מאמר שיטה

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

DOI:

10.3791/64015

⸱

29 ביוני 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעידן האימונותרפיה של הסרטן, העניין בהבהרת הדינמיקה של מיקרו-סביבה של הגידול גדל באופן בולט. פרוטוקול זה מפרט טכניקת הדמיה של ספקטרומטריית מסה ביחס לשלבי הצביעה וההדמיה שלה, המאפשרים אנליזה מרחבית מרובבת מאוד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות בטיפולים מבוססי חיסון חוללה מהפכה בטיפול בסרטן ובמחקר. זה עורר ביקוש הולך וגובר לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. למרות שאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית מתאימה לחקר ארכיטקטורת רקמות, היא מוגבלת לניתוח של מספר קטן של סמנים. לעומת זאת, טכניקות כגון ציטומטריה של זרימה יכולות להעריך סמנים מרובים בו זמנית, אם כי מידע על מורפולוגיה של רקמות הולך לאיבוד. בשנים האחרונות, אסטרטגיות מרובות המשלבות ניתוח פנוטיפי ומרחבי התפתחו כגישות מקיפות לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. במאמר זה נדון בטכנולוגיה חדשנית המשלבת נוגדנים בעלי תווית מתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית המתמקדת בשלבים הטכניים בפיתוח ואופטימיזציה של בדיקות, הכנת רקמות ורכישה ועיבוד תמונה. לפני הצביעה, יש לפתח פאנל נוגדנים עם תווית מתכת ולייעל. מערכת תמונה גבוהה זו תומכת בעד 40 נוגדנים המתויגים במתכת במקטע רקמה אחד. שימו לב, הסיכון להפרעות אות עולה עם מספר הסמנים הכלולים בלוח. לאחר תכנון הפאנל, יש לתת תשומת לב מיוחדת להקצאת איזוטופ המתכת לנוגדן כדי למזער הפרעה זו. בדיקת פאנל ראשונית מתבצעת באמצעות תת-קבוצה קטנה של נוגדנים ולאחר מכן בדיקה של הלוח כולו ברקמות הבקרה. מקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין, מתקבלים ומותקנים על שקופיות מצופות זהב ומוכתמות עוד יותר. ההכתמה אורכת יומיים ודומה מאוד לצביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית. לאחר שהדגימות מוכתמות, הן ממוקמות במכשיר רכישת התמונה. שדות תצוגה נבחרים, ותמונות נרכשות, מועלות ומאוחסנות. השלב הסופי הוא הכנת התמונה לסינון והסרת הפרעות באמצעות תוכנת עיבוד התמונה של המערכת. חסרון של פלטפורמה זו הוא היעדר תוכנה אנליטית. עם זאת, התמונות שנוצרו נתמכות על ידי תוכנות פתולוגיה חישוביות שונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשיבותם של סוגי התאים הרבים המקיפים את אוכלוסיות הגידול הקלונלי היא מרכיב מכריע בסיווג של קרצינוגנזה. העניין בהבהרת הרכב המיקרו-סביבה של הגידול (TME) והאינטראקציות איתו עלה ברציפות בעקבות הקמת טיפול מבוסס חיסון כחלק מארסנל הטיפול בסרטן. לכן, אסטרטגיות הטיפול עברו מגישה ממוקדת גידול לגישה ממוקדת TME1.

המאמצים להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון במעקב אחר גידולים ובהתפתחות סרטן עלו באופן בולט בשנים האחרונות 2,3. במחקר הרפואי, שפע של שיטות, כולל שיטות מבוססות ציטומטריה וטכנולוגיות הדמיה של סינגלפלקס ומולטיפלקס, נוצרו כחלק מניסיון זה לפענח את האינטראקציות הייחודיות של אלמנטים מרובים של TMEs.

שיטות חלוציות כגון ציטומטריה של זרימה (שהומצאה בשנות ה-60 של המאה ה-20), מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה וציטומטריה המונית מתמקדות בעיקר בזיהוי וכימות רכיבי TME4. אף על פי שטכניקות כמותיות מבוססות ציטומטריה מאפשרות פנוטיפ של הנוף החיסוני, קביעת ההתפלגות המרחבית של התאים אינה אפשרית. לעומת זאת, שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית של סינגלפלקס משמרות את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרות לחוקרים לנתח את התפלגות התאים, אם כי מספר מופחת של מטרות בחלק רקמה אחת הוא מגבלה של שיטות אלה 5,6. במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות הדמיה מרובות עבור רזולוציה של תא יחיד כגון אימונופלואורסצנציה מרובה, הדמיית ברקוד פלואורסצנטי וספקטרומטריית מסה הדמיה התפתחו כאסטרטגיות מקיפות להשגת מידע על צביעת סמנים בו זמנית באמצעות אותה רקמה סעיף7.

כאן אנו מציגים טכנולוגיה המשלבת נוגדנים מתויגים במתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית ומאפשרת כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים (פנוטיפינג) ואנליזה מרחבית באמצעות פורמלין קבוע, משובץ פרפין (FFPE) ודגימות רקמה קפואות טריות (FF) 8,9. דגימות FFPE הן החומרים הנפוצים ביותר עבור דגימות ארכיון רקמות ומייצגות משאב זמין יותר עבור טכנולוגיות הדמיה מרובות מאשר דגימות קפואות טריות10. בנוסף, טכנולוגיה זו מציעה את האפשרות לרכוש מחדש תמונות חודשים לאחר מכן. כאן נדון בפרוטוקולי הצביעה ועיבוד התמונה שלנו באמצעות דגימות רקמות FFPE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות רקמה התקבלו למטרות מחקר בהתאם למועצת הביקורת המוסדית של מרכז הסרטן MD Anderson של אוניברסיטת טקסס, והדגימות בוטלו עוד יותר.

1. בחירת נוגדנים

  1. הגדר את שאלות המחקר כדי לבחור את שיבוטי הנוגדנים הטובים ביותר הזמינים. השתמש באטלס החלבונים האנושיים, במחקרים שפורסמו ובאתרי האינטרנט של יצרני הנוגדנים כמשאבי מחקר.
    הערה: הבחירה של בקרות מתאימות לרקמות אנושיות ואותן בקרות רקמה אנושית שיוכתמו בשלבים השונים היא קריטית כדי לוודא שהסמנים מוכתמים כראוי, במקום הנכון ובתא התאים הנכון. מיקרו-מערך רקמות קטנות (TMA) הכולל רקמות רגילות ורקמות ניאופלסטיות מומלץ תמיד לאימות מכתים.
  2. יש להשתמש רק בנוגדנים ללא נשא כדי לעצב את הפאנל.
    הערה: השימוש בתכשירי נוגדנים ללא נשא נדרש אם נוגדן מסחרי ללא נשא אינו זמין; ניתן להשתמש בערכות טיהור כדי להתאים את הנוגדן לנוסחה הנכונה. תוספי חלבון כגון אלבומין בסרום בקר ידועים כמפחיתים את יכולת ההצמדה.
  3. בדיקה וטיטרט של כל נוגדן באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית סטנדרטית כדי לקבוע את התבנית התת-תאית של ביטוי הסמן; ממברנה, ציטופלסמי או מכתים גרעיניים; וביטוי בתאים ספציפיים ברקמות בקרה.
    הערה: עם זאת, יש לבדוק כל נוגדן ב-pH 6 ציטראט ובחומצה אתילנדיאמינטטראקטית pH 9 (EDTA), ויש לקבוע אם הפאנל יוכתם ב-pH 6 ציטראט או ב-pH 9 EDTA. השימוש ב- pH 9 EDTA מומלץ להשיג אותות טובים, במיוחד כאשר עובדים עם מתודולוגיה זו.
  4. בחרו את ריכוז הצביעה האופטימלי בהתאם לדפוס הביטוי בבקרות חיוביות.
  5. הקצה כל נוגדן לאחד מאיזוטופי המתכת הזמינים בהתאם לשפע הסמנים האימונוהיסטוכימיים, לוקליזציה תת-תאית וביטוי משותף תאי עם המטרות האחרות.
  6. להכתים את הנוגדן עם המתכת שהוקצתה המתאימה ולהשוות עם הביטוי באותה רקמת בקרה בשימוש בעבר.
    הערה: הצמדת מתכת נוגדנים מתחילה בהכנת נוגדנים, הפחתה והצמדה לאחר מכן (קובץ משלים 1). כל צינור פולימרי טעון מתכת מספיק לסימון 100 מיקרוגרם של נוגדן.

2. עיצוב לוח נוגדנים

  1. צור קבוצות קטנות של מכתים נוגדנים. בדקו עד חמישה טושים בקוקטייל.
    הערה: בדיקת נוגדנים שכבר הוצמדו ונותחו באמצעות אימונוהיסטוכימיה בקבוצות מקלה על זיהוי מוקדם של הפרעות ערוץ ומספקת את ההזדמנות להצמיד מחדש את הנוגדנים למתכת אחרת. זה גם מספק הזדמנות להעריך ביטוי משותף סמן הולם.
  2. הכתימו כל אצווה קטנה בארבעה ריכוזי נוגדנים שונים (0.05 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל ו-4.0 מיקרוגרם/מ"ל).
    הערה: בהשוואה בין טיטרים שונים, זהה את ריכוז הנוגדנים שמביא למיקום הנכון ולביטוי הגבוה ביותר עם מינימום כתמי רקע (יחס האות לרעש הטוב ביותר).

3. חיתוך רקמות FFPE

  1. בחר שקופיות מצופות זהב (ספציפיות למטרה זו) ושמור אותן קרוב למיקרוטום. הכן את המיקרוטום על ידי החדרת להב חדש לתוך המחזיק. הגדר את עובי המקטע ל- 4-5 מיקרומטר.
  2. שים בלוקים FFPE על קרח לפני חתך. הכינו אמבט ציפה של רקמות על ידי חימום מים מזוקקים או מים שעברו דה-יוניזציה (diH2O) ל-40-45 מעלות צלזיוס.
    הערה: שימוש ב-diH2O או במים מזוקקים מפחית את האפשרות לזיהום.
  3. התחילו לחתוך. מניחים את חלק הרקמה במים באמצעות פינצטה ומניחים לו להשתטח. השתמש במגלשות כדי להסיר מקטעי רקמות מהמים.
  4. הניחו את המגלשות במדף שקופיות ותנו להן להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

4. מכתים נוגדנים FFPE

הערה: תהליך ההכתמה מתבצע בשני ימים נפרדים.

התראה: הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה הם בעלי פוטנציאל קורוזיבי ומייצגים סכנות לעור ולעיניים. מומלץ ללבוש כפפות, מעיל מעבדה וציוד מגן לעיניים ולפנים וכחלק ממדיניות הבטיחות הביולוגית של המוסד שלנו.

  1. הכנת מגיב (יום 1)
    1. יש לדלל 50 מ"ל של 20x תמיסת מלח עם Tween (TBS-T) ל-950 מ"ל של diH2O כדי ליצור 1 ליטר של TBS-T.
    2. יש לדלל 8 מ"ל של 10x חומצה Tris-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל-72 מ"ל של diH2O כדי ליצור תמיסת אחזור אפיטופ (HIER) המושרה בחום (1x).
    3. יש לדלל סרום חמורים ב-1x TBS-T לריכוז סופי של 5% כדי ליצור מאגר חוסם. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד שתהיה מוכנה לשימוש.
  2. הכנת HIER: מודול טיפול מקדים (PT)
    התראה: יש ללבוש כפפות מגן כימיות בעת טיפול בריאגנטים או בחלקים השקועים בריאגנטים המשמשים במודול PT.
    1. יש לדלל 140 מ"ל של 10x מי מלח עם אגירת פוספט (PBS) ל-1,260 מ"ל של diH2O כדי ליצור 1.4 ליטר של PBS אחד. לחלופין, יש לדלל שבע טבליות PBS ל-1.4 ליטר של diH2O.
    2. מלא מיכל עם 1.4 ליטר של PBS והניח את מיכל תא שקופית מוכן עם 100 מ"ל של 1x תמיסת HIER לתוך המיכל.
    3. מחממים את המיכל במודול PT ל-75 מעלות צלזיוס.
  3. הסרת עודף פרפין
    1. אופים ב-70 מעלות בתנור למשך 20 דקות לפחות.
      הערה: רקמות או מקטעים מסוימים עשויים להזדקק לזמני אפייה ארוכים יותר. זמן האפייה המומלץ לרקמת המוח או ל-TMA הוא שעה. ניתן להאריך זאת עד 16 שעות (לילה) או בהתאם לניסיון במעבדה.
    2. הניחו מגלשות אפויות במחזיק שקופיות ובצעו את שלבי הכביסה הבאים על שייקר מתחת למכסה אדים. שטפו את השקופיות בתמיסה הבאה: Xylene 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 100% אלכוהול 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 95% אלכוהול 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 80% אלכוהול עבור 30 שניות (ללא מתכת), 70% אלכוהול עבור 30 שניות (ללא מתכת), ו- diH2O 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת).
    3. יש לשמור את השקופיות במיכל טרי של diH2O עד שהן מוכנות לשליפת אנטיגן.
      הערה: אין לייבש את השקופיות עד סוף ההליך.
  4. שליפת אנטיגן
    1. מקם את השקופיות בתא שחומם מראש המכיל מאגר HIER 1x בתוך מודול PT. מניחים את הכיסוי על המיכל. סגור ותפס את המכסה.
    2. לחץ על הלחצן תפריט במודול PT כדי לפתוח את התפריט הראשי ולחץ על לחצן מחזור ההתקנה (זמן וטמפרטורה) כדי ליצור תוכנית מותאמת אישית.
    3. הפעל את מודול PT ב- 97 °C למשך 40 דקות. לאחר מכן, מודול PT יתקרר באופן אוטומטי ל-65 מעלות צלזיוס.
    4. הסר את השקופיות ממודול PT ברגע שמגיעים לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. שמור את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: מודול PT לא ייפתח עד שהטמפרטורה תתקרר ל-65°C. אין לגעת במשטח הזהב של השקופיות במהלך תהליך זה, ותמיד להשתמש בכפפות.
  5. חסימת נוגדנים
    1. הגדר שייקר ל-70 סל"ד.
    2. שטפו את השקופיות על ידי טבילתן ב-TBS-T אחד למשך 5 דקות 2x.
    3. באמצעות עט מחסום הידרופובי, ציירו גבול סביב קטע הרקמה במרחק של לפחות 1 מ"מ משולי המגלשה ותנו לו להתייבש במשך 15-30 שניות.
      הערה: יש למנוע מנוזל העט לגעת בחלק הרקמה כדי למנוע הפרעה לרקמות עם הכתמים. אל תלחץ על העט חזק מדי בעת ציור המחסום כדי למנוע דליפות פוטנציאליות. לקבלת תוצאות מיטביות של צביעה ורכישת תמונה, מקטעי הרקמה ממוקמים במרכז השקופיות המצופות זהב במסגרת שגודלה אינו עולה על 15 מ"מ x 30 מ"מ כדי לאפשר מספיק מקום לצייר את המחסום מבלי לגעת ברקמה או בנקודות המנחות המונחות בקצה החיצוני של המגלשה.
    4. כדי להסיר שאריות עט, טבל את השקופיות ב- TBS-T.
    5. בתא לחות בטמפרטורת החדר, לדגור את קטע הרקמה עם 100-200 μL של חיץ חוסם במשך 20 דקות. השאירו את הרקמה דגירה במאגר החוסם עד שתערובת מאסטר נוגדנים מוכנה.
  6. הכנת לוח נוגדנים
    הערה: הנפח הסופי של קוקטייל פאנל הנוגדנים משתנה בהתאם לשטח הפנים המשוער של חתך הרקמה. כדי לכסות שטח של 20 מ"מ x 20 מ"מ, להכין 100-200 μL של הקוקטייל.
    בצע את הפעולות הבאות כדי להכין קוקטייל פאנל נוגדנים של נוגדנים מצומדים לאיזוטופים מתכתיים:
    1. אשרו את הנפח הסופי של הקוקטייל השווה לנפח קוקטייל הנוגדנים שנוסף לנפח המאגר החוסם.
    2. אשר את המפרט של כל הנוגדנים, הדילולים ו/או ריכוזי הנוגדנים בגיליון אלקטרוני של פאנל עבור הפרויקט.
    3. סובבו את כל הצינורות המכילים נוגדנים ב-10,000 x גרם למשך 5 דקות. מוסיפים נוגדנים בודדים למאגר החוסם ומערבבים היטב. אין להפריע לתחתית צינור הנוגדנים בעת ניקופו.
    4. סנן את לוח הנוגדנים על ידי הרטבה מראש של התקן מסנן צנטריפוגלי בגודל 0.1 מיקרומטר עם 100 μL של מאגר חוסם. סובב את המסנן ב-10,000 x g למשך 2 דקות והסר את זרימת המאגר החוסם באמצעות פיפטה.
    5. העבירו את לוח הנוגדנים לעמודת ספין וסובבו את המסנן בגודל 10,000 x g למשך 2 דקות. השליכו את עמודת הסיבוב והשתמשו בזרימה כחלונית הנוגדנים המסוננת.
      הערה: יש לבצע את ההכתמה מיד לאחר הכנת הקוקטייל כדי למנוע החלפת מתכות. אם יש צורך באחסון של קוקטייל הנוגדנים למשך זמן ממושך, הוא יכול להיות נתון לליופיליזציה.
  7. צביעת נוגדנים
    1. הסר בזהירות את המאגר החוסם מהשקופיות על-ידי הטיית כל שקופית על צדה והקשה עדינה על הקצוות כנגד מגב משימה.
    2. מניחים את השקופיות בתא לחות ומוסיפים 100-200 μL של תערובת מאסטר נוגדנים לרקמה (יש להימנע ממגע עם רקמות ויצירת בועות אוויר).
    3. הוסף שקופיות בקרה חיוביות ושליליות לאצווה המכתימה.
    4. לדגום את המגלשות ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (14-16 שעות).
  8. הכנת ריאגנטים (יום 2)
    1. דילל 100 מ"ל של PBS 10x נמוך בריום, pH 7.4, ב 900 מ"ל של diH2O כדי ליצור 1x PBS.
    2. הכן 350 מ"ל של תמיסת מלאי עובד של 2% גלוטרלדהיד ב- PBS נמוך בריום (340 מ"ל של PBS נמוך בריום + 10 מ"ל של 70% גלוטרלדהיד).
      הערה: בצע את הדילול מתחת למכסה המנוע. גלוטרלדהיד הוא נוזל צמיג מאוד. השתמש פיפטה 1 מ"ל והוסף 1 מ"ל של PBS נמוך בריום לצינור glutaraldehyde בכל פעם עד שהוא הופך נוזלי מספיק כדי לשפוך מתוך הצינור.
    3. יש לדלל 10x Tris, pH 8.5, ב-900 מ"ל של diH20 כדי ליצור 1x Tris.
  9. קיבוע והתייבשות
    1. הסר את תערובת הבסיס לנוגדנים מכל שקופית על-ידי הטיית השקופית על צדה והקשה עדינה על הקצה כנגד מגב משימות.
    2. שטפו את השקופיות בתסיסה קלה עד בינונית במאגרים הבאים: 1x TBS-T, 3x פעמים למשך 5 דקות כל אחד (ללא מתכת); מסונן 2% glutaraldehyde במשך 5 דקות; מסונן 1x tris, pH 8.5, 3x עבור 30 שניות; מסונן diH2O 2x עבור 30 שניות; 70% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); 80% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); 95% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); ו-100% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת).
    3. הקישו בעדינות על הקצה של כל שקופית כנגד מגב משימה כדי להסיר עודפי אלכוהול ולאפשר לשאריות אלכוהול להתאדות בטמפרטורת החדר (~5-10 דקות).
    4. יש לייבש את השקופיות במייבש למשך שעה אחת לפחות לפני רכישת התמונה או לשמור את השקופיות בתא ואקום לאחסון לטווח ארוך.

5. רכישת תמונה

  1. הגדרת שקופיות
    הערה: לפני סריקה באמצעות המכשיר, יש להגדיר ולהגדיר את השקופיות באמצעות יישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט בהתאם לשלבים המתוארים להלן.
    1. בדף השקופית ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט, לחץ על גישה לשקופית חדשה והזן את הפרטים הרצויים (שם, זיהוי שקופית, מיקום ותיאור).
    2. צור מקטעי סריקה על-ידי לחיצה על הוסף מקטע. מלא את המידע עבור כל מקטע (שם הפרוייקט, שם השקופית, הבלוק והמיקום). כדי לשמור את השקופיות/מקטעים החדשים שנוצרו, לחץ על שלח.
    3. תחת הכרטיסייה resources, פתח את עמוד החלוניות ובחר בחלונית שתשמש. לחלוניות חדשות, לחצו על ' צור חלונית חדשה'.
    4. לאחר בחירת החלונית, לחץ על מקטעים. הוסף את המקטעים שנוצרו בשלב 2. על-ידי לחיצה על ערוך הקצאת מקטע. שמור על-ידי לחיצה על שלח.
  2. הגדרת כלי נגינה
    הערה: מכשיר זה (ראה טבלת חומרים) מופעל באמצעות תוכנת בקרה ספציפית (ראה טבלת חומרים).
    1. היכנס לתוכנת הבקרה. לחצו על ' התעוררות' אם המכשיר נמצא במצב שינה.
      הערה: לפחות שעה אחת לפני הניתוח, מומלץ לחמם את המכשיר, מה שמסייע בייצוב מיקוד הקרן.
    2. כדי לטעון שקופית, לחץ על דוגמה של Exchange ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לפתוח את הדלת. הנח את השקופית בחריץ הטעינה כאשר הדוגמה פונה כלפי מעלה והתווית מימין. לחץ על המשך כדי לסגור את הדלת.
      הערה: אם השקופית אינה נטענת כראוי, יופיע צליל אזהרה והודעה להתאמת השקופית.
    3. בחר את הפרוייקט ולאחר מכן בחר את שם השקופית עבור הדוגמה שנטענה.
    4. הצג באופן חזותי את התמונה הפנורמית בחלונית התמונה האופטית של השקופית.
  3. בחירה ורכישה של שדה ראייה (FOV)
    1. לחץ על תפריט מצב ובחר SED (גלאי אלקטרונים משני). לחץ על תפריט מצב ההדמיה ובחר QC −300 מיקרומטר.
    2. לחץ על Jog Stage כדי לשלוט במיקום FOV ולאחר מכן לחץ על החצים כדי לנווט ולבחור את המיקום של ה- FOV.
    3. לחץ על הוסף FOV, הגדר 400 μm x 400 μm כגודל השדה, ובחר בסדר כמצב ההדמיה ו- 1 אלפיות השנייה של זמן השהייה. לחץ על אשר.
      הערה: זמן השהייה שנקבע יהיה תלוי ברזולוציה הרצויה. זמן השהייה גדל ככל שהרזולוציה גדלה. זמן הרכישה עשוי להשתנות בהתאם למספר גורמים, כולל תקופת הפריצה לגלאי ומשך הפעולה. זמן הרכישה הממוצע שלנו עבור FOV אחד הוא כ -17 דקות. השתמש במכשיר ללא הפסקה למשך עד 8 שעות, מה שמאפשר סריקה של כ-28 FOVs. איכות התמונות הנרכשות יורדת לאחר שעות רבות רצופות של שימוש.
    4. לאחר יצירת רשימת FOV, המשך להתמקד בתמונה ולהתאים את הסטיגמה על ידי הזזת הקרן לאזור רקמה שלא יהיה בתמונה. התאם את הפרמטרים עד לקבלת תמונה מרכזית ברורה.
      הערה: כדי למטב את רכישת התמונה, שמירה על מקטע הרקמה מרוכז בשקופית היא אידיאלית. תוך כדי מיקוד ניתן לקבל תמונה ברורה של האזור המרכזי בלבד. אם מקטע הרקמה גדול מדי, הקצוות לא יהיו בפוקוס, והתמונה תהיה מטושטשת.
    5. לחץ על התחל הפעלה. תמונות שנרכשו יועלו ויאוחסנו באופן אוטומטי ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט.

6. הכנת תמונה

  1. תיקון איזוברי של תמונה
    הערה: מטרת התיקון האיזוברי היא להסיר אות זליגה בין ערוצים הנובע מנוכחותם של איזוטופים בעלי מסה שווה או דומה מאוד שלא ניתן לזהות הבדלים במסה באמצעות מנתח המסה.
    1. ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט, לחץ על סמל ההורדה הירוק כדי לשמור את ה- FOVs (תמונות TIFF).
    2. הורד את הגרסה המעודכנת ביותר של תוכנת עיבוד התמונה (ראה טבלת חומרים) הזמינה בכרטיסייה אודות ביישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט ושמור אותה בקובץ. פתח את קובץ הארכיון .zip ובצע את שלבי ההתקנה. פתח את התוכנה לאחר השלמת ההתקנה.
    3. בחר את התיקייה המכילה את התמונות לתיקון על ידי לחיצה על קובץ סמל בחלונית הקלט של תוכנת עיבוד התמונה. רשימת FOV תיטען.
    4. לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט כדי להחיל תיקוני ברירת מחדל. עבור כל ערוץ, הצג באופן חזותי תמונות המתקבלות לפני ואחרי התיקון בצד ימין של המסך.
    5. לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט כדי לשמור את התמונה המתוקנת.
  2. סינון תמונה: Voronoi tessellation
    הערה: דיאגרמות טסלציה של וורונוי ממחישות מחיצה של שטח המכיל נקודות זרע לתוך תאי וורונוי. המטרה היא להעריך את צפיפות התא ולהגדיר את גבולות התא. באמצעות חישוב הטסלה של וורונוי, נוצרת מסיכה ומוחלים על התמונה המקורית לסינון.
    1. לחץ על הכרטיסייה סינון ובחר Voronoi Tesselation בתפריט הפרמטרים של הסינון.
    2. בחלונית הקלט, בחר את התמונה MassCorrected.tiff . לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט.
    3. לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט כדי לשמור את התמונה המסוננת. שני הקבצים שיתקבלו יכללו את הסיומות -מסונן.tiff ו--Filtered.json.
      הערה: לאחר מכן ניתן להעלות את התמונה בשם MassCorrected-Filtered.tiff לתוכנת ניתוח דיגיטלי של צד שלישי או לתוכנת קוד פתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקטעי רקמת TMA של שקדים וריאות אדנוקרצינומה (בעובי 5 מ"מ) התקבלו והונחו על אמצע שקופיות מצופות זהב בהתאם למפרטים לגבי גודל הרקמה והשוליים הבטוחים של השקופיות. שולי זכוכית חופשיים של 5 מ"מ ו -10 מ"מ בין קצה הרקמה לבין הגבולות הצדדיים והנחותים של שקופיות הזכוכית, בהתאמה, נחוצים להכתמה אופטימלית. חלקי הרקמה נאפו לילה בתנור לפני ההכתמה כדי להבטיח היצמדות נאותה של החלק למגלשה. לוח הנוגדנים הורכב מ-23 סמנים. באותה אצווה של צביעה, שקופית שקדים ושקופית TMA המכילה מספר רקמות נכללו כדי להעריך את הביטוי של סמנים המתבטאים באופן דל ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההבהרה המקיפה של יחסי הגומלין המורכבים והמורכבים בין המרכיבים המרובים של TME נותרה מטרה מרכזית בחקר הסרטן. היצרנים הציגו מבחנים מרובים רבים כחלק ממאמץ זה, במיוחד במהלך 5 השנים האחרונות. ניתוח מרחבי מרובב הוא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה המאפשר סיווג סימולטני של מספר מטרות תוך שמירה על מורפולוגיה מבנית בדגימות גידול. טכניקות ניתוח מרחבי יכולות להתבצע באמצעות הדמיה פלואורסצנטית או ספקטרומטריית מסות, כגון הטכניקה המתוארת כאן 11,12,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לדון נורווד משירותי עריכה, מהספרייה הרפואית למחקר ב- MD Anderson על עריכת מאמר זה ומהמעבדה לאימונופלואורסצנציה וניתוח תמונות במחלקה לפתולוגיה מולקולרית תרגומית ב- MD Anderson. פרסום זה נבע בחלקו ממחקר שהתאפשר על ידי התמיכה המדעית והכספית במרכזי הניטור והניתוח של מערכת החיסון לסרטן - רשת הנתונים האימונולוגיים של הסרטן (CIMAC-CIDC) שסופקו באמצעות הסכם שיתוף הפעולה של המכון הלאומי לסרטן (NCI) (U24CA224285) למרכז הסרטן של אוניברסיטת טקסס MD Anderson מרכז לניטור וניתוח חיסונים לסרטן (CIMAC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100% אלכוהול מגיבסיגמא-אולדריץ'R8382
95% אלכוהול מגיבסיגמא-אולדריץ'R3404
80% אלכוהול מגיבסיגמא-אולדריץ'R3279
70% אלכוהול מגיבסיגמא-אולדריץ'R315
20X TBS-TIONPATH567005
10X בריום נמוך PBS pH 7.4Ionpath
10X טריס pH 8.5 Ionpath567003
4° C מקררThermoScientificREVCO
טיפים לפיפטה מחסום אירוסול P10אולימפוס24-401
טיפים לפיפטה מחסום אירוסול P20אולימפוס24-404
טיפים לפיפטה מחסום אירוסול P200אולימפוס24-412
טיפים לפיפטה מחסום אירוסול P1000אולימפוס24-430
Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
H2O Ionpath 567002 סרום חמור נטול יונים
ערכת צביעת שקופיות (צנצנת + מתלה),מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים71388-01
מחזיק נירוסטה EasyDipמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית71388-50
גלוטרלדהיד 70%EM כיתה מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי16360
מאגר אחזור אפיטופ המושרה בחום (HIER): 10X Tris עם EDTA, pH 9DakoS2367
שקופית עמידה בחום קאמריאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי62705-01
עט מחסום הידרופוביפישר50-550-221
תוכנת MIBI/OIonpathNA
MIBIcontrol תוכנהIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5415D
MicrotomeLeicaRM2135
תא לחות (תא לח)SimportM922-1
טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS) FisherScientificBP2944100
PT מודולThermo ScientificA80400012
יחידות סינון חד פעמיות סטריליות בזרימה מהירהפישר סיינטיפיק097403A
שייקרBioRockerS2025
עמוד ספין (מסנן ספין Ultrafree-MC, 0.5 מ"ל 0.1μ מ )MillQUFC30VV00
תנור שקופיותפישר סיינטיפיק6901
מייבש ארון ואקוםVWR30621-076
שוט משימותקימברלי קלארק34155
קסילןסיגמא-אולדריץ'534056-4L
567004 מסנן צנטריפוגלי Sigma-Aldrich D9663 EasyDip צנצנת צביעת שקופיות, מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים ירוקה 71385-G צנצנת צביעת שקופיות EasyDip, מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים צהובים 71385-Y EasyDip לבנים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

מאמרים קשורים