סינתזה של ננו-ג'לים המגיבים לגירויים באמצעות קרוסלינקינג מימי חד-שלבי וקו-ננופילמריזציה

סיכום

ננו-ג'לים הם פלטפורמת ננו-חלקיקים מצוינת ורב-תכליתית לאספקת תרופות ביולוגיות. ננו-ג'לים פולימריים מבוססי פולי(אתילן) המגיבים לגירויים, המסוגלים לעטוף מטענים מבוססי חלבון, סונתזו באמצעות אסטרטגיית קו-פילמור צולבת בת שלב אחד בתנאים מימיים. הייצור והאפיון האופטימליים של ננו-חלקיקים חדשניים אלה מוצגים כאן.

תקציר

ננו-ג'לים המורכבים מננו-חלקיקים פולימריים מוצלבים פותחו עבור מתן טיפולים כימיים וביולוגיים רבים, הודות לסינתזה הרב-תכליתית שלהם מלמטה למעלה ולתאימות הביולוגית שלהם. בעוד שיטות שונות שימשו לסינתזה של ננו-ג'ל עד כה, מעט מאוד השיגו זאת ללא שימוש בממסים אורגניים קשים או בטמפרטורות גבוהות שעלולות לפגוע בשלמות המטען הביולוגי. לעומת זאת, המתודולוגיה המוצגת כאן משיגה סינתזה של ננו-ג'לים עתירי חלבון בגודל תת-100 ננומטר תוך שימוש בתנאי תגובה מתונים. כאן, אנו מציגים שיטה לאנקפסולציה לא קוולנטית של מטענים מבוססי חלבון בתוך ננו-ג'לים שסונתזו באמצעות טכניקת קופולימריזציה מבוססת מימית, חד-שלבית וקרוסלינקינג. בטכניקה זו, בתחילה אנו קושרים אלקטרוסטטית מטען מבוסס חלבון למונומר אמוניום רבעוני קטיוני ובו זמנית מצליבים וקו-פולימריים אותו באמצעות אמוניום פרסולפט ו- N,N,N',N',N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE ליצירת ננו-ג'לים הלוכדים את מטען החלבון. הגודל ומדד הפיזור של הננו-ג'לים נקבעים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), בעוד שמורפולוגיית פני השטח מוערכת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM). מסת החלבון הכלואה בתוך ננו-ג'לים נקבעת על ידי חישוב יעילות האנקפסולציה. יתר על כן, יכולת השחרור המבוקר של הננו-ג'לים באמצעות פירוק הדרגתי של אלמנטים מבניים המגיבים לחמצון-חיזור מוערכת גם בבדיקות ביו-רדוקציה. אנו מספקים דוגמאות לנתוני אופטימיזציה של ננו-חלקיקים כדי להדגים את כל האזהרות של סינתזת ננו-ג'ל ואפיון באמצעות טכניקה זו. באופן כללי, ננו-ג'לים בגודל אחיד התקבלו עם גודל ממוצע של 57 ננומטר וערך אינדקס polydispersity של 0.093. הושגה יעילות אנקפסולציה גבוהה של 76%. יתר על כן, הננו-ג'לים הציגו שחרור מבוקר של עד 86% מהחלבון העטוף על ידי פירוק הדרגתי של רכיבים חדשים המגיבים לחמצון-חיזור בנוכחות גלוטתיון במשך 48 שעות.

מבוא

ננו-ג'לים הם הידרוג'לים תלת-ממדיים בגודל תת-מיקרוני עם מבני רשת פולימריים מוצלבים שיכולים להכיל כמויות גדולות של נוזלים בתוך מעטפת הליבה שלהם מבלי להשפיע על שלמותם המורפולוגית¹. באופן כללי, ננו-ג'לים מסונתזים על ידי פילמור של מונומרים פונקציונליים באמצעות הצלבה פיזיקלית או כימית במערכות קולואידיות הטרוגניות, כגון מיקרואמולסיות הופכיות^של מים בשמן ^2,3. קופולימרים אמפיפיליים יכולים להתאסף בעצמם למבנים ננומטריים בסביבות מימיות. עם זאת, יש לייצב אותם באמצעות אסטרטגיות הצלבה כימיות הכוללות דיסולפידים או צימוד מבוסס אמיד, כימיית קליק, או שניתן לגרום להם פיזית (אסטרטגיות הידרופוביות, אלקטרוסטטיות או קשרי מימן) או לגרום לפוטו-אינדוקציה⁴. בין אסטרטגיות אלה, הרכבה עצמית פיזית של פולימרים ואחריה קרוסלינקינג כימי דווחה כטכניקת ייצור ננו-ג'ל מוצלחת⁵. בעוד שמבחינה היסטורית, הננו-ג'ל הראשון הוצג בשנות ה-90 על ידי Vingradov et ^al.6, Akiyoshi et ^al.7 ו-Lemieux et ^al.8, לאחרונה פותחו ונחקרו מגוון ננו-ג'לים חכמים המורכבים מפולימרים טבעיים וסינתטיים כאחד עבור יישומים ביו-רפואיים מגוונים⁹.

לננו-ג'לים יכולת שימור מטען נרחבת, שטח פנים גדול, יציבות in vivo וכן תכונות כימיות ומכניות הניתנות להתאמה אישית¹⁰. הסינתזה של ננו-ג'לים היא גם ניתנת להרחבה ויכולה להיות מבוססת על מים. בנוסף, תכולת המים המשופרת של הננו-ג'לים הופכת אותם לנשאים יעילים של מטענים ביולוגיים רגישים¹¹. יתר על כן, שטח הפנים הגבוה יכול לספק צרכים ביולוגיים מרובים, ובכך מאפשר חיבור של אופני מיקוד כדי לאפשר מיקוד פעיל. יש לציין כי הרבגוניות של תכנון ננו-ג'ל מאפשרת שימוש במגוון רחב של מונומרים המגיבים לגירויים המאפשרים שליטה מדויקת בתכונות הפיזיקוכימיות שלהם⁹. יכולת הנדסית ייחודית זו מאפשרת שיפור רציונלי של תכנון ננו-ג'ל, דבר שקשה להשיג עם ליפוזומים, מיצלים או פולימרוזומים^12,13 בשימוש קונבנציונלי. על ידי שילוב moieties מגיבים לגירויים בתוך מונומרים שתוכננו במיוחד, ננו-ג'ל יכול להיות מהונדס כדי להפעיל את השחרור המבוקר של המטען שלהם בתגובה לגירויים פיזיולוגיים רלוונטיים שונים, כגון pH, תנאי חמצון-חיזור, אנזימים וכו '^9,14. ננו-ג'לים חכמים כאלה שימושיים יותר מננו-ג'לים רגילים, שכן הם בעלי יציבות מעולה לזרימת דם ממושכת, והם יכולים לעמוד בתנאים פיזיולוגיים כדי לשמור על שלמות המטען שלהם ולתווך את שחרורו המבוקר באתרי המטרה הרצויים¹⁵. ואכן, בשל אופיים הרב-תכליתי, ננו-ג'לים צברו תאוצה בזירה הביו-רפואית, עם התקדמות ניכרת בפיתוח ננו-ג'לים מגיבים לגירויים עבור יישומים תרנוסטיים ואבחוניים רבים ^2,16,17.

תרופות ביולוגיות יכולות לייצג קטגוריה של מוצרים פרמצבטיים המורכבים מחלבונים, פפטידים ו/או חומצות גרעין וחוללו מהפכה בנוף הטיפולי בשל הסלקטיביות יוצאת הדופן שלהם, ובכך הפכו לקבוצה הצומחת ביותר של תרופות¹⁸. ואכן, השוק הצומח של תרופות כאלה ניכר בעלייה התלולה באישורם על ידי איגוד התרופות הפדרלי בארה"ב (FDA), שם ביולוגים היוו ~40% מסך אישורי התרופות, בשנת 2023¹⁹. בנוסף לספציפיות ולעוצמה שלהם, תגליות מהירות של מטרות תרופות חדשות, תהליכים ביו-הנדסיים יעילים יותר וידע רב יותר על גורלם in vivo של טיפולים אלה הובילו לשימוש מוגבר בהם²⁰. תרופות ביולוגיות מסורתיות כוללות RNA מפריע, חלבונים חלופיים, ציטוקינים והורמונים המיוצרים בדרך כלל באמצעות טכנולוגיית DNA רקומביננטי²¹. מאז אישור אינסולין רקומביננטי אנושי בשנת 1982, פותחו תרופות ביולוגיות למצבים רבים, כולל סרטן (למשל, trastuzumab, avelumab), מחלות מעי דלקתיות (למשל, adalimumab, certolizumab) ומחלות גנטיות נדירות (למשל, mipomersan, myozyme, aldurazyme, fabrazyme)²¹. בעוד הספציפיות הגבוהה של האינטראקציות של ביולוגים עם המטרות שלהם אמורה תיאורטית לקזז כל השפעות מחוץ למטרה, מספר חששות קליניים הופיעו עם השימוש בהם הקשורים לתופעות לוואי לא רצויות²². תופעות לוואי אלה ניתן לקבץ לשתי קטגוריות, כולל פרמקולוגיה מוגזמת (גירוי יתר של מטרות) ואימונוגניות. נוסף על כך, זמן מחצית החיים הקצר שלהם, הזמינות הביולוגית המוגבלת, הנזק לפרוטאזות, חיי המדף הקצרים ותהליכי הייצור היקרים מגבילים את היתרונות הטיפוליים שלהם²¹. שיטות קונבנציונליות להקלה על בעיות אלה, כרוכות בשינוי קוולנטי של תרופות ביולוגיות אלה שעלולות לפגוע בתפקודן, ולכן, יעילות²³. לחלופין, גישת הננו-רפואה לעטוף מטענים טיפוליים יכולה להעניק יתרונות רבים לתכונות פרמקולוגיות, והכי חשוב, מיקוד פסיבי לאתר המודלק באמצעות אפקט החלחול והשימור המשופר (EPR)²⁴. יתרונות אחרים הקשורים לננו-חלקיקים יכולים לכלול זמני זרימת דם משופרים, קצב פינוי מופחת, גמישות רבה יותר בפורמולה, חדירות משופרת של כלי הדם וספיגת תאים²⁵. בעוד מגוון עצום של ניסוחים ננו-חלקיקים נחקרים כיום עבור משלוח של מטענים ביולוגיים, מעטים יכולים לחקות את הרב-תכליתיות של ננו-ג'לים. ואכן, ננו-ג'לים עולים על יכולות ההעמסה המושגות על ידי ננו-חלקיקים מבוססי ליפוזומלים ומיצלה, והם מפגינים יציבות קולואידית גדולה יותר מרוב הננו-חלקיקים האי-אורגניים. ככאלה, ננו-ג'לים מהווים פלטפורמה רבת ערך למתן טיפולים ביולוגיים שונים.

בעבר סיפקנו בהצלחה אנזים נוגד חמצון בתוך ננו-ג'לים פולימריים צולבים חדשניים המגיבים למטאלופרוטאינאז, כאשר אסטרטגיית האנקפסולציה הקלה שבה נעשה שימוש שמרה על הפעילות הביולוגית של החלבון עם שחרור²⁶. בעבודה זו, אנו מדגימים את הסינתזה הממוטבת של ננו-ג'לים המגיבים לחמצון-חיזור עבור העברת מטע"דים מבוססי חלבון. יש לציין כי המתודולוגיה הסינתטית מאפשרת סינתזת ננו-ג'ל בתנאים מתונים כדי לתמצת את המטען הרצוי, ללא שימוש בממיסים אורגניים קשים או בטמפרטורות גבוהות. ניצלנו את הומאוסטזיס החיזור בסביבה התוך-תאית כדי לווסת את שחרור המטען העטוף^27,28. בדרך כלל, נוגד החמצון גלוטתיון (GSH) המצוי בשפע טבעי שולט בפוטנציאל חמצון-חיזור חוץ-תאי ותוך-תאי, שם ריכוזו נע בין 2-20 מיקרומטר ל-1-10 מילימול, בהתאמה^29,30. עד כה, דווח על ננו-חלקיקים רבים הרגישים לחמצון-חיזור, מה שהופך זאת לאסטרטגיה מוכחת ואמינה המאפשרת שחרור מבוקר של תרופות in vivo^27,28. ואכן, קשרים דיסולפידים הותקנו בתוך ננו-חומרים פולימריים באמצעות קרוסלינקרים המכילים דיסולפיד^31,32, הרכבה עצמית של פולימרים מתכלים ממונומרים המכילים דיסולפיד³³, ותרופות פולימר מגיבות חמצון-חיזור או מצומדות תרופות/פולימרים^34,35. לכן, מחקר זה חוקר את שילובו של קרוסלינקר דיסולפיד ייחודי ורגיש מאוד ל-GSH בתוך ננו-חלקיקים פולימריים, ובכך מאפשר שחרור מבוקר של מטען חלבוני עטוף.

במחקר זה, תכנון ננו-ג'ל התמקד בקריטריונים הבאים לטיפול בספציפיות ובהעברת מטע"ד: גודל קטן (~100 ננומטר) והתפלגות גודל אחידה (אינדקס פיזור פולי-פיזור (PI)<0.3) כדי להבטיח חדירה יעילה של האנדותל ויציבות in vivo ²⁷; אנקפסולציה יעילה של מטען חלבון, ושחרור מבוקר של מטען בתגובה ל-GSH. אנו מדווחים על סינתזה של ננו-ג'לים צולבים המגיבים ל-GSH, אשר הדגימו ננו-חלקיקים הומוגניים בגודל תת-100 ננומטר, עם יעילות אנקפסולציה של 76% של המטען החלבוני הרצוי.

פרוטוקול

1. סינתזה של crosslinker מגיב חמצון-חיזור

1. הוסף 2-aminoethylmethacrylate hydrochloride (44.79 מ"ג, 0.270 mmol) ו 0.063 מ"ל של triethylamine ל 3 מ"ל של dichloromethane נטול מים ולאפשר לערבב במשך 20 דקות תחת גז אינרטי N₂ בבקבוק 25 מ"ל עגול תחתית.
2. להמיס 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester (100 מ"ג, 0.045 mmol) ב 1 מ"ל של dichloromethane נטול מים ולהוסיף לצלוחית.
3. מוסיפים 4 מ"ל של dichloromethane נטול מים לצלוחית. עוטפים את בקבוק התגובה ברדיד אלומיניום ומשאירים לערבב מתחת ל-N₂ בטמפרטורת החדר.
4. אשר את היווצרות המוצר על-ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה. ודא הפניות נכונות לחומר המוצא תוך אישור היווצרות המוצר בשיטה זו.
   1. כרומטוגרפיה בשכבה דקה היא שיטה מבוססת זיקה המשמשת להפרדת תרכובות רצויות מתערובת התגובה. כאן, השתמש בצלחת סיליקה קוטבית מאוד סופג כמו שלב נייח. זהו את דגימת חומר המוצא ואת דגימת תערובת התגובה בקצה אחד של צלחת הסיליקה והניחו במאונך לתוך זכוכית סגורה עם האלואנט (שלב נייד: 5% מתנול: דיכלורומתאן).
   2. על ידי פעולה נימית, הפאזה הניידת נעה במעלה לוח הסיליקה ותרכובות הדגימה נודדות למרחקים משתנים בהתאם לזיקתן לשלב הנייח והנייד. כאשר חזית הממס חצתה 3/4^מהצלחת , הסר את הצלחת וייבש אותה. התרכובות המופרדות מופיעות ככתמים על הלוח. כמת את גורם השימור (R_f) של התרכובת הרצויה כמרחק שעבר התרכובת/מרחק שעבר הממס. כאן, R_f של המוצר היה 0.35. אור UV או מכתים ניתן להשתמש כדי לדמיין את כתמים (permanganate אשלגן).
5. רכזים את התערובת בוואקו ומטהרים באמצעות כרומטוגרפיה של עמוד הבזק (תערובת איזוקרטית של 5% מתנול: דיכלורומתאן)³⁶. הכניסו את תערובת התגובה לחלק העליון של עמוד זכוכית עמוס בסיליקה (פאזה נייחת) ולאחר מכן נמלטו עם מערכת הממס (פאזה ניידת)³⁶. אסוף את כל השברים והבדיקה באמצעות TLC כדי להבחין בין שברי המוצר באמצעות ערך R_f שנקבע קודם לכן.
6. רכז את השברים המטוהרים על ידי אידוי הממס באמצעות מאייד סיבובי (טמפרטורה: 40 מעלות צלזיוס), הגדר את לחץ הוואקום ללחץ אטמוספרי כדי להסיר תחילה דיכלורומתאן רותח נמוך יותר. כאשר רמת הממס מפסיקה לרדת, הגדר את לחץ הוואקום ל -337 mbar כדי להסיר מתנול ולהשיג שמן צהוב בהיר, אשר לאחר מכן יהיה נתון לאפיון נוסף כדי לאשר היווצרות המוצר³⁷.
7. בצע ניתוח פורייה טרנספורמציה אינפרא אדום (FT-IR)³⁸, ¹H NMR (בדימתיל-סולפוקסיד deuterated (DMSO-d ₆)⁾³⁹, ¹³C NMR³⁹ וניתוח זמן ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-ToF)⁴⁰ כדי לאשר את היווצרות המוצר לפני ביצוע השלבים הבאים.
   1. לניתוח FT-IR, יש להעמיס 1 מ"ג של השמן על המכשיר כדי לקבל את הספקטרה.
   2. עבור ניתוחי NMR, יש להמיס מחדש 10 מ"ג של המוצר ב-0.75 מ"ל של ממס ה-NMR הרלוונטי, להעביר לצינור NMR ולאטום היטב כדי למנוע דליפה. טען את הדגימה על מכשיר NMR, ולאחר מכן הספקטרום מתקבל³⁹.
   3. לניתוח ספקטרומטריית מסות, חותמים 1 מ"ג של המוצר בבקבוקון, מתמוססים ב- DMSO ומעמיסים על המכשיר.
      הערה: ניתוח אינפרא אדום מספק מידע לגבי הקבוצות הפונקציונליות העיקריות במוצר הרצוי, כלומר מתיחות קרבוניל (C=O) המזוהות על ידי השיא החד ב 1650 ^cm-1 מציין את היווצרות הקשר amide, ובכך מדגיש היווצרות המוצר. ה- ¹H NMR וה- ¹³C מספקים מידע על הסביבה הכימית ובכך ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את ההרכב הכימי של המוצר הרצוי באמצעות זיהוי סביבות כימיות הקיימות בתרכובת. לבסוף, השימוש בספקטרומטריית מסות יכול לאמת את המסה המדויקת של המוצר הרצוי.

2. בדיקת מחשוף של קרוסלינקר דיסולפיד עם גלוטתיון

1. יש לדגור על הקרוסלינקר דיסולפיד (לריכוז סופי של 4.55 מ"ג/מ"ל) עם החומר המחזר גלוטתיון (סופי [GSH]: 10 מ"ל), לנפח סופי של 1 מ"ל, למשך 24 שעות בבקבוקון זכוכית של 1.5 מ"ל.
2. כדי לאשר את המחשוף של המקשר דיסולפיד, שלח את הבקבוקון לניתוח MALDI-ToF^26,40.

3. סינתזת ננו-ג'ל המגיבה לחמצון-חיזור

1. ודא שכל כלי הזכוכית שישמשו לתגובה נקיים מאבק על ידי שטיפה במים מסוננים (0.20 מיקרומטר) שעברו דה-יוניזציה ולאחר מכן ייבוש כלי הזכוכית באמצעות אוויר דחוס שניתן לגשת אליו דרך כלי השירות לאוויר דחוס בצד האדים. חבר פייה מאובטחת לשקע האוויר הדחוס כדי להקל על הנגישות. החזק את הבקבוקון היטב ומקם את הזרבובית לתוכו. הפעל את האוויר הדחוס, שחרור זרם מבוקר לתוך הבקבוקון. יש לבחון את התהליך כדי להבטיח ייבוש יעיל, ולבדוק אם נותרו מזהמים או לחות.
2. הכינו בקבוקון זכוכית של 10 מ"ל על ידי מילויו במים נטולי יונים, ואטמו את הבקבוק במחיצת גומי. נטרלו את החמצן של המים על ידי בעבוע N₂ דרכם במשך 30 דקות לפחות לפני תחילת התגובה. כדי לעשות זאת, למלא בלון עם גז N₂ ולחבר מחט לבלון; הניחו אותו על המחיצה והשתמשו במחט כדי לחדור את מחיצת הגומי ולאפשר זרימת N₂ . חבר מחט יציאה לבקבוק כדי להבטיח זרימה קבועה של N₂.
3. יש להמיס אלבומין בסרום בקר (BSA; 2 מ"ג, 30 ננומול) או BSA עם תווית Cy7 (2 מ"ג, 30 ננומול) ב-1 מ"ל של מים נטולי חמצון ולהוסיף לבקבוקון זכוכית נקי אחר של 10 מ"ל.
4. הוסף [2-(acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium כלוריד (AETC) פתרון (12.00 מ"ג / 10.86 μL, 0.060 mmol ) לבקבוק ואטם אותו באמצעות מחיצת גומי אחרת. יש לוודא שתערובת התגובה נשמרת תחת זרימה קבועה של גז N₂ ולערבב במשך 30 דקות.
5. ממיסים אקרילאמיד (9.21 מ"ג, 0.13 מילימול) ב 1 מ"ל של מים deionized deoxygenated ולהוסיף לתערובת בבקבוקון.
6. להמיס crosslinker דיסולפיד (4.44 מ"ג, 0.004 mmol) ב 1 מ"ל של מים deionized ולהוסיף לתערובת בבקבוקון. שוטפים את התערובת בגז N₂ למשך 20 דקות.
7. ממיסים סודיום דודציל סולפט (2 מ"ג, 0.007 מילימול) ב-1 מ"ל מים נטולי חמצן ומוסיפים לתערובת באמצעות מזרק סמוק גז N₂ ומערבבים את התערובת במשך 30 דקות.
   הערה: על ידי שטיפת המזרק עם N₂ אנו ממזערים את החשיפה של תערובת התגובה לחמצן באטמוספירה אשר יכול לעכב את תגובת פילמור רדיקלי.
8. הוסף N,N,N',N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (1.5 μL, 0.010 mmol) ותן לתערובת התגובה deoxygenate במשך 3 דקות תחת גז N₂ .
9. להמיס אמוניום persulfate (1 מ"ג, 0.004 mmol) ב 1 מ"ל של מים deoxygenated deionized ולהוסיף לתערובת התגובה. ודא כי גז N₂ מבעבע דרך תערובת התגובה במשך 10 דקות.
   הערה: אם שלב החיבור N₂ מושמט, סביר להניח שייווצרו חלקיקים לבנים בצלוחית התגובה. מדובר בחלקיקים ו/או אגרגטים גדולים יותר שיכולים לבלבל כל אפיון נוסף.
10. אטמו את הבקבוק תחת אטמוספירה N₂ והשאירו לערבוב במשך 3 שעות ו-30 דקות בטמפרטורת החדר.
11. כדי לסיים את התגובה, להסיר את החותם מן הבקבוק ולתת את תערובת התגובה לערבב לפחות 10 דקות. זה יחשוף את תערובת התגובה לרמות אטמוספריות של גז O₂ , אשר לאחר מכן ירווה את כל הרדיקלים שנותרו בתערובת התגובה. התגובה מסתיימת כאשר התערובת מקבלת מראה אטום כחול ברור.
12. על מנת לטהר את הננו-ג'לים, הוסף את תערובת התגובה ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 15 מ"ל (100 kDa MWCO) והוסף מים נטולי יונים, כדי למלא את היחידה הצנטריפוגלית. צנטריפוגה את תערובת התגובה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות. פעולה זו תסיר כימיקלים שלא הגיבו (או מטען לא מכוסה) הקטנים מ-100 kDa ותרכז את דגימת הננו-ג'ל.
13. ברגע שמפלס המים ביחידה הצנטריפוגלית יורד, מוסיפים 2 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה כדי לדלל את דגימת הננו-ג'ל וצנטריפוגה כדי לרכז את המוצר. חזור על שלב זה 3x.
14. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 2-8°C כדי למנוע את התפרקות החלבון העטוף.
15. בצע ניתוח FT-IR ו- ¹H NMR (בדימתיל סולפוקסיד מנוטרל (DMSO-d₆)) כדי לאשר פילמור^39,41. כדי להכין את הדגימה, יבש בהקפאה 1 מ"ל של תמיסת ננוג'ל בבקבוקון 1.5 מ"ל. תהליך הייבוש בהקפאה כולל הקפאת הדגימה ולאחר מכן מריחת ואקום כדי להסיר את הממס הקפוא באמצעות סובלימציה, תוך השארת שאריות אבקה. לאחר ייבוש בהקפאה, יש להמיס מחדש את הדגימה בממס ה-NMR הרלוונטי, להעביר לצינור NMR ולאטום אותה היטב. טען את הדגימה למכונת NMR, כמתואר לעיל³⁹. עבור ניתוח FT-IR, יש להעמיס 1 מ"ג של האבקה היבשה על המכשיר כדי לקבל את הספקטרה.

4. אפיון מורפולוגי ננוג'ל

1. פיזור אור דינמי (DLS)
   הערה: קוטר הידרודינמי (nm), אינדקס polydispersity (PI) ופוטנציאל zeta נמדדו ב- 25 ° C, אורך גל לייזר 632.8 ננומטר וגלאי אותות 173° באמצעות מכונת DLS. בכל ריצה נמדדו 25 מחזורי סריקה משנה.
   1. מדידת גודל הידרודינמי (nm)
      1. הכינו קובטה או תא נימי מקופל חד פעמי על ידי ניקויו במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה. נשפו אוויר דחוס לתוך הקובטה (מתאים למדידות פוטנציאליות של DLS וזטה) כדי להבטיח שהיא נקייה מחלקיקי אבק גדולים.
      2. ממלאים את הקובטה בלפחות 50-100 μL של הדגימה ומדללים ב 750-1000 μL של מים מסוננים deionized. בעת השימוש בקובט פוטנציאלי zeta, ודא כי cuvette כבר מלא דגימה ללא היווצרות בועות, אשר יכול להפריע מדידות.
      3. שים את הקובט בתוך מכשיר DLS, ודא שהוא הוכנס כראוי. לשם כך, פתח את מכסה תא הדגימה של מכשיר ה-DLS. החזק את הקובטה בקצוות העליונים שלה כדי למנוע טביעות אצבע על החלונות האופטיים. ודא שהקובטה יושבת כראוי במחזיק הקובט וודא שהיא ישרה ומיושרת עם הנתיב האופטי של המכשיר. סגור את תא הדגימה כדי למנוע הפרעות לאור הסביבה.
         הערה: מדיית הדילול מסוננת באמצעות מסנן מזרק בגודל נקבוביות 0.45 מיקרומטר.
      4. לחץ כדי להתחיל את מדידת גודל החלקיקים בתוכנת מכונת DLS הרלוונטית.
      5. בחר את התוצאות המתאימות למדגם כדי לקבל את ממוצע z (גודל חלקיקים ממוצע), PI ממוצע, ספירת קילו לשנייה (kcps), פוטנציאל zeta וגרפיקה רלוונטית. ודא שפונקציית המתאם מציגה עקומה סיגמואידית חלקה, מכיוון שהדבר מצביע על מדגם אחיד.
      6. לאחר השלמת הניתוח, הסר את הקובטה מה- DLS.
2. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
   1. הכן דגימות על ידי הנחת 10 μL של תמיסת ננו-חלקיקים (0.077 מ"ג / מ"ל) על רשתות נחושת מצופות פחמן. יש לייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   2. יש לשטוף את הרשתות במים מסוננים ולכתם עם 5 מיקרוליטר של אורניל אצטט מסונן 1% במים למשך 2 דקות.
   3. לאחר השריית חומר הצביעה העודף בנייר פילטר, יבשו את הרשתות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. צלם תמונות TEM למחרת בהגדלה של 45,000x באמצעות מצלמת שדה בהיר.
   4. השתמש בתוכנה שסופקה לעיבוד תמונה (רזולוציה: 2048 x 2048 פיקסלים).

5. כימות של חלבון (BSA) עטוף בתוך ננו-ג'ל באמצעות בדיקת חומצה מיקרו-ביכונכונית (BCA)

1. על פי פרוטוקול בדיקת microBCA (שניתן באתר היצרן), נוצר עקומה סטנדרטית המבוססת על ריכוז חלבון^{מוגדר מראש 42}.
2. לאחר הסינתזה שלהם, לטהר את הננו-ג'לים העוטפים את החלבון באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי של 15 מ"ל עם MWCO של 100 kDa (1000 x גרם, 10 דקות) כמתואר בשלבים 3.12-3.14.
3. לאסוף את התסנין ולנתח באמצעות בדיקת microBCA (פרוטוקול זמין באתר האינטרנט של היצרן). מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר באמצעות קורא לוחות. מכיוון שמדידה זו מתואמת עם ריכוז החלבון הלא עטוף, קבעו את מסת החלבון העטוף. כדי לחשב את יעילות האנקפסולציה (EE) %, השתמש במשוואה הבאה:
   

6. כימות שחרור חלבונים מננו-ג'לים בנוכחות גלוטתיון

1. לדגור 200 μL של 5 מ"ג/מ"ל של ננו-ג'לים טעונים Cy7BSA עם 200 μL של 10 mM גלוטתיון (GSH) ביחידות מסנן צנטריפוגלי 0.5 מ"ל (100 kDa MWCO). מקם את יחידות המסנן באמבט מים כדי לשמור על הטמפרטורה ב 37 °C (77 °F).
2. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 3 דקות כל 10 דקות לפחות 1 שעה - ואז כל 2-8 שעות.
3. לאסוף את התסנין ולהשתמש לניתוח נוסף. שמור על נפח המסנן בתוך יחידות המסנן הצנטריפוגלי על 500 μL על ידי הוספת מים נטולי יונים, או PBS.
4. מדדו את כמות החלבון בתסנין על ידי התייחסות לעקומה סטנדרטית עבור ננו-ג'לים עמוסי Cy7BSA, שם נמדדה ספיגת החלבון הפלואורסצנטי באמצעות מכשיר ננו-טיפה ב-750 ננומטר.
   הערה: ניתן לחשב עקומה סטנדרטית זו על ידי הכנת דילולים סדרתיים של Cy7BSA בטווח של 0 מ"ג/מ"ל עד 2 מ"ג/מ"ל. ערכים המתקבלים מהננו-טיפה ניתנים לאינטרפולציה כנגד עקומת כיול זו כדי לקבוע את יעילות האנקפסולציה.

תוצאות

סינתזה ואפיון של פולי(אתילן גליקול) (PEG) דיסולפיד דיאקרילט crosslinker הקרוסלינקר המגיב לחמצון-חיזור סונתז על-ידי החלפה נוקלאופילית של אסטר N-הידרוקסיסוקסינימיד (NHS) על-ידי 2-אמינואתיל מתקרילט באמצעות יצירת קישור אמיד (איור 1). הסינתזה של המוצר הנדרש אומתה בעיקר על ידי ¹H NMR (איור משלים 1), שבוצע על ידי המסת דגימת המוצר ב- DMSO deuterated, כאשר השילוב של התהודה המתאימה ליחידות האתילן של שרשראות ה- PEG ב- δ3.48-3.53 והשלישיות המתאימות ל...

דיון

הביקוש הגובר לתרופות ביולוגיות ספציפיות למטרה בתעשיית הביו-פרמצבטיקה הניע צורך בטכנולוגיות שיכולות לשפר את הפרופיל הפרמקולוגי in vivo שלהם, תוך מניעת ההידרדרות הפיזיולוגית המהירה שלהם וקיזוז תופעות לוואי לא רצויות. עם זאת בחשבון, הליך פשוט לסינתזה של ננו-ג'לים טעונים בחלבון מתואר. כפי שמצוין בפרוטוקול, יש לסנתז את הקרוסלינקר המגיב לחמצון-חיזור לפני סינתזת ננו-ג'ל. לאחר מכן, מוסיפים את המונומרים העיקריים הנותרים ולאחר הוספת נתרן דודציל סולפט (SDS), פילמור רדיקלים באתרו מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>כימיקלים
2-( אקרילואילוקסי)אתיל]תמיסת טרימתילאמוניום כלוריד	סיגמא אולדריץ'	496146
2-אמינואתיל מתקרילטהידרוכלוריד	סיגמא אולדריץ'	516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester	סיגמא אולדריץ'	671630
אקרילאמיד	סיגמא אולדריץ'	23701
אמוניום פרסולפט	סיגמא אולדריץ'	248614
אלבומין סרום בקר	סיגמא אולדריץ'	B6917
Cy7- מסומן אלבומין סרום בקר	Nanocs	BS1-S7-1
דימתיל סולפוקסיד דוטראט	סיגמא אולדריץ'	547239
דיכלורומתאן	סיגמא אולדריץ'	270997 (נטול מים) ו-D65100
גלוטתיון	סיגמא אולדריץ'	G4251
מתנול	סיגמא אולדריץ'	34860
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	סיגמא אולדריץ'	411019
פוספט מלח חומצי	ThermoFisher	10010023
נתרן דודציל סולפט	סיגמא אולדריץ'	436143
טריאתילאמין	סיגמא אולדריץ'	471283
אורניל אצטט	אגר סיינטיפיק	AGR1260A
<חזק>ציוד הדרוש לסינתזה ואפיון ננו-ג'ל
Amicon יחידות סינון צנטריפוגליות אולטרה-15 (100kDa MWCO)	Merck Millipore	C7715
מצלמה	אולימפוס	Veleta
	Agar Scientific	AGS160
(100kDa MWCO)	ספקטרום מעבדות	11405949
פיזור אור דינמי	מלברן	מייבש Zetasizer Nano Ultra
Freeze	Labconco	WZ-03336-01
ספקטרוסקופיה אינפרא אדום	Agilent	תוכנת Cary 630 FTIR
iTEM	אולימפוס
ספקטרומטריית מסה	, מיקרו-מסה מים,	MALDI microMX, MALDI, Q-ToF
מסנן ממברנה MF-MilliporeTM (0.45/0.2μ m גודל נקבוביות)	Merck Millipore, בריטניה	HAWP04700, GSWP04700
ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA	ThermoFisher	23235
קורא צלחות	בקמן	קולטר-פרדיגמה
נתוני תהודה מגנטית גרעינית פרוטון ופחמן-13	Bruker	400MHz AV-400 NMR ספקטרומטר
מאייד סיבובי	בוצ'י	R-114 מערכת
מחטים חד פעמיות	Sterican	4665643
Suba-Seal  מחיצה	סיגמא אולדריץ'	Z124575
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	פיליפס	ס"מ 100 TEM
ספקטרופוטומטר UV-vis	Nanodrop Nanodrop	One/One C מיקרו-נפח