הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

חשיבותם של סוגי התאים הרבים המקיפים את אוכלוסיות הגידול הקלונלי היא מרכיב מכריע בסיווג של קרצינוגנזה. העניין בהבהרת הרכב המיקרו-סביבה של הגידול (TME) והאינטראקציות איתו עלה ברציפות בעקבות הקמת טיפול מבוסס חיסון כחלק מארסנל הטיפול בסרטן. לכן, אסטרטגיות הטיפול עברו מגישה ממוקדת גידול לגישה ממוקדת TME¹.

המאמצים להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון במעקב אחר גידולים ובהתפתחות סרטן עלו באופן בולט בשנים האחרונות ^2,3. במחקר הרפואי, שפע של שיטות, כולל שיטות מבוססות ציטומטריה וטכנולוגיות הדמיה של סינגלפלקס ומולטיפלקס, נוצרו כחלק מניסיון זה לפענח את האינטראקציות הייחודיות של אלמנטים מרובים של TMEs.

שיטות חלוציות כגון ציטומטריה של זרימה (שהומצאה בשנות ה-60 של המאה ה-20), מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה וציטומטריה המונית מתמקדות בעיקר בזיהוי וכימות רכיבי TME⁴. אף על פי שטכניקות כמותיות מבוססות ציטומטריה מאפשרות פנוטיפ של הנוף החיסוני, קביעת ההתפלגות המרחבית של התאים אינה אפשרית. לעומת זאת, שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית של סינגלפלקס משמרות את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרות לחוקרים לנתח את התפלגות התאים, אם כי מספר מופחת של מטרות בחלק רקמה אחת הוא מגבלה של שיטות אלה ^5,6. במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות הדמיה מרובות עבור רזולוציה של תא יחיד כגון אימונופלואורסצנציה מרובה, הדמיית ברקוד פלואורסצנטי וספקטרומטריית מסה הדמיה התפתחו כאסטרטגיות מקיפות להשגת מידע על צביעת סמנים בו זמנית באמצעות אותה רקמה סעיף⁷.

כאן אנו מציגים טכנולוגיה המשלבת נוגדנים מתויגים במתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית ומאפשרת כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים (פנוטיפינג) ואנליזה מרחבית באמצעות פורמלין קבוע, משובץ פרפין (FFPE) ודגימות רקמה קפואות טריות (FF) ^8,9. דגימות FFPE הן החומרים הנפוצים ביותר עבור דגימות ארכיון רקמות ומייצגות משאב זמין יותר עבור טכנולוגיות הדמיה מרובות מאשר דגימות קפואות טריות¹⁰. בנוסף, טכנולוגיה זו מציעה את האפשרות לרכוש מחדש תמונות חודשים לאחר מכן. כאן נדון בפרוטוקולי הצביעה ועיבוד התמונה שלנו באמצעות דגימות רקמות FFPE.

דגימות רקמה התקבלו למטרות מחקר בהתאם למועצת הביקורת המוסדית של מרכז הסרטן MD Anderson של אוניברסיטת טקסס, והדגימות בוטלו עוד יותר.

1. בחירת נוגדנים

1. הגדר את שאלות המחקר כדי לבחור את שיבוטי הנוגדנים הטובים ביותר הזמינים. השתמש באטלס החלבונים האנושיים, במחקרים שפורסמו ובאתרי האינטרנט של יצרני הנוגדנים כמשאבי מחקר.
   הערה: הבחירה של בקרות מתאימות לרקמות אנושיות ואותן בקרות רקמה אנושית שיוכתמו בשלבים השונים היא קריטית כדי לוודא שהסמנים מוכתמים כראוי, במקום הנכון ובתא התאים הנכון. מיקרו-מערך רקמות קטנות (TMA) הכולל רקמות רגילות ורקמות ניאופלסטיות מומלץ תמיד לאימות מכתים.
2. יש להשתמש רק בנוגדנים ללא נשא כדי לעצב את הפאנל.
   הערה: השימוש בתכשירי נוגדנים ללא נשא נדרש אם נוגדן מסחרי ללא נשא אינו זמין; ניתן להשתמש בערכות טיהור כדי להתאים את הנוגדן לנוסחה הנכונה. תוספי חלבון כגון אלבומין בסרום בקר ידועים כמפחיתים את יכולת ההצמדה.
3. בדיקה וטיטרט של כל נוגדן באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית סטנדרטית כדי לקבוע את התבנית התת-תאית של ביטוי הסמן; ממברנה, ציטופלסמי או מכתים גרעיניים; וביטוי בתאים ספציפיים ברקמות בקרה.
   הערה: עם זאת, יש לבדוק כל נוגדן ב-pH 6 ציטראט ובחומצה אתילנדיאמינטטראקטית pH 9 (EDTA), ויש לקבוע אם הפאנל יוכתם ב-pH 6 ציטראט או ב-pH 9 EDTA. השימוש ב- pH 9 EDTA מומלץ להשיג אותות טובים, במיוחד כאשר עובדים עם מתודולוגיה זו.
4. בחרו את ריכוז הצביעה האופטימלי בהתאם לדפוס הביטוי בבקרות חיוביות.
5. הקצה כל נוגדן לאחד מאיזוטופי המתכת הזמינים בהתאם לשפע הסמנים האימונוהיסטוכימיים, לוקליזציה תת-תאית וביטוי משותף תאי עם המטרות האחרות.
6. להכתים את הנוגדן עם המתכת שהוקצתה המתאימה ולהשוות עם הביטוי באותה רקמת בקרה בשימוש בעבר.
   הערה: הצמדת מתכת נוגדנים מתחילה בהכנת נוגדנים, הפחתה והצמדה לאחר מכן (קובץ משלים 1). כל צינור פולימרי טעון מתכת מספיק לסימון 100 מיקרוגרם של נוגדן.

2. עיצוב לוח נוגדנים

1. צור קבוצות קטנות של מכתים נוגדנים. בדקו עד חמישה טושים בקוקטייל.
   הערה: בדיקת נוגדנים שכבר הוצמדו ונותחו באמצעות אימונוהיסטוכימיה בקבוצות מקלה על זיהוי מוקדם של הפרעות ערוץ ומספקת את ההזדמנות להצמיד מחדש את הנוגדנים למתכת אחרת. זה גם מספק הזדמנות להעריך ביטוי משותף סמן הולם.
2. הכתימו כל אצווה קטנה בארבעה ריכוזי נוגדנים שונים (0.05 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל ו-4.0 מיקרוגרם/מ"ל).
   הערה: בהשוואה בין טיטרים שונים, זהה את ריכוז הנוגדנים שמביא למיקום הנכון ולביטוי הגבוה ביותר עם מינימום כתמי רקע (יחס האות לרעש הטוב ביותר).

3. חיתוך רקמות FFPE

1. בחר שקופיות מצופות זהב (ספציפיות למטרה זו) ושמור אותן קרוב למיקרוטום. הכן את המיקרוטום על ידי החדרת להב חדש לתוך המחזיק. הגדר את עובי המקטע ל- 4-5 מיקרומטר.
2. שים בלוקים FFPE על קרח לפני חתך. הכינו אמבט ציפה של רקמות על ידי חימום מים מזוקקים או מים שעברו דה-יוניזציה (diH₂O) ל-40-45 מעלות צלזיוס.
   הערה: שימוש ב-diH₂O או במים מזוקקים מפחית את האפשרות לזיהום.
3. התחילו לחתוך. מניחים את חלק הרקמה במים באמצעות פינצטה ומניחים לו להשתטח. השתמש במגלשות כדי להסיר מקטעי רקמות מהמים.
4. הניחו את המגלשות במדף שקופיות ותנו להן להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

4. מכתים נוגדנים FFPE

הערה: תהליך ההכתמה מתבצע בשני ימים נפרדים.

התראה: הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה הם בעלי פוטנציאל קורוזיבי ומייצגים סכנות לעור ולעיניים. מומלץ ללבוש כפפות, מעיל מעבדה וציוד מגן לעיניים ולפנים וכחלק ממדיניות הבטיחות הביולוגית של המוסד שלנו.

1. הכנת מגיב (יום 1)
   1. יש לדלל 50 מ"ל של 20x תמיסת מלח עם Tween (TBS-T) ל-950 מ"ל של diH₂O כדי ליצור 1 ליטר של TBS-T.
   2. יש לדלל 8 מ"ל של 10x חומצה Tris-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל-72 מ"ל של diH₂O כדי ליצור תמיסת אחזור אפיטופ (HIER) המושרה בחום (1x).
   3. יש לדלל סרום חמורים ב-1x TBS-T לריכוז סופי של 5% כדי ליצור מאגר חוסם. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד שתהיה מוכנה לשימוש.
2. הכנת HIER: מודול טיפול מקדים (PT)
   התראה: יש ללבוש כפפות מגן כימיות בעת טיפול בריאגנטים או בחלקים השקועים בריאגנטים המשמשים במודול PT.
   1. יש לדלל 140 מ"ל של 10x מי מלח עם אגירת פוספט (PBS) ל-1,260 מ"ל של diH₂O כדי ליצור 1.4 ליטר של PBS אחד. לחלופין, יש לדלל שבע טבליות PBS ל-1.4 ליטר של diH₂O.
   2. מלא מיכל עם 1.4 ליטר של PBS והניח את מיכל תא שקופית מוכן עם 100 מ"ל של 1x תמיסת HIER לתוך המיכל.
   3. מחממים את המיכל במודול PT ל-75 מעלות צלזיוס.
3. הסרת עודף פרפין
   1. אופים ב-70 מעלות בתנור למשך 20 דקות לפחות.
      הערה: רקמות או מקטעים מסוימים עשויים להזדקק לזמני אפייה ארוכים יותר. זמן האפייה המומלץ לרקמת המוח או ל-TMA הוא שעה. ניתן להאריך זאת עד 16 שעות (לילה) או בהתאם לניסיון במעבדה.
   2. הניחו מגלשות אפויות במחזיק שקופיות ובצעו את שלבי הכביסה הבאים על שייקר מתחת למכסה אדים. שטפו את השקופיות בתמיסה הבאה: Xylene 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 100% אלכוהול 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 95% אלכוהול 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת), 80% אלכוהול עבור 30 שניות (ללא מתכת), 70% אלכוהול עבור 30 שניות (ללא מתכת), ו- diH₂O 2x עבור 30 שניות (ללא מתכת).
   3. יש לשמור את השקופיות במיכל טרי של diH₂O עד שהן מוכנות לשליפת אנטיגן.
      הערה: אין לייבש את השקופיות עד סוף ההליך.
4. שליפת אנטיגן
   1. מקם את השקופיות בתא שחומם מראש המכיל מאגר HIER 1x בתוך מודול PT. מניחים את הכיסוי על המיכל. סגור ותפס את המכסה.
   2. לחץ על הלחצן תפריט במודול PT כדי לפתוח את התפריט הראשי ולחץ על לחצן מחזור ההתקנה (זמן וטמפרטורה) כדי ליצור תוכנית מותאמת אישית.
   3. הפעל את מודול PT ב- 97 °C למשך 40 דקות. לאחר מכן, מודול PT יתקרר באופן אוטומטי ל-65 מעלות צלזיוס.
   4. הסר את השקופיות ממודול PT ברגע שמגיעים לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. שמור את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: מודול PT לא ייפתח עד שהטמפרטורה תתקרר ל-65°C. אין לגעת במשטח הזהב של השקופיות במהלך תהליך זה, ותמיד להשתמש בכפפות.
5. חסימת נוגדנים
   1. הגדר שייקר ל-70 סל"ד.
   2. שטפו את השקופיות על ידי טבילתן ב-TBS-T אחד למשך 5 דקות 2x.
   3. באמצעות עט מחסום הידרופובי, ציירו גבול סביב קטע הרקמה במרחק של לפחות 1 מ"מ משולי המגלשה ותנו לו להתייבש במשך 15-30 שניות.
      הערה: יש למנוע מנוזל העט לגעת בחלק הרקמה כדי למנוע הפרעה לרקמות עם הכתמים. אל תלחץ על העט חזק מדי בעת ציור המחסום כדי למנוע דליפות פוטנציאליות. לקבלת תוצאות מיטביות של צביעה ורכישת תמונה, מקטעי הרקמה ממוקמים במרכז השקופיות המצופות זהב במסגרת שגודלה אינו עולה על 15 מ"מ x 30 מ"מ כדי לאפשר מספיק מקום לצייר את המחסום מבלי לגעת ברקמה או בנקודות המנחות המונחות בקצה החיצוני של המגלשה.
   4. כדי להסיר שאריות עט, טבל את השקופיות ב- TBS-T.
   5. בתא לחות בטמפרטורת החדר, לדגור את קטע הרקמה עם 100-200 μL של חיץ חוסם במשך 20 דקות. השאירו את הרקמה דגירה במאגר החוסם עד שתערובת מאסטר נוגדנים מוכנה.
6. הכנת לוח נוגדנים
   הערה: הנפח הסופי של קוקטייל פאנל הנוגדנים משתנה בהתאם לשטח הפנים המשוער של חתך הרקמה. כדי לכסות שטח של 20 מ"מ x 20 מ"מ, להכין 100-200 μL של הקוקטייל.
   בצע את הפעולות הבאות כדי להכין קוקטייל פאנל נוגדנים של נוגדנים מצומדים לאיזוטופים מתכתיים:
   1. אשרו את הנפח הסופי של הקוקטייל השווה לנפח קוקטייל הנוגדנים שנוסף לנפח המאגר החוסם.
   2. אשר את המפרט של כל הנוגדנים, הדילולים ו/או ריכוזי הנוגדנים בגיליון אלקטרוני של פאנל עבור הפרויקט.
   3. סובבו את כל הצינורות המכילים נוגדנים ב-10,000 x גרם למשך 5 דקות. מוסיפים נוגדנים בודדים למאגר החוסם ומערבבים היטב. אין להפריע לתחתית צינור הנוגדנים בעת ניקופו.
   4. סנן את לוח הנוגדנים על ידי הרטבה מראש של התקן מסנן צנטריפוגלי בגודל 0.1 מיקרומטר עם 100 μL של מאגר חוסם. סובב את המסנן ב-10,000 x g למשך 2 דקות והסר את זרימת המאגר החוסם באמצעות פיפטה.
   5. העבירו את לוח הנוגדנים לעמודת ספין וסובבו את המסנן בגודל 10,000 x g למשך 2 דקות. השליכו את עמודת הסיבוב והשתמשו בזרימה כחלונית הנוגדנים המסוננת.
      הערה: יש לבצע את ההכתמה מיד לאחר הכנת הקוקטייל כדי למנוע החלפת מתכות. אם יש צורך באחסון של קוקטייל הנוגדנים למשך זמן ממושך, הוא יכול להיות נתון לליופיליזציה.
7. צביעת נוגדנים
   1. הסר בזהירות את המאגר החוסם מהשקופיות על-ידי הטיית כל שקופית על צדה והקשה עדינה על הקצוות כנגד מגב משימה.
   2. מניחים את השקופיות בתא לחות ומוסיפים 100-200 μL של תערובת מאסטר נוגדנים לרקמה (יש להימנע ממגע עם רקמות ויצירת בועות אוויר).
   3. הוסף שקופיות בקרה חיוביות ושליליות לאצווה המכתימה.
   4. לדגום את המגלשות ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (14-16 שעות).
8. הכנת ריאגנטים (יום 2)
   1. דילל 100 מ"ל של PBS 10x נמוך בריום, pH 7.4, ב 900 מ"ל של diH₂O כדי ליצור 1x PBS.
   2. הכן 350 מ"ל של תמיסת מלאי עובד של 2% גלוטרלדהיד ב- PBS נמוך בריום (340 מ"ל של PBS נמוך בריום + 10 מ"ל של 70% גלוטרלדהיד).
      הערה: בצע את הדילול מתחת למכסה המנוע. גלוטרלדהיד הוא נוזל צמיג מאוד. השתמש פיפטה 1 מ"ל והוסף 1 מ"ל של PBS נמוך בריום לצינור glutaraldehyde בכל פעם עד שהוא הופך נוזלי מספיק כדי לשפוך מתוך הצינור.
   3. יש לדלל 10x Tris, pH 8.5, ב-900 מ"ל של diH₂0 כדי ליצור 1x Tris.
9. קיבוע והתייבשות
   1. הסר את תערובת הבסיס לנוגדנים מכל שקופית על-ידי הטיית השקופית על צדה והקשה עדינה על הקצה כנגד מגב משימות.
   2. שטפו את השקופיות בתסיסה קלה עד בינונית במאגרים הבאים: 1x TBS-T, 3x פעמים למשך 5 דקות כל אחד (ללא מתכת); מסונן 2% glutaraldehyde במשך 5 דקות; מסונן 1x tris, pH 8.5, 3x עבור 30 שניות; מסונן diH₂O 2x עבור 30 שניות; 70% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); 80% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); 95% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת); ו-100% אלכוהול למשך 30 שניות (ללא מתכת).
   3. הקישו בעדינות על הקצה של כל שקופית כנגד מגב משימה כדי להסיר עודפי אלכוהול ולאפשר לשאריות אלכוהול להתאדות בטמפרטורת החדר (~5-10 דקות).
   4. יש לייבש את השקופיות במייבש למשך שעה אחת לפחות לפני רכישת התמונה או לשמור את השקופיות בתא ואקום לאחסון לטווח ארוך.

5. רכישת תמונה

1. הגדרת שקופיות
   הערה: לפני סריקה באמצעות המכשיר, יש להגדיר ולהגדיר את השקופיות באמצעות יישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט בהתאם לשלבים המתוארים להלן.
   1. בדף השקופית ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט, לחץ על גישה לשקופית חדשה והזן את הפרטים הרצויים (שם, זיהוי שקופית, מיקום ותיאור).
   2. צור מקטעי סריקה על-ידי לחיצה על הוסף מקטע. מלא את המידע עבור כל מקטע (שם הפרוייקט, שם השקופית, הבלוק והמיקום). כדי לשמור את השקופיות/מקטעים החדשים שנוצרו, לחץ על שלח.
   3. תחת הכרטיסייה resources, פתח את עמוד החלוניות ובחר בחלונית שתשמש. לחלוניות חדשות, לחצו על ' צור חלונית חדשה'.
   4. לאחר בחירת החלונית, לחץ על מקטעים. הוסף את המקטעים שנוצרו בשלב 2. על-ידי לחיצה על ערוך הקצאת מקטע. שמור על-ידי לחיצה על שלח.
2. הגדרת כלי נגינה
   הערה: מכשיר זה (ראה טבלת חומרים) מופעל באמצעות תוכנת בקרה ספציפית (ראה טבלת חומרים).
   1. היכנס לתוכנת הבקרה. לחצו על ' התעוררות' אם המכשיר נמצא במצב שינה.
      הערה: לפחות שעה אחת לפני הניתוח, מומלץ לחמם את המכשיר, מה שמסייע בייצוב מיקוד הקרן.
   2. כדי לטעון שקופית, לחץ על דוגמה של Exchange ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לפתוח את הדלת. הנח את השקופית בחריץ הטעינה כאשר הדוגמה פונה כלפי מעלה והתווית מימין. לחץ על המשך כדי לסגור את הדלת.
      הערה: אם השקופית אינה נטענת כראוי, יופיע צליל אזהרה והודעה להתאמת השקופית.
   3. בחר את הפרוייקט ולאחר מכן בחר את שם השקופית עבור הדוגמה שנטענה.
   4. הצג באופן חזותי את התמונה הפנורמית בחלונית התמונה האופטית של השקופית.
3. בחירה ורכישה של שדה ראייה (FOV)
   1. לחץ על תפריט מצב ובחר SED (גלאי אלקטרונים משני). לחץ על תפריט מצב ההדמיה ובחר QC −300 מיקרומטר.
   2. לחץ על Jog Stage כדי לשלוט במיקום FOV ולאחר מכן לחץ על החצים כדי לנווט ולבחור את המיקום של ה- FOV.
   3. לחץ על הוסף FOV, הגדר 400 μm x 400 μm כגודל השדה, ובחר בסדר כמצב ההדמיה ו- 1 אלפיות השנייה של זמן השהייה. לחץ על אשר.
      הערה: זמן השהייה שנקבע יהיה תלוי ברזולוציה הרצויה. זמן השהייה גדל ככל שהרזולוציה גדלה. זמן הרכישה עשוי להשתנות בהתאם למספר גורמים, כולל תקופת הפריצה לגלאי ומשך הפעולה. זמן הרכישה הממוצע שלנו עבור FOV אחד הוא כ -17 דקות. השתמש במכשיר ללא הפסקה למשך עד 8 שעות, מה שמאפשר סריקה של כ-28 FOVs. איכות התמונות הנרכשות יורדת לאחר שעות רבות רצופות של שימוש.
   4. לאחר יצירת רשימת FOV, המשך להתמקד בתמונה ולהתאים את הסטיגמה על ידי הזזת הקרן לאזור רקמה שלא יהיה בתמונה. התאם את הפרמטרים עד לקבלת תמונה מרכזית ברורה.
      הערה: כדי למטב את רכישת התמונה, שמירה על מקטע הרקמה מרוכז בשקופית היא אידיאלית. תוך כדי מיקוד ניתן לקבל תמונה ברורה של האזור המרכזי בלבד. אם מקטע הרקמה גדול מדי, הקצוות לא יהיו בפוקוס, והתמונה תהיה מטושטשת.
   5. לחץ על התחל הפעלה. תמונות שנרכשו יועלו ויאוחסנו באופן אוטומטי ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט.

6. הכנת תמונה

1. תיקון איזוברי של תמונה
   הערה: מטרת התיקון האיזוברי היא להסיר אות זליגה בין ערוצים הנובע מנוכחותם של איזוטופים בעלי מסה שווה או דומה מאוד שלא ניתן לזהות הבדלים במסה באמצעות מנתח המסה.
   1. ביישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט, לחץ על סמל ההורדה הירוק כדי לשמור את ה- FOVs (תמונות TIFF).
   2. הורד את הגרסה המעודכנת ביותר של תוכנת עיבוד התמונה (ראה טבלת חומרים) הזמינה בכרטיסייה אודות ביישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט ושמור אותה בקובץ. פתח את קובץ הארכיון .zip ובצע את שלבי ההתקנה. פתח את התוכנה לאחר השלמת ההתקנה.
   3. בחר את התיקייה המכילה את התמונות לתיקון על ידי לחיצה על קובץ סמל בחלונית הקלט של תוכנת עיבוד התמונה. רשימת FOV תיטען.
   4. לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט כדי להחיל תיקוני ברירת מחדל. עבור כל ערוץ, הצג באופן חזותי תמונות המתקבלות לפני ואחרי התיקון בצד ימין של המסך.
   5. לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט כדי לשמור את התמונה המתוקנת.
2. סינון תמונה: Voronoi tessellation
   הערה: דיאגרמות טסלציה של וורונוי ממחישות מחיצה של שטח המכיל נקודות זרע לתוך תאי וורונוי. המטרה היא להעריך את צפיפות התא ולהגדיר את גבולות התא. באמצעות חישוב הטסלה של וורונוי, נוצרת מסיכה ומוחלים על התמונה המקורית לסינון.
   1. לחץ על הכרטיסייה סינון ובחר Voronoi Tesselation בתפריט הפרמטרים של הסינון.
   2. בחלונית הקלט, בחר את התמונה MassCorrected.tiff . לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט.
   3. לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט כדי לשמור את התמונה המסוננת. שני הקבצים שיתקבלו יכללו את הסיומות -מסונן.tiff ו--Filtered.json.
      הערה: לאחר מכן ניתן להעלות את התמונה בשם MassCorrected-Filtered.tiff לתוכנת ניתוח דיגיטלי של צד שלישי או לתוכנת קוד פתוח.

מקטעי רקמת TMA של שקדים וריאות אדנוקרצינומה (בעובי 5 מ"מ) התקבלו והונחו על אמצע שקופיות מצופות זהב בהתאם למפרטים לגבי גודל הרקמה והשוליים הבטוחים של השקופיות. שולי זכוכית חופשיים של 5 מ"מ ו -10 מ"מ בין קצה הרקמה לבין הגבולות הצדדיים והנחותים של שקופיות הזכוכית, בהתאמה, נחוצים להכתמה אופטימלית. חלקי הרקמה נאפו לילה בתנור לפני ההכתמה כדי להבטיח היצמדות נאותה של החלק למגלשה. לוח הנוגדנים הורכב מ-23 סמנים. באותה אצווה של צביעה, שקופית שקדים ושקופית TMA המכילה מספר רקמות נכללו כדי להעריך את הביטוי של סמנים המתבטאים באופן דל בדגימות אדנוקרצינומה של הריאות (איור 1). יש לבחור בקרות חיוביות בהתאם למטרות הנוגדנים המשמשים בפאנלים; לדוגמה, כדי להעריך ביטוי SOX10, יש צורך בדגימות מלנומה, וכדי להעריך ביטוי GAFP, יש צורך בדגימות גליובלסטומה (איור 2).

איור 1: טוהר איזוטופי ודיבור צולב של ערוצים. המטריצה מציגה את אחוז הדיבור הצולב שמקורו בטוהר הבדיקה ובתחמוצות (תיבות כחולות, ≥0.5%; תיבות שקופות, <0.5%). עבור תגי ההמונים, מוצגות בדיקות שתרמו לפחות 0.5% שיחות צולבות ללא ערוצים (ירוק), ערוץ אחד או שניים (צהוב), או יותר משני ערוצים (כתום). כמו כן מוצגים ערוצים המוניים המקבלים לפחות 0.5% שיחות צולבות ללא גשושיות (ירוק), גשושית אחת או שתיים (צהובות), או יותר משתי גשושיות (כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תמונות צביעה מייצגות ברקמות שונות . (A) אדנוקרצינומה של הריאות. (B) כליה לא-נופלסטית. (C) שקדים. CD20 מוצג בצהוב, Ki67 מוצג במגנטה, CD3 מוצג בלבן, CD11c מוצג בירוק, CD68 מוצג באדום, ציטוקרטין מוצג בציאן, ודנ"א דו-גדילי (dsDNA) מוצג בכחול. הגדלה, 200x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הליך צביעה זה דומה מאוד לצביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית והתרחש במשך יומיים רצופים. חמשת השלבים העיקריים של פרוטוקול ההכתמה הם 1) הסרת פרפין עודף, 2) שליפת אנטיגן, 3) חסימת נוגדנים, 4) צביעת נוגדנים, ו-5) קיבוע והתייבשות (איור 3). שלב בסיסי בהליך הצביעה הוא נקיטת אמצעי זהירות כדי למנוע זיהום מתכתי של הדגימות, כולל שימוש בריאגנטים ללא מתכת המאוחסנים בכלי פלסטיק וטיפול זהיר בדגימות כדי להגביל את הנזק המכני. מומלץ להכין את קוקטייל הנוגדנים מיד לפני הכתמים. זה מקטין את חילופי המתכת. לאחר שהכתמים הושלמו, אחסנו את השקופיות וסרקנו אותן למחרת. לפני רכישת תמונה, שלב הכרחי הוא הגדרת שקופיות באמצעות יישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט (איור 4).

איור 3: זרימת עבודה של רכישת תמונה והשקופית המשויכת. (A) סיכום זרימת עבודה של רכישת תמונה. 1) מקטע רקמת FFPE המוכתם בנוגדנים מצומדים ממתכת מקבל רסטר באמצעות אקדח יונים ראשוני, המשחרר יונים משניים. 2) ספקטרומטר מסה בזמן טיסה מפריד, ומודד יונים על סמך המסה שלהם ברמת הפיקסלים. 3) כימות מבוסס פיקסלים של יונים משניים. ציר ה-y מתאים למספר היונים שזוהו (שיא), וציר ה-x מתאים למסה של כל מתכת. 4) בהתבסס על השיא של כל ספקטרום מסה, תמונות רב ממדיות משוחזרות. (ב) סכמת השקופית המשמשת בהליך זה. לקבלת רקמת צביעה אופטימלית, יש למקם את החלק לפחות 5 מ"מ מהקצה הצדדי של השקופית ו-10 מ"מ מהקצה התחתון שלה. בעת ציור המחסום ההידרופובי סביב קטע הרקמה, יש לשמור אותו בתוך המלבן לפחות 1 מ"מ מקצה המגלשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: הגדרת שקופיות ביישום ניהול תמונות מבוסס אינטרנט. לפני סריקת שקופיות, יש צורך בהגדרת כל שקופית. הזן את הפרטים הרצויים שיכולים לסייע בזיהוי שקופיות. לחץ על הוסף מקטע (חץ שחור) כדי לכלול את פרטי הבלוק והמיקום. כדי לשמור, לחץ על שלח (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ביום הסריקה, הפעל את מכשיר הרכישה באמצעות תוכנת הבקרה. לחיצה על Exchange Slide פתחה את דלת המכשיר ואפשרה טעינה של שקופית. מיקמנו את השקופית על חריץ הטעינה הפונה כלפי מעלה עם התווית בצד ימין. ניתן לסרוק רק שקופית אחת בו-זמנית. השלב הבא היה בחירת ה-FOVs והתאמת המיקוד והסטיגמה בהתאם לשלבים המתוארים בפרוטוקול. רכשנו תמונות על ידי לחיצה על התחל הפעלה. זמן הרכישה משתנה בהתאם לגודל FOV ולרזולוציה הרצויה. גודל FOV נע בין 200 μm x 200 μm ל 800 μm x 800 μm, אשר מתאים לטווח גודל מסגרת של 128 פיקסלים x 128 פיקסלים ל 2048 פיקסלים x 2048 פיקסלים. קיימות שלוש רזולוציות סטנדרטיות: גסה, עדינה וסופר-סופית. סריקת FOVs גדולים יותר ברזולוציה סופר-דקה גוזלת זמן רב, כאשר זמן הרכישה הסופי עבור FOV אחד נע בין 25 שניות ל-4.7 שעות (איור 5).

איור 5: רכישת תמונה באמצעות תוכנת הבקרה. ניתן להתאים את הגדרות הרכישה לפי הצורך. כדי לשנות את רזולוציית הסריקה, לחץ על התפריט הנפתח על ידי מצב הדמיה (חץ שחור). כדי לשנות את גודל FOV, הזן מספר בשדה גודל FOV (μm) (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר השלמת הסריקה, ערכת תמונות הכוללת את כל ה- FOVs הועלתה באופן אוטומטי ליישום ניהול התמונות מבוסס האינטרנט. מלבד אחסון של תמונות, יישום זה מאפשר הדמיה של כל הערוצים יחד או בנפרד, התאמות תמונה, והורדת תמונות להכנה נוספת. התמונה החזותית הסטנדרטית נשמרת כקובץ TIFF (איור 6).

איור 6: תצוגה חזותית של תמונות באמצעות היישום לניהול תמונות מבוסס אינטרנט. תמונות שנרכשו מאוחסנות וממחישות באמצעות הפלטפורמה המקוונת. התאמת פרמטרי ההדמיה ושינוי הצבע של כל סמן אפשריים. לחץ על הוסף ערוץ תמונה (חץ לבן) כדי לדמיין סמנים אחרים. הגדלה, 200x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הפרעות מתכת טבועות בשיטות תיוג המתכת למרות השימוש באסטרטגיות כדי למזער אותן. כדי להסיר את אותות הרקע העודפים מאיזוטופ מתכת המצומד לנוגדנים ולהכין תמונות לניתוח, השתמשנו בתוכנת עיבוד התמונה המשויכת (ראו טבלת חומרים). הליך הכנת התמונה כולל שני שלבים: 1) תיקון איזוברי, המסיר אותות בין ערוצים, ו-2) סינון, המסיר אותות הנגרמים על ידי אגרגטים בתמונה.

כדי להתחיל את התיקון האיזוברי, הקובץ המכיל את תמונת ה- TIFF שנשמרה נבחר על-ידי לחיצה על סמל הקובץ של חלונית הקלט. התוכנה טוענת באופן אוטומטי את כל תמונות TIFF המאוחסנות בקובץ, ומאפשרת ניתוח אצווה. לאחר מכן, תיקנו את התמונה על ידי לחיצה על סמל המסנן של חלונית הקלט. שני קבצים שהתקבלו עם הסיומת -MassCorrected נוצרו באופן אוטומטי: אחד בארכיון בפורמט TIFF והשני בארכיון בפורמט JSON. כברירת מחדל, הארכיונים שהתקבלו נשמרו באותו קובץ שממנו נטענה התמונה הראשונית (איור 7).

איור 7: הכנת תמונה: שלב תיקון. כדי לטעון תמונה להכנה בתוכנת עיבוד התמונה, לחץ על סמל הקובץ בחלונית הקלט (חץ שחור) ובחר את התמונה. כדי להחיל את הליך תיקון ברירת המחדל, לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט (חץ אדום). כדי לשמור את התמונה המעודכנת והמתוקנת, לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

השלב השני של הכנת התמונה הוא סינון, אשר ניתן לבחור על הכרטיסייה העליונה בתוכנה. בחרנו את התמונה המתוקנת בחלונית הקלט. בשלב זה, טסלציה אוטומטית של וורונוי שימשה כפרמטר הסינון. לחיצה על סמל המסנן בלוח הקלט החילה באופן אוטומטי את המסנן שנבחר על כל הערוצים. בשני שלבי הכנת התמונה (תיקון וסינון), התמונות של כל ערוץ לפני ואחרי העיבוד והבדלי האותות מוצגות בצד ימין של המסך.

בדומה לשלב התיקון האיזוברי, נוצרו שני ארכיונים חדשים, אחד בפורמט TIFF ואחד בפורמט JSON. בשלב זה, הסיומת הבאה אחרי שם הקובץ הייתה -מסונן. לכן, התמונה הסופית שהתקבלה נקראה MassCorrected-Filtered.tiff. על ידי השלמת שלבים אלה, הכנו את התמונה לניתוח באמצעות תוכנת הפתולוגיה הדיגיטלית המועדפת (איור 8 ואיור 9). על ידי שימוש בטכניקה זו, הצלחנו לנתח את כל 23 הסמנים בלוח הנוגדנים עם מינימום הפרעות בין ערוצים ברמה התת-תאית בקטע רקמה אחד.

איור 8: הכנת תמונה: שלב הסינון. בחר סינון בכרטיסייה העליונה (חץ שחור) בתוכנת עיבוד התמונה. תחת פרמטרי סינון, בחר את השיטה הרצויה (חץ ירוק). בחלונית הקלט, בחר תמונה מתוקנת בנפח גדול. כדי להחיל את ההליך שנבחר על התמונה, לחץ על סמל המסנן בחלונית הקלט (חץ אדום). כדי לשמור את התמונה המסוננת המעודכנת, לחץ על תקליטון סמל בחלונית הפלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 9: תמונות מייצגות של הכתמים לפני ואחרי הכנת התמונה. (A) תמונה של מקטע רקמת שקדים מוכתם בטכניקה זו ומוצגת באופן חזותי באמצעות תוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית של צד שלישי לפני סינון ותיקון. (ב) תמונה של אותו מקטע באותם תנאים לאחר שלבי סינון ותיקון. CD20 מוצג בצהוב, Ki67 מוצג במגנטה, CD3 מוצג בלבן, CD11c מוצג בירוק, ציטוקרטין מוצג בציאן, ודנ"א דו-גדילי (dsDNA) מוצג בכחול. הגדלה, 200x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: רשימת לוחות נוגדנים. כל נוגדן הוצמד לאיזוטופ מתכתי מסוים בעל מסה שונה כמפורט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.