Method Article

פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוקלסטים בוגרים הם תאים רב-גרעיניים שיכולים לפרק את העצם באמצעות הפרשת חומצות ואנזימים. הם ממלאים תפקיד מכריע במחלות שונות (למשל, אוסטאופורוזיס וסרטן העצמות) ולכן הם מושאי מחקר חשובים. במבחנה, ניתן לנתח את פעילותם על ידי היווצרות של בורות ספיגה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת בדיקת בור פשוטה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט (CaP), שניתן לדמיין ולכמת בקלות. מבשרי אוסטאוקלסט שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs) עברו תרבית על הלוחות המצופים בנוכחות גירויים אוסטאוקלסטוגניים. לאחר 9 ימי דגירה, אוסטאוקלסטים תוקנו והוכתמו לצורך הדמיה פלואורסצנטית בעוד שציפוי CaP הוכתם על ידי קלצין. כדי לכמת את האזור המחודש, ציפוי ה-CaP על הצלחות הוכתם ב-5% AgNO3 והודגם על ידי הדמיית שדה בהיר. אזור בור הספיגה כומת באמצעות ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוקלסטים (OCs) הם מקרופאגים ספציפיים לרקמות שמקורם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), וממלאים תפקיד מרכזי בשיפוץ העצם יחד עם אוסטאובלסטים1. הפרעות עצם הנגרמות על ידי הורמוני מין, אימונולוגיות וממאירות שהורסות את העצם באופן מערכתי או מקומי נובעות מפעילות אוסטאוקלסטית עודפת, כולל פעילות אוסטאוקלסטית נוספת הקשורה לגיל המעבר2, דלקת מפרקים שגרונית3, מחלת חניכיים4, מחלת עצם מיאלומה5 וגרורות עצם אוסטאוליטיות6. לעומת זאת, פגמים בהיווצרות OC ובתפקוד יכולים גם הם לגרום לאוסטיאופטרוזיס7. HSCs עוברים התמיינות לאבות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור מספר 287/2020B02).

1. הכנת צלחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט

  1. הכנת תמיסת מלאי סידן (25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O במאגר Tris)
    1. הכינו מאגר Tris של 1.0 M והתאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl.
    2. הגדר זכוכית על מערבל מגנטי והוסף 100 מ"ל של חיץ Tris 1.0 M.
    3. שקלו 0.368 גרם של CaCl2·2H2O, 8.0 גרם של NaCl ו-0.305 גרם של MgCl2·6H2O והתמוססו ב-Tris buffer אחד אחד.
    4. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. חנות בטמפרטורת החדר.
      5. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציפוי הסידן פוספט בתחתית לוחות תרבית התאים בוצע בשני שלבי ציפוי הכוללים הסתיידות מוקדמת של 3 ימים ושלב הסתיידות של יום אחד. כפי שניתן לראות באיור 1, סידן פוספט בעל פיזור אחיד הושג בתחתית הלוחות בני 96 הבארות. הציפוי נדבק היטב לתחתית לאחר שלבי הכביסה שבוצעו.

figure-results-1
איור 1: תמונה מייצגת של ברייטפילד של ציפוי ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית באמצעות OCs הנגזרים ומורחבים במבחנה מ- PBMCs. ניתן להכין בקלות את לוחות תרביות התאים המשומשים בציפוי CaP ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בנוסף ל-PBMCs לא ממוינים שאומצו בפרוטוקול זה, OCs שנוצרו מתאים מונוציטיים של מורין21 ותאי מקרופאג' מח עצם17 עברו תרבית גם על מצעים סינתטיים דומים לצורך בדיקת בור, ולכן ניתן להעביר את מקורות התאים הללו לגישה זו בהתייחס לספרות המתאימה.

.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מועצת המלגות של סין [CSC No. 201808440394]. W.C. מומן על ידי CSC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110כסף חנקתי
A-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, ללא נוקלאוזידים
אמפוטריצין BBiochrom03-028-1Bתמיסת אמפוטריצין B
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50Gסידן כלוריד דיהידראט
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524סרום בקר עוברי
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
מאגר קיבועBiolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000חומצה הידרוכלורית
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25רקומביננטי אנושי M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6מגנזיום כלוריד
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- נתרן מימן פוספט נטול מים
NaClMerkS7653-250Gנתרן כלורי
NaHCO3merkK15322429ביקרבונט של סודה
PBSLonza17-512FDulbecco Phosphate Buffered Salt (1X), DBPS ללא סידן ומגנזיום
עט-סטרפטוקוקוסלונזהDE17-602Eתערובת פניצילין-סטרפטומיצין
פלואידין-אלקסה פלואור 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01ליגנד sRANK אנושי רקומביננטי (נגזר מ-E.coli)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787אלקיל פניל פוליאתילן גליקול
TrypLE ExpressGibco12605010אנזימי דיסוציאציה תאים רקומביננטיים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles