Method Article

פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוקלסטים בוגרים הם תאים רב-גרעיניים שיכולים לפרק את העצם באמצעות הפרשת חומצות ואנזימים. הם ממלאים תפקיד מכריע במחלות שונות (למשל, אוסטאופורוזיס וסרטן העצמות) ולכן הם מושאי מחקר חשובים. במבחנה, ניתן לנתח את פעילותם על ידי היווצרות של בורות ספיגה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת בדיקת בור פשוטה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט (CaP), שניתן לדמיין ולכמת בקלות. מבשרי אוסטאוקלסט שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs) עברו תרבית על הלוחות המצופים בנוכחות גירויים אוסטאוקלסטוגניים. לאחר 9 ימי דגירה, אוסטאוקלסטים תוקנו והוכתמו לצורך הדמיה פלואורסצנטית בעוד שציפוי CaP הוכתם על ידי קלצין. כדי לכמת את האזור המחודש, ציפוי ה-CaP על הצלחות הוכתם ב-5% AgNO3 והודגם על ידי הדמיית שדה בהיר. אזור בור הספיגה כומת באמצעות ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוקלסטים (OCs) הם מקרופאגים ספציפיים לרקמות שמקורם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), וממלאים תפקיד מרכזי בשיפוץ העצם יחד עם אוסטאובלסטים1. הפרעות עצם הנגרמות על ידי הורמוני מין, אימונולוגיות וממאירות שהורסות את העצם באופן מערכתי או מקומי נובעות מפעילות אוסטאוקלסטית עודפת, כולל פעילות אוסטאוקלסטית נוספת הקשורה לגיל המעבר2, דלקת מפרקים שגרונית3, מחלת חניכיים4, מחלת עצם מיאלומה5 וגרורות עצם אוסטאוליטיות6. לעומת זאת, פגמים בהיווצרות OC ובתפקוד יכולים גם הם לגרום לאוסטיאופטרוזיס7. HSCs עוברים התמיינות לאבות OC תחת גירוי גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF, סמל הגן ACP5). בנוכחות הן M-CSF והן מפעיל הקולטנים של ליגנד NF-κB (RANKL, סמל הגן TNFSF11), אבות OC מתמיינים עוד יותר ל-OCs חד-גרעיניים ולאחר מכן מתמזגים והופכים ל-OCs מרוביגרעינים 8,9,10. שני הציטוקינים M-CSF ו- RANKL הם הכרחיים ומספיקים להשראת סמנים אוסטאוקלסטיים כגון קולטן קלציטונין (CT), מפעיל קולטן של גורם גרעיני κ B (RANK), משאבת פרוטון V-ATPase, כלוריד ערוץ 7 תת-יחידה אלפא (CIC-7), אינטגרין β3, חומצה פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט (TRAP, סמל הגן ACP5), ציסטאין ליזוזומי פרוטאז פרוטאז קתפסין K (CTSK), ומטריצה מטאלופטידז 9 (MMP9). OCs מופעלים יוצרים אזור איטום על פני העצם באמצעות היווצרות של טבעת אקטין עם גבולמקופל 11,12. בתוך אזור האיטום, OCs מתווכים ספיגה באמצעות פרוטונים מפרישים באמצעות משאבת הפרוטונים V-ATPase12,13, MMP914 ו- CTSK15, מה שמוביל להיווצרות לקונה.

עבור ניסויים במבחנה, ניתן להשיג אבות OC על ידי הרחבה של מקרופאגים של מח עצם מעצם הירך והטיביה של עכברים16,17, כמו גם על ידי בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם אנושי (PBMCs) מדגימות דם ומצופים באפיים 18,19,20, או על ידי התמיינות של התאים המונוציטיים המורין המונצחים RAW 264.7 21,22.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים בדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית בלוחות תרבית תאים מצופים CaP באמצעות OCs שמקורם ב-PBMCs ראשוניים. שיטת לוחות תרבית התאים המצופה CaP המשמשת כאן מאומצת ומעודנת מהשיטה שתוארה קודם לכן על ידי Patntirapong et al.17 ו- Maria et al.21. כדי להשיג מבשרי OC, PBMCs מבודדים על ידי צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות ומורחבים כפי שתואר קודם לכן20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור מספר 287/2020B02).

1. הכנת צלחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט

  1. הכנת תמיסת מלאי סידן (25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O במאגר Tris)
    1. הכינו מאגר Tris של 1.0 M והתאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl.
    2. הגדר זכוכית על מערבל מגנטי והוסף 100 מ"ל של חיץ Tris 1.0 M.
    3. שקלו 0.368 גרם של CaCl2·2H2O, 8.0 גרם של NaCl ו-0.305 גרם של MgCl2·6H2O והתמוססו ב-Tris buffer אחד אחד.
    4. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. חנות בטמפרטורת החדר.
  2. הכנת תמיסת מלאי פוספט (11.1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 במאגר Tris)
    1. הגדר זכוכית על מערבל מגנטי והוסף 100 מ"ל של חיץ Tris 1.0 M.
    2. שקול 0.158 גרם של Na2HPO4· H2O ו-0.353 גרם של NaHCO3 ומתמוססים ב-Tris buffer אחד אחד.
    3. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. חנות בטמפרטורת החדר.
  3. הסתיידות מוקדמת של לוחות תרבית תאים של 96 בארות
    1. הכינו 30 מ"ל של תמיסת עבודה על ידי ערבוב של 15 מ"ל של 1.0 M Tris buffer, 7.5 מ"ל של תמיסת מלאי סידן (שלב 1.1.4) ו-7.5 מ"ל של תמיסת מלאי פוספט (שלב 1.2.3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
    2. הכינו צלחת תרבית תאים של 96 בארות עם תחתית שטוחה. פיפטה 300 μL של תמיסת סידן פוספט (שלב 1.3.1.) לכל באר. כסו את הצלחת במכסה ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
  4. הכנת תמיסת סידן פוספט (2.25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0.14 M NaCl, 50 mM בסיס Tris ב- ddH2O)
    1. הוסף 2 מ"ל של 1 M HCl עד 40 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בכוס עם חרוז ערבוב מגנטי והמסת 0.016 גרם של Na2HPO4· H2O, 0.0295 גרם של CaCl2·2H2O, 0.409 גרם של NaCl, ו-0.303 גרם של בסיס טריס בזה אחר זה.
    2. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. הוסף מים שעברו דה-יוניזציה כדי למלא את הנפח ל-50 מ"ל. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  5. הסתיידות של לוחות תרבית תאים של 96 בארות
    1. שאפו לתמיסת קדם-הסתיידות מלוחות תרבית התאים של 96 הקידוחים מראש והוסיפו 300 μL של תמיסת סידן פוספט (שלב 1.4.2) לכל באר. מכסים את הצלחות במכסה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
    2. הופכים את הצלחת כדי לשפוך את התמיסה ושוטפים את הצלחת שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה ביסודיות. מייבשים את הצלחת באופן מיידי באמצעות מייבש שיער או גז CO2 או N2 דחוס כדי לשמור על משטח אחיד.
    3. לעקר את הצלחת המצופה על ידי קרינת UV בספסל נקי למשך שעה אחת. השתמשו בצלחת המצופה באופן מיידי או אטמו את הצלחת בפרפילם ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר.

2. בידוד של PBMCs מדם היקפי אנושי

  1. שואבים 15 מ"ל דם מהווריד לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב מתורם הדם (הצבעה אתית: 287/2020B02).
  2. מדללים 15 מ"ל של דם טרי בנפח שווה של PBS ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים או על ידי משיכת התערובת פנימה והחוצה מתוך פיפטה.
  3. הכינו צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל תמיסת שיפוע צפיפות של 15 מ"ל (לדוגמה, פיקול, טבלת חומרים) לכל צינור. הטו את הצינור ושכבו בזהירות 30 מ"ל של דגימת דם מדוללת על תמיסת שיפוע הצפיפות של 15 מ"ל (דגימת דם מדוללת: תמיסת שיפוע צפיפות, יחס של 1:0.5-1).
    הערה: בעת כיסוי המדגם, שים לב לא לערבב את תמיסת שיפוע הצפיפות עם דגימת הדם המדוללת.
  4. צנטריפוגה ב 810 x g במשך 20 דקות ב 20 °C ברוטור דלי מתנדנד ללא בלם.
  5. שואפים לשכבה העליונה ומשאירים את שכבת התאים החד-גרעיניים (לימפוציטים, מונוציטים ופקמבוציטים) ללא הפרעה באינטרפאזה.
  6. העבר בזהירות את שכבת התא החד-גרעיני לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  7. מלאו את הצינור ב-PBS, ערבבו וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס (ניתן להשתמש בבלם משלב זה ואילך).
  8. בזהירות להסיר supernatant לחלוטין. בצעו החייאה של כדור התא ב-50 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין.
  9. להסרת טסיות דם, החייאת גלולת התא ב-50 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין.
  10. העברת תאים שעברו החייאה לצלוחיות תרבית תאים להרחבת אבות ה-OC.

3. הרחבת אבות OC

  1. PBMCs Resuspend α-MEM שלם (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% אמפוטריצין B) המכילים 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF. PBMCs זרעים בצפיפות של 2.5 x 105 תאים / ס"מ2. בדרך כלל, תאים מבודדים מ 15-20 מ"ל דם טרי ניתן לזרוע בבקבוק אחד 75 ס"מ2 (1.5-2 x 107 תאים).
  2. הזן את התאים עם α-MEM שלם טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF בכל יום שלישי עד שהתאים המחוברים מגיעים למפגש הרצוי. תפוקות אופייניות הן 1.5-2 x 106 תאים/בקבוקונים כאשר התאים נפגשים ב-95%. בדרך כלל, תקופת ההרחבה נמשכת 6 ימים.
    הערה: הפוטנציאל האוסטיאוקלסטוגני של המבשרים יכול לרדת עם זמן גידול ממושך.

4. אינדוקציה של אוסטאוקלסטוגנזה בלוחות מצופים CaP

  1. כדי להקל על הידבקות התאים, הדגירה של הלוחות המצופים CaP עם 50 μL של FBS למשך שעה אחת באינקובטור של 37 °C.
  2. כדי לנתק את מבשרי ה-OC, שטפו את הבקבוקון עם PBS פעמיים כדי להסיר תאים מתים או שאינם דבקים. הוסף 4 מ"ל של טריפסין (טבלת חומרים) לכל 75 ס"מ2 בקבוקונים, למשך 30 דקות.
    1. מוסיפים 4 מ"ל של α-MEM שלם כדי לעצור את העיכול, מנתקים בזהירות את התאים באמצעות מגרד תאים ומעבירים את התאים לצינור של 50 מ"ל.
    2. קבע את מספר התא הכולל באמצעות תא נויבאואר או דומה.
  3. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 350 x g. בצעו שימוש חוזר בכדור α-MEM שלם מספיק המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-20 ננוגרם/מ"ל RANKL כדי לקבל ריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל.
  4. תמיסת FBS משואפת מצלחת CaP מצופה 96 קידוחים ופיפטה 200 μL של תרחיף התא לבאר (2 x 105 תאים/באר).
  5. דגירה של מבשרי ה- OC לתקופת הזמן הרצויה או עם הריאגנטים הרצויים הרלוונטיים לתכנון הניסוי. בדרך כלל, ניתן לצפות במספרים גבוהים של OCs גדולים ורב-גרעיניים לאחר 6 ימים וכאשר נוצרים בורות ספיגה. תאי הזנה עם מדיום α-MEM מלא ורענן המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-20 ננוגרם/מ"ל RANKL בכל יום שלישי.
  6. בסוף הדגירה, לשטוף תאים עם PBS פעמיים, לתקן עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות, ולשטוף עם PBS שוב.
  7. השתמש ב- OCs הקבועים ישירות לצביעה פלואורסצנטית או אחסן בטמפרטורה של 4 °C (74 °F).

5. צביעה פלואורסצנטית של OCs וציפוי CaP

  1. דגירה של התאים הקבועים עם מאגר חדירה (0.1% טריטון ב-PBS) למשך 5 דקות.
  2. חוטי אקטין עם 100 μL של AlexaFluor 546 מסומן תמיסת פלואידין ב- PBS במשך 30 דקות ושואפים לתמיסת הכתם. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם /מ"ל ב- PBS) למשך 10 דקות כדי להכתים גרעינים. ניתן גם להשתמש ב-DAPI.
  3. ציפוי CaP כתם עם 100 μL של 10 μM calcein ב- PBS למשך 10 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולצלם תמונות.
  4. לאחר הדמיה פלואורסצנטית ניתן להשתמש באותם לוחות כדי לכמת את אזור בור הספיגה על ידי צביעת פון קוסה. כדי לעשות זאת, לשטוף את הצלחות עם מים deionized פעמיים.

6. כימות שטח בור הספיגה הכולל

  1. כדי להכתים את ציפוי CaP בכתם Von Kossa, יש לדגום עם 50 μL של 5% AgNO3 במים שעברו דה-יוניזציה לבאר תחת קרינת UV במשך שעה אחת, עד שהציפוי בתחתית הבארות הפך חום.
  2. שטפו את הצלחת שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה וצלמו תמונות של שדה בהיר. מטרה עם הגדלה מועטה, כגון מטרה של פי 1.25, יכולה לשמש כדי ללכוד את כל הבאר בתמונה אחת. זה מקל על ניתוח התמונה הבאה. ניתן ליישם שיטות חלופיות ללכידת כל שטח הבאר.
  3. פתיחת קובץ תמונה עם ImageJ: קובץ | | פתוח תמונה | סוג | 8 סיביות. אמת את יחידת קנה המידה בפינה השמאלית התחתונה של התמונה באמצעות קו ישר | לנתח | קבע קנה מידה. הזן את האורך בשמיכת "המרחק הידוע", הזן יחידת קנה מידה חדשה ביחידת אורך וסמן את התיבה גלובל.
  4. רשימת פרמטרים למדידה שיש לנתח: ניתוח | הגדר מדידות. בחלון הגדר מדידות, סמן את התיבות אזור והגבלה לסף.
  5. מדוד את שטח הבורות: תמונה | התאמת | סף. בחלון סף, סמן את תיבת הסימון רקע כהה ולחץ על אוטומטי. אזור הבורות הופך לאדום. סגור את חלון הסף ובחר נתח | למדוד. שמירת קובץ התוצאה: קובץ | שמור כ.

7. כימות של מספר וגודל OC, ואזור בור ספיגה מנורמל

  1. פתח תמונה פלואורסצנטית של אוסטאוקלסטים עם ImageJ ואמת את יחידת קנה המידה (ראה שלב 6.3).
  2. רשימת פרמטרים למדידה שיש לנתח: ניתוח | הגדר מדידות. בחלון הגדר מדידות, סמן את התיבה אזור .
  3. תאר את ה-OCs באמצעות בחירות של מנהל ROI ומצולע: נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה. לחץ על בחירות מצולע בערכת הכלים, תאר/י OC אחד (תאים עם טבעת אקטין ≥ שלושה גרעינים) ולחץ על הוסף [t] בחלון ROI Manager. חזור על התוויה עד שכל ה- OCs ייכללו.
  4. מדוד את המספר והגודל של OCs: בחר את כל הפריטים ב-ROI Manager ולחץ על מדידה. שמירת קובץ התוצאה: קובץ | שמירה בשם (איור 3E).
  5. מדוד את אזור הבור של תמונות פלואורסצנטיות. פתח את התמונה הפלואורסצנטית של הציפוי בקורלציה עם התמונה בשלב 7.3 ווודא את יחידת קנה המידה (ראה שלב 6.3).
    1. רשום פרמטרים למדידה שיש לנתח (ראה שלב 6.4). בחר | תמונה התאמת | סף. בחלון סף, בטל את הסימון של כל התיבות ולחץ על אוטומטי. אזור הבורות הופך לאדום. סגור את חלון הסף ובחר נתח | למדוד. שמור את קובץ התוצאות.
  6. חשב שטח בור מנורמל לפי מספר OC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציפוי הסידן פוספט בתחתית לוחות תרבית התאים בוצע בשני שלבי ציפוי הכוללים הסתיידות מוקדמת של 3 ימים ושלב הסתיידות של יום אחד. כפי שניתן לראות באיור 1, סידן פוספט בעל פיזור אחיד הושג בתחתית הלוחות בני 96 הבארות. הציפוי נדבק היטב לתחתית לאחר שלבי הכביסה שבוצעו.

figure-results-1
איור 1: תמונה מייצגת של ברייטפילד של ציפוי ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית באמצעות OCs הנגזרים ומורחבים במבחנה מ- PBMCs. ניתן להכין בקלות את לוחות תרביות התאים המשומשים בציפוי CaP ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בנוסף ל-PBMCs לא ממוינים שאומצו בפרוטוקול זה, OCs שנוצרו מתאים מונוציטיים של מורין21 ותאי מקרופאג' מח עצם17 עברו תרבית גם על מצעים סינתטיים דומים לצורך בדיקת בור, ולכן ניתן להעביר את מקורות התאים הללו לגישה זו בהתייחס לספרות המתאימה.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מועצת המלגות של סין [CSC No. 201808440394]. W.C. מומן על ידי CSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110כסף חנקתי
A-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, ללא נוקלאוזידים
אמפוטריצין BBiochrom03-028-1Bתמיסת אמפוטריצין B
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50Gסידן כלוריד דיהידראט
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524סרום בקר עוברי
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
מאגר קיבועBiolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000חומצה הידרוכלורית
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25רקומביננטי אנושי M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6מגנזיום כלוריד
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- נתרן מימן פוספט נטול מים
NaClMerkS7653-250Gנתרן כלורי
NaHCO3merkK15322429ביקרבונט של סודה
PBSLonza17-512FDulbecco Phosphate Buffered Salt (1X), DBPS ללא סידן ומגנזיום
עט-סטרפטוקוקוסלונזהDE17-602Eתערובת פניצילין-סטרפטומיצין
פלואידין-אלקסה פלואור 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01ליגנד sRANK אנושי רקומביננטי (נגזר מ-E.coli)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787אלקיל פניל פוליאתילן גליקול
TrypLE ExpressGibco12605010אנזימי דיסוציאציה תאים רקומביננטיים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8(2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578(2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles