לספקטרומטר מסה MALDI-TOF המצויד בלייזר חנקן פועם (337 ננומטר). הגדר את מתח ההאצה ל-20 קילו וולט במצב חיובי.
  5. הגדר את עוצמת הלייזר לקנה מידה שרירותי של 6,000 ורכוש נתונים במצב רפלקטרון חיובי מ-m/z 1,000 עד 5,000.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטה המבוססת על השילוב של עיכול פרונאז E ופרמתילציה יושמה על ניתוח N-glycan מתמציות חלבון כוללות של C. jejuni 11168H. איור 1 מציג תרשים זרימה של הליך הניסוי. בעיכול טיפוסי, היחס בין אנזים לגליקופרוטאין נקבע בין 1:100 ל-1:20. כאן, היחס בין פרונאז E לחלבון הוגדל ל-2:1-3:1 ונעשה שימוש בעיכול ארוך יותר כדי להשיג עיכול פליטה על ידי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, ה-Asn-גליקנים מעיכול הפליטה טוהרו על ידי PGC ועברו פרמתילציה בגישת DMSO-NaOH שגרתית. ניתוח MALDI-MS של מעכלי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול ליישום אסטרטגיית גליקומיקה אוניברסלית זו. השלב הקריטי הראשון הוא השלמת עיכול הפליטה. שיטה זו תלויה מאוד בהשלמת עיכול Pronase E. לכן חיוני להשתמש בזמן עיכול ארוך וביחס אנזימים לחלבון גבוה. בדרך כלל, מומלץ להשתמש ביחס של 2:1-3:1 עבור פרונאז E/חלבון, וזמן דגירה של 48 שעות. הוכח כי עיכול פליטה מוצע זה ייצר את הגליקנים עם חומצת אמינו אחת כמרכיב העיקרי10. יש לטהר את המוצרים מעיכול הפליטה על ידי מחסנית PGC. הוא לא רק שמר על גליקנים אלא גם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים לקנת צ'אן, דיוויד ג'יי מקנלי, האראלד נוטהאפט, כריסטין מ. שימנסקי, ז'אן-רוברט בריסון ואלאונורה אלטמן על הסיוע והדיונים המועילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB),סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)149357
2-פרופנולפישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה)AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (קונקורד, קנדה)ספקטרומטר מסה
4800 MALDI-TOF/TOFApplied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה)ספקטרומטר מסה
אצטוניטריל ( ACN)פישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה)A996-4
עירוי לב מוח (BHI) מרקסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)5121
C18 מחסניות ספטמבר-פאקווטרס (מילפורד, מסצ'וסטס
WAT036945 כלורופורםסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)CX1054
DifcoFisher Science (אוטווה, אונטריו, קנדה)DF0037-17-8Fisher Science
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)276855
צינור אפנדורףבקוטר (מיסיסאוגה, אונטריו, קנדה)SPE155-N
קרחוני אצטי חומצהסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)A6283
מתנולפישר סיינטיפיק, אוטווה, אונטריו, קנדה)A544-4
מתיל יודידסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)289566
מחסנית PGCתרמו מדעית (וולת'אם, מסצ'וסטס)60106-303פרונאז פחמן גרפיטי נקבובי
Eסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)7433-2
ערכת בדיקת חלבוןBio-rad (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)5000001
רכז ואקום בקירורThermo Scientific (Waltham, MA)SRF110P2-230
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)367176
מעבד אולטרסאונד סוניקטורMandel Scientific (גואלף, אונטריו, קנדה)XL 2020
חומצה טריפלואצטית (TFA)פישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה)A11650
Tris-HClסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)T3253
).

מקורות

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NPronase EAsn
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים