מאמר שיטה

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

DOI:

10.3791/64023

⸱

18 בנובמבר 2022

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביוכימיה חזותית היא טכניקה רבת עוצמה להתבוננות בתכונות הסטוכסטיות של אנזימים בודדים או קומפלקסים של אנזימים המוסתרים בממוצע המתרחש במחקרים בתפזורת. כדי להשיג הדמיה, פינצטות אופטיות כפולות, שבהן מלכודת אחת קבועה והשנייה ניידת, ממוקדות בערוץ אחד של תא מיקרופלואידי מרובה זרמים הממוקם על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הפינצטה האופטית לוכדת מולקולות בודדות של דנ"א מסומן פלואורסצנטי וזרימת נוזלים דרך החדר ומעבר לחרוזים הלכודים, מותחת את הדנ"א לצורת B (תחת כוח מינימלי, כלומר 0 pN) כאשר חומצת הגרעין נצפית כחוט לבן על רקע שחור. מולקולות דנ"א מועברות מזרם אחד למשנהו, על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה כדי לאפשר ייזום תגובות באופן מבוקר. כדי להשיג הצלחה, התקנים microfluidic עם ערוצים ברורים אופטית מחוברים מזרקי זכוכית מוחזקים במקום משאבת מזרק. תוצאות אופטימליות משתמשות במחברים המחוברים באופן קבוע לתא הזרימה, צינורות קשיחים מכנית ועמידים כימית, ואשר מחוברים לשסתומי מיתוג המסלקים בועות האוסרות על זרימה למינרית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א ברמת המולקולה הבודדת ובזמן אמת סיפקה תובנה משמעותית לגבי יציבות הגנום 1,2. בנוסף לעבודה עם מולקולות בודדות של דנ"א בזו אחר זו, היכולת להציג עסקאות בין מולקולות בודדות בקרבת מקום מספקת תובנה נוספת 3,4,5. המניפולציה של מולקולות דנ"א נוספות דורשת הן מלכודות אופטיות נוספות והן תאי זרימה מיקרופלואידית איכותיים, רב-ערוציים,6.

קיימות מספר שיטות ליצירת יותר ממלכודת אופטית אחת. אלה כוללים מראות סריקת גלוונומטר, מודולטורים אופטיים אקוסטיים ואופטיקה דיפרקטיבית, המייצרים פינצטה אופטית הולוגרפית 4,7,8,9. לעתים קרובות, מראות סורקות ומודולטורים אופטיים אקוסטיים מייצרים מלכודות המשותפות בזמן. במערך המתואר כאן, הקרן של לייזר Nd:YAG יחיד מפוצלת על קיטוב, ואז מראות סריקת לייזר גלוונומטר שולטות במיקום של מה שמכונה מלכודת ניידת (איור 1)4. כדי להקל על מיקום המראות והמסננים כדי לכוון את קרן הלכידה למפתח הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, נעשה שימוש בלייזר HeNe. זה הופך את היישור הכללי לקל יותר מכיוון שקרן HeNe נראית לעין בלתי, בעוד שקרני אינפרא אדום אינן. קרן HeNe גם בטוחה יותר לעבודה עם הפיכת המיקום של מראות ורכיבים אחרים לפחות מלחיץ. בתחילה, נתיב הקרן עבור לייזר זה נפרד מן הקרן 1064 ננומטר, אבל הוא הציג לתוך אותו נתיב קרן, ולאחר מכן לתוך מטרת המיקרוסקופ. לאחר השגת יישור פיזי, נעשה מיקום קרן 1064 ננומטר על גבי קרן HeNe וזה מתאפשר על ידי שימוש בצופה אינפרא אדום ובכלי הדמיית קרן שונים כדי לדמיין את מיקום הקרן ואיכותה. לאחר מכן, מרחיב הקרן מוצג, וקרן האינפרא אדום המורחבת המתקבלת מיושרת על הפתח האחורי של המטרה. לבסוף, המטרה מוסרת והעוצמה בכל קרן מקוטבת נמדדת ומותאמת באמצעות לוחות גל λ/2 כדי להיות שווים (איור 1C). מדידות הספק נעשות גם לאחר החזרת המטרה ובדרך כלל יש אובדן הספק של 53%. עם זאת, יש מספיק כוח כדי ליצור מלכודות אופטיות קבועות ונעות יציבות במישור המוקד (איור 1D).

כדי לדמות עסקאות דנ"א, תאי זרימה מיקרופלואידיים ממלאים תפקיד מפתח כשהם מאפשרים מדידות מבוקרות ברמת המולקולה הבודדת עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (איור 2). המונח microfluidic מתייחס ליכולת לתפעל נוזלים בערוץ אחד או יותר עם ממדים הנעים בין 5-500 מיקרומטר10,11. המונח זרם מתייחס לנוזל בפועל בתוך ערוץ והערוץ מתייחס לערוץ הפיזי שבו זרם זורם או זרמים נעים. לתכנון תא זרימה חד-ערוצי יש ערוץ פיזיקלי משותף שבו נצפות תגובות, ובדרך כלל קיים רק זרם נוזל אחד. לפיכך, עיצובים אלה ידועים כתאי זרימה חד-זרמיים. לעומת זאת, תאי זרימה מרובי זרמים מוגדרים כמכשיר מיקרופלואידי שבו שני ערוצי כניסה או יותר מתכנסים לערוץ פיזיקלי יחיד ומשותף (איור 2A). בתוך הערוץ המשותף, הזרמים הזורמים שמקורם בערוצים הבודדים זורמים במקביל זה לזה, ונותרים מופרדים כאשר הערבוב המינימלי ביניהם מתרחש רק כתוצאה מדיפוזיה (איור 2B). ברוב המערכות הניסיוניות, משאבה אחת דוחפת נוזלים לכל ערוץ באותה מהירות. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בהיגוי גבול, שלוש משאבות או יותר, הנשלטות באופן עצמאי, דוחפות נוזלים דרך התעלות. עם זאת, כל משאבה פועלת במהירות שונה אך קצב הזרימה נטו בערוץ המשותף הואקבוע 12. זה מאפשר החלפה מהירה של רכיבי הערוץ הראשי פשוט על ידי שינוי מהירות המשאבה.

בנוסף לזרימה הלמינרית, גורם קריטי נוסף הוא פרופיל המהירות הפרבולית בתוך זרם הנוזל הלמינרי. מהירות הזרימה הגבוהה ביותר מתרחשת באמצע הנחל, והאיטית ביותר מתרחשת ליד המשטחים (איור 2C)13. יש לשקול פרופיל זה כדי למתוח באופן מלא מולקולת דנ"א המחוברת לחרוז המוחזק בזרם לצורך הדמיה מדויקת של דנ"א פלואורסצנטי וניתוחים מדויקים של מולקולה בודדת. כאן, הדנ"א נמתח לצורת B ומוחזק במקומו תחת 0 pN של כוח. כדי להשיג זאת, המיקוד של מיקום ההשמנה האופטית צריך להיות במיקום של 10-20 מיקרומטר ממשטח הכיסוי התחתון (איור 2D). יש להקפיד על כך שמולקולת הדנ"א לא תימתח מעבר לצורת B, שכן הדבר עלול לעכב תגובות אנזימיות. בתנאי חיץ טיפוסיים, 1 מיקרומטר = 3,000 bp של DNA14. יתר על כן, על ידי לכידת 10-20 מיקרומטר מהכיסוי, קומפלקס הדנ"א ממוקם הרחק מפני השטח ובכך ממזער את האינטראקציות על פני השטח.

שיטות רבות שימשו ליצירת ערוצי התקנים מיקרופלואידיים וניתן לעשות זאת במעבדה או לרכוש תאי זרימה ממקורות מסחריים 6,15,16,17. החומרים האופטימליים המשמשים לבניית תאי הזרימה חייבים להיות קשיחים מכנית, שקופים אופטית עם פלואורסצנטיות נמוכה, ואטומים לממיסים אורגניים6. לעתים קרובות, זכוכית צפה בורוסיליקט, או סיליקה מתמזגת משמשים כדי לספק סביבת זרימה יציבה לזמן ממושך המתאימה להשמנה אופטית, הדמיה וזיהוי כוח. חומרים אלה מאפשרים גם שימוש בממיסים לא מימיים (למשל, מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית) כדי לפשט את ההרטבה וההסרה של בועות אוויר, ודנטורנטים (למשל, 6M guanidinium hydrochloride) או דטרגנטים לניקוי תא הזרימה. לבסוף, השיטות המשמשות להחדרת נוזלים לתאי זרימה משתנות ממערכות משאבות ואקום מורכבות למשאבות מזרק יחיד 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. בגישה המתוארת כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק שיכולה להכיל עד 10 מזרקים (איור 3A). הדבר מספק גמישות לשימוש בתאי זרימה חד-ערוציים או בתאי זרימה עם ערוצי כניסה מרובים. כאן נעשה שימוש בתא זרימה בעל שלושה ערוצים, והוא מחובר למזרקים המוחזקים במקומם על משאבת המזרק באמצעות צינורות פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK) (איור 3A-C). זרימת הנוזלים נשלטת על-ידי שסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים, ולכן היא משמשת למזעור החדרת בועות לתא הזרימה (איור 3A,D). בנוסף, מזרקי המילטון בעלי דפנות זכוכית נוקשות ובוכנות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן (PTFE), מומלצים מכיוון שהם מספקים תנועת בוכנה חלקה במיוחד החיונית להשגת זרימה חלקה14,27.

במערכת הניסוי המתוארת נעשה שימוש בתאי זרימה עם שניים עד חמישה ערוצי כניסה. מספר ערוצי הכניסה מוכתב על ידי הניסוי שנעשה. לצורך המחקר של RecBCD ו- Hop2-Mnd1, שני ערוצי זרם היומספיקים 14,28. עבור ההליקאז, האנזים נקשר לקצה החופשי של הדנ"א ותורגם לזרם המכיל מגנזיום ו-ATP כדי ליזום טרנסלוקציה ושחרור. עבור Hop2-Mnd1, דנ"א לכוד אופטית תורגם לזרם הנוזלים הסמוך המכיל חלבונים וחיץ ± יוני מתכת דיוולנטיים. השימוש בתאי זרימה תלת-ערוציים מאפשר ללכוד דנ"א בזרם 1, לתרגם את הדנ"א לזרם 2 כדי לאפשר קשירת חלבונים, ולאחר מכן להזרים 3 היכן ש-ATP נמצא, למשל, כדי ליזום תגובות. וריאציה על האמור לעיל היא להשתמש בחלבון מתויג פלואורסצנטי בערוץ 2, מה שגורם לזרם הנוזלים להיות לבן לחלוטין ומונע הדמיה של הדנ"א. כאשר מולקולה זו מתורגמת לזרם 3, גם חלבונים וגם דנ"א נראים כעת כאשר מתחילות תגובות.

השימוש בשסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים לשליטה בזרימת הנוזלים הוא מרכיב קריטי במערכת לסילוק בועות בתאי הזרימה. בועות מזיקות לזרימת נוזלים יציבה כאשר הן מתכווצות ומתרחבות בדרכים בלתי צפויות וכתוצאה מכך שינויים מהירים במהירות הזרימה והכנסת מערבולות. כאשר השסתומים ממוקמים בין מזרקים וצינורות כניסה, נתיב הזרימה מנותק על ידי החלפת מיקום השסתום כאשר מזרקים מוחלפים. כאשר מזרק חדש הוא הניח במקום, הבוכנה יכולה להיות מדוכאת באופן ידני כך >6 μL נפלט (נפח מת של השסתום) וזה מבטל בועות כמעט לחלוטין.

החיבור של מחברים לתאי זרימה הוא לעתים קרובות השלב המגביל את הקצב בשימוש בתאי זרימה. אנו מתארים את השימוש בשני סוגים של מחברים: נשלפים המכונים התאמה לעיתונות וקבועים (מכללי ננו-פורט). המחברים הנשלפים פשוטים להיצמד לתא זרימה וניתן לבדוק סוגים שונים של צינורות גמישים בנוסף ל- PTFE המומלץ עם מחברים אלה. זוהי דרך מהירה וחסכונית לבדוק צינורות ומחברים מבלי להקריב תאי זרימת זכוכית יקרים יותר. לעומת זאת, מכלולי ננו-פורט מחוברים באופן קבוע, עומדים בלחצים של עד 1,000 psi, ובידינו השימוש בהם מוגבל לצינורות PEEK בקטרים שונים. זה לא חיסרון שכן עדיף להשתמש בצינורות PEEK. תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים מחוברים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך יותר משנה עם שימוש זהיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יישור מלכודת לייזר ובדיקה עם חרוזי פוליסטירן

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 1A,B.

התראה: על הנסיין להרכיב משקפי מגן מתאימים או משקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן לייזר. מכיוון שמערכת הפינצטה האופטית המתוארת כאן משתמשת הן באלומות HeNe והן באלומות IR, נדרשים שני סטים נפרדים של כלי זכוכית בטיחותיים ללייזר.

  1. יישור קרן HeNe
    1. מקם את כל הרכיבים האופטיים על לוח הלחם. יישרו את לוח הלחם כך שיהיה קרוב ככל האפשר לזווית של 90° ביחס למיקרוסקופ.
    2. חברו את צינור ההזדווגות המכיל את המטרה ואת עדשת הטלאן למיקרוסקופ (איור 1A-11,12).
      הערה: עדשת הטלאן היא מערכת עדשות המשמשת למיקוד התמונה במישור התמונה הבינוני בעיניות.
    3. הפעל את לייזר HeNe ופתח את התריס (איור 1A-18). הקרן צריכה לפגוע במסנן (איור 1A-3) בגובה של 54 מ"מ המשקף 50% מהאור על מראה 5 (איור 1A-5). 50% הנותרים של הקרן פוגעים במראה 4 (איור 1A-4) באותו גובה כמו מראה 3.
    4. התאימו את המראה 4 (איור 1A-4) כך שהקרן תפגע במראה 6 (איור 1A-6) בגובה של 51 מ"מ.
    5. כוונן את המראה 6 (איור 1A-6) כך שהקרן תופנה למראה הגלוונית התחתונה בגובה של 51 מ"מ. הקורה היוצאת מהמראה הגלוונית העליונה תהיה בגודל 57.5 מ"מ.
    6. התאימו את המראה 3 (איור 1A-3) כך שקרן זו תפגע במראה 5 (איור 1A-5) בגובה של 57.5 מ"מ. לאחר שהיא משתקפת ממראה 5, הקרן צריכה להכות במראה 9 (איור 1A-9) באותו גובה. הקרן מתמזגת למעשה במראה 9, עוברת דרך המטרה, ומערכת עדשות טלאן אל מראה 21 (איור 1A-21), אשר משקפת אותה לתוך המטרה.
    7. הניחו שקופית מיקרוסקופ נקייה על במת המיקרוסקופ. הפעל את המצלמה וצלם את הקורות של הקורות הקבועות והסורקות בנפרד על המסך. החל ממראה 3, לאחר מכן 5 ו -9, ולבסוף 21, בצע התאמות קטנות כדי למקם את הקרן הקבועה במרכז המסך.
    8. כדי להבטיח שזווית היציאה מקרן 21 תהיה 90°, שנה את גובה Z של המיקרוסקופ ומקם את הקרן המצולמת על המשטחים העליונים והתחתונים של המגלשה. כאשר הם זהים, הקרן נמצאת במיקום הנכון, אשר בניצב לבמה. צמצם קרן זו באמצעות תריס 19 (איור 1A-19).
    9. החל ממראות 4 ו-6, בצעו התאמות קטנות כדי למקם את הקורה הקבועה במרכז המסך. תריס את הקורה הזו.
  2. יישור קרן אינפרא אדום (IR)
    התראה: בצע את כל השלבים בעוצמת לייזר נמוכה מטעמי בטיחות.
    1. התאם את לוח הגלים 14 (איור 1A-14) כדי להתאים את היחס בין האלומות המועברות והמשתקפות המפוצלות במפצל הקרן 2 (איור 1A-2). מפצל קרן 2 משקף את רכיב ה-s של קרן הלייזר ומעביר את רכיב ה-p.
    2. הקרן שעוברת דרך 2 פוגעת במראה 7 (איור 1A-7), מה שמסיט את הקרן אל המראה הגלוונית התחתונה. זה צריך ללכת בדרך של קרן HeNe אל מראה 21. בצע תנועות קטנות של מראה 7 כדי להשיג מיקום זה.
    3. כוונן את מראה 2 כך שהקרן המשתקפת על-ידי מראה 2, תפגע במראה 10 (איור 1A-10) בגובה של 57.5 מ"מ.
    4. הקרן משתקפת ממראה 10 אל מראה 8 (איור 1A-8) בגובה של 57.5 מ"מ. הקורה הבאה צריכה להכות במראה 9 באותו גובה. אם לא, בצע התאמות קטנות למראות 10 ו- 8 כנדרש.
    5. הסר את המטרה והנח את ראש מד הכוח מעל היציאה בצריח המטרה.
    6. השתמשו בלוחות 14, 15 ו-16 (איור 1A-14,15,16) כדי להתאים את העוצמה של כל קרן לייזר כך שתהיה שווה כפי שמוצג באיור 1C.
    7. שים את מרחיב הקרן 1 (איור 1A-1) במקומו. התאם את קרן הלייזר המורחבת כך שתהיה מעגלית ללא כל תרדמת או אסטיגמציה.
    8. כדי לבדוק את המלכודות האופטיות, צור פתרון של חרוזי פוליסטירן 1 מיקרומטר התלויים במים. לאחר מכן, הניחו 10 מיקרוליטר של תמיסה זו על שקופית מיקרוסקופ, הניחו כיסוי על גביו ואטמו עם לק. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ובדוק את המלכודות האופטיות על ידי לכידת חרוזים אלה של 1 מיקרומטר. ודא כי החרוזים נשאבים לתוך המלכודות ומוחזקים ביציבות כאשר הבמה מועברת. ההשמנה צריכה להתרחש ביעילות שווה מכל צידי המלכודת.

2. הכנת תא מיקרופלואידי

  1. אם תא הזרימה הוא התקן שנבנה באופן מסחרי העשוי מפולידימתילסילוקסן (PDMS) על גבי כיסוי, המשך לשלב 3. אם זהו התקן זכוכית עם מחברים מחוברים, המשך לשלב 4.
  2. אם לתא הזרימה אין מחברים מחוברים, חברו אותם תחילה לחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. עיין בשלב 3 לקבלת השלבים לחיבור מחברים.

3. חיבורי תאי זרימה באמצעות תא זרימה PDMS

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2D.

  1. הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך היציאה המוכנה מראש (היציאה יכולה לתמוך בלחץ של 2 קווי בר).
  2. חזור על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות. חברו את יציאות הכניסה למשאבת המזרק ולשקע לבקבוק פסולת (איור 4A,B).
  3. מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
  4. העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
  5. למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.

4. חיבור של מחברי צינורות מתאימים לעיתונות

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2F.

  1. אם יש להשתמש במחברי צינורות המתאימים ללחיצה, הסר בזהירות את סרט ההדבקה מצד אחד של המחבר והנח אותו מעל החור בשקופית המיקרוסקופ. לחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. חזור על התהליך עבור המחברים הנותרים.
  2. הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך החור המוכן מראש ביציאה וחזרו על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות.
  3. חברו צינורות מהכניסות לשסתומי המיתוג. המשך לשלב 7.

5. צירוף מכלולים קבועים

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2A-C.

  1. בצע את החיבור על משטח נקי ושטוח או על סעפת שנבנתה בהתאמה אישית כדי להחזיק את תא הזרימה והמחברים במקומם בזמן ההדבקה.
  2. הניחו את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי או בחלק השקוע של הסעפת (איור 2B). מניחים כמות קטנה של דבק זכוכית בתחתית המכלול ומכניסים את האטם.
  3. מקם את הננו-יציאה מעל אחד מחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. יש לדחוף בעדינות כלפי מטה ולהחזיק במקומם ללא תזוזה לרוחב. חזור על התהליך עבור היציאות הנותרות.
  4. אפשר להתייבש או להדק במקומו בסעפת. הסר בעדינות את תא הזרימה מהסעפת וודא שהמכלולים מתיישרים היטב עם יציאות הכניסה בתא הזרימה. המשך לשלב 7 כשתהיה מוכן.

6. חיבורי תאי זרימה והכנה

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 4A,B.

  1. מניחים תא זרימה על במת המיקרוסקופ. חבר את הצינורות באמצעות המחברים ההדוקים לאצבעות.
  2. מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
  3. העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
  4. למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.

7. שליטה על זרימת הנוזלים

  1. סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C). הסר את המזרקים, להשליך את המים שיורית, ולמלא את המזרקים עם פתרונות ניסיוניים, למשל, חרוזי DNA; אנזים; ו-ATP. החזירו מזרקים למשאבה וחברו אותם לשסתומי המיתוג.
  2. במצב זה, כפו ידנית את הבוכנות כלפי מטה 5-10 μL כדי להסיר בועות. שנה את מיקום שסתום המיתוג לפתיחה.
  3. השתמש בסכמת קצב הזרימה כדי להשיג מהירות זרימה זורמת אופטימלית להשמנה ולתצוגה חזותית כמתואר בטבלה 1. זרימת הנוזל האופטימלית להשמנה אופטית אמורה לאפשר לכידה יציבה של חרוזים וברגע שהדנ"א נמתח, הוא צריך להיות בצורת B (~3,000 bp/μm).

8. לכידת חרוזי פוליסטירן עם מולקולות DNA בודדות מחוברות

  1. בהגדלה של 10x, אתר את הגבול בין זרמי נוזלים קרוב לנקודות הכניסה של הערוץ. הוסיפו שמן ליעד 100x ועברו להגדלה הגבוהה יותר.
  2. פתח את התריסים להשמנות האופטיות (שתיהן או אחת בכל פעם). קרני הלייזר הממוקדות צריכות ללכוד חרוזים והדנ"א צריך להימתח מיד.
  3. לאחר לכידת קומפלקס, תרגם את השלב הניצב לזרימה (איור 3A,C, inset). פעולה זו תעביר את הקומפלקס הלכוד מתמיסת חרוזי הדנ"א, לזרם 2. תרגום נוסף יעביר את המתחם לזרם 3.

9. ניקוי תאי זרימה

הערה: יש לבצע זאת מדי יום.

  1. כבו את המשאבה בסיום הניסוי. סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C).
  2. מוציאים מזרקים ומרוקנים אותם. יש לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים מסוננים.
  3. ממלאים את המזרקים בתמיסת ניקוי. מניחים מזרקים במשאבה ומתחברים לשסתומי מיתוג.
  4. נקה שסתומי מיתוג ושנה את המיקום לפתיחה. יש לשאוב תמיסת ניקוי 800 μL בקצב זרימה של 100 μL/h בדרך כלל במהלך הלילה.
  5. למחרת, סגור את שסתומי המיתוג, ולאחר מכן להסיר ולשטוף מזרקים עם מים. יש לשטוף את תא הזרימה והקווים עם 4-800 μL של מים בקצב זרימה של 400-800 μL/h. אם נדרש ניקוי מאומץ יותר של תאי זרימה, החלף את תמיסת הניקוי עם 6 M גואנידיום הידרוכלוריד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבדיקה הראשונית של יישור וחוזק המלכודת נעשית עם 1 μm, חרוזי פוליסטירן שאינם פלואורסצנטיים. מאחר שרוב המחקר שנעשה במעבדה משתמש בפלואורסצנציה, אנו בודקים עוד יותר את חוזק המלכודת באמצעות 1 מיקרומטר, חרוזי פוליסטירן ירוק דרקון (איור 1D,E). לאחר מכן העבודה משתנה להשמנה אופטית של קומפלקסים של חרוזי דנ"א שבהם הדנ"א מוכתם בצבע הביס-אינטרקלציה YOYO-1 14,29. כאשר קומפלקסים אלה נלכדים 10-15 מיקרומטר מעל פני השטח של הכיסוי בתא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרכבה זהירה של מערכת הזרימה היא קריטית לתוצאה המוצלחת של ניסויים 4,6. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול הוא חיבור המחברים למשטח הזכוכית. לשם כך, אנו משתמשים בשתי הגישות הבאות: מחברי צינורות בהתאמה לעיתונות ומכללי ננו-יציאות. מחברים המתאימים ללחיצה נצמדים בקלות לזכוכית ולאחר מכן דוחפים צינורות PTFE לתוך החורים המוכנים מראש באמצעות מלקחיים. כאשר נדרשת התקשרות יציבה יותר, עדיפה הדבקה של מכלולי ננו-נמל. עם שימוש זהיר וניקוי, תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר במעבדת ביאנקו נתמך על ידי מענקי NIH GM100156 ו- GM144414 ל- P.R.B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עדשות טבילה אובייקטיביות שלLeica506318 או 506038Oil 100x; הדמיה והשמנה אופטית בלבד; תכנן יעדי APO המותאמים להדמיית פלואורסצנציה
10X אובייקטיביLeica506263משמש לאיתור כתמי קרני לייזר במהלך היישור; כדי למצוא מיקוד ומיקום XY בתא זרימה
חרוזים פלואורסצנטיים 1 מ"מBangs LabsFSDG004משמש לביצועי ברז, קביעת מיקום מוקד
חרוזי פוליסטירן 1 מ"מBangs LabsCPO1004משמש להערכת ביצועי מלכודת וקשירה למולקולות ביוטיניליות
506081אובייקטיבי 63xLeicaמשמש לאיתור נקודות קרני לייזר במהלך היישור ולמציאת מיקוד ומיקום XY בתא הזרימה; יכול לשמש ללכידה אופטית מכיוון שיש לו קוטר צמצם אחורי זהה ל-100X; עדשת טבילה בשמן
לייזר יישורסדרת Lumentum1100לייזר HeNe 10mW הנראה לעין בלתי המשמש למיקום אופטיקה
מצלמת יישור קרןAmscopeMU303מצלמה פשוטה, זולה ומבוקרת תוכנה להדמיית מיקום האלומה
תוכנת בקרת מצלמה ולכידת תמונהHamamatsuHCImageמתאמת את הפעילויות של Lambda DG4 עם המצלמה כדי להקל על החלפת אורכי גל
מהירים מצלמה; Orca Flash 4Hamamatsuc13440-20cuמצלמת CCD להדמיית ניסויים של מולקולה בודדת
C-mount למצלמת יישור הקרןפתרונות הדמיה נקודתיתDE50CMTמספק מיקום אופטימלי של המצלמה להדמיית קרני לייזר במהלך יישור
C-mount למצלמתOrca Flash 4בעל טבעת מחזיק כדי להחזיק מסנן חוסם IR במקומו. זה מבטל את אלומת ה-IR המוחזרת מהמלכודות האופטיות ומאפשר הדמיה ברורה יותר של עצמים לכודים.
Cy5  קוביית מסנן פלואורסצנטיSemrockcy5-404a-lsc-zeroבשימוש בשילוב עם Lambda DG4 לתמונה Cy5 בלבד
Fitc-Txred  קוביית מסנן פלואורסצנטיSemrockfitc/txred-2x-b-000בשימוש בשילוב עם Lambda DG4 להדמיית צינורות FITC ו-TXRed
Fluidics Grace Bio46004צינורות PTFE כחלופה להצצה; עובד היטב על תאי זרימה מסוימים. ניתן להשתמש עם תאי זרימה PDMS או תאי זרימת זכוכית כאשר משתמשים במחברי צינורות Grace Bio fit
קוביית מסנן פלואורסצנטי GFPSemrockgfp-3035b-lsc-zeroמשמש בשילוב עם Lambda DG4 להדמיית GFP בלבד
תאי זרימת זכוכיתTranslumeתעלות זרימה שקופות מותאמות אישיתלהדמיה (איור 2E)
דבק זכוכיתLoctite233841מחבר בצורה מאובטחת וקלה מכלולי ננופורטים לתאי זרימת זכוכית
תאי זרימת סנדוויץ' זכוכית/PDMSשירותי CIDRA Precision בעיצובמותאם אישיתתאי זרימה שנבנו על פי המפרט שלך; תעלות הדמיה ברורות (איור 2C)
פתרון ניקוי המילטוןהמילטון18311פתרון ניקוי עדין אך יעיל לתאי זרימת זכוכית; אינו מבעבע בשימוש זהיר
מערכת תאורהסאטרLamda DG4הופסק אז ממליץ על Lambda 721
מערכת תאורהSutter InstrumentLamda DG4הופסק אז ממליץ על Lambda 721
תוכנת ניתוח תמונותMedia cyberneticsImage Pro Premiereניתוח תמונות ומעקב אחר מולקולות בודדות
תוכנת ניתוח תמונותFiji/NIH Image/Image JShareware ניתוח תמונות ומעקב אחר מולקולה בודדת
תמונה כרטיס תצוגהMelles Griot06 DLA 001מוצר חלופי מבית Thorlabs: VRC5
שמן טבילהZeiss444960Immersol 518 F פלואורסצנטי
ללא כלי יישור קרן לייזרThor labsFMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 משמש כדי להבטיח שהקורות אופקיות ובגובה הנכון
מציג קרן לייזרמעבדות פוטוניקה קנדיותIR 3150משמש להדמיית כתמי קרן IR על מראות ומטרות
מד כוח לייזרמעבדותמדידת תפוקת לייזר כמו גם חוזק מלכודת
משקפי בטיחות לייזר (HeNe)מעבדות תורLG7 או 8בלוקים >3 יחידות OD של אור באורכי גל >600 ננומטר
משקפי בטיחות לייזר (IR)מעבדות תורLG11חוסם >7 יחידות OD של אור באורכי גל ו-sup3; 1000 ננומטר
Mcherry  קוביית מסנן פלואורסצנטיSemrockmcherry-a-lsc-zeroמשמש בשילוב עם Lambda DG4 לתמונה mcherry בלבד
MicroscopeLeicaDMIRE2DIC הוסרה כדי להתאים ללכידה/יישור מראה דיכרואית
תוכנת בקרת מיקרוסקופ UCSF/sharewareuManagerשולט במיקרוסקופ, מאפשר יישור מוקדי של יעדים כמו גם בקרת במה
מכלול ננו-פורטיםIDEXN333מחברים המחוברים לתאי זרימה
תמיכה בטבלה אופטית ThorLabsPA52502תמיכה בטבלת בידוד אקטיבית
אופטיקה ועדשותSolar TIIשונותמראות הפרעות, טלסקופים ועדשות שתוכננו בהתאמה אישית למערכת
תאי זרימה PDMSufluidixתאי זרימה מותאמים אישיתשנבנו על פי המפרט שלך; ערוצי הדמיה ברורים (איורים 2B ו-D)
צינורות PEEKIDEX1532מספק חיבור מצוין לתאי זרימה ושסתומי מיתוג
קוביית מסנן פלואורסצנטי פינקלSemrocklf488/543/635-3x-a-000משמש בשילוב עם Lambda DG4 להדמיית פלואורופורים מרובים במהירות
לחץ על מחברי צינורותGraceBio46003מחבר סיליקון שקוף עם דבק שנקשר היטב לזכוכית
מראות סריקהGSI LumonicsVM500משמש כדי לספק שליטה על המלכודת האופטית השנייה. GSI Lumonics כבר לא קיים. ניתן לרכוש מראות דומות מקיימברידג' סיינטיפיק
סטייג' סטייגLeica
Stage מיקרומטראלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית68042-08מספק סרגל על המסך למיקום הקורה וכיול המערכת
מיתוג שסתומיםIDEXV-101Tשליטה בכיוון זרימת הנוזל וביטול הכנסת בועות לתאי זרימה
מזרק וסעפת שסתוםחנות מכונותללאבנויה בהתאמה אישית
מכשיר הרווארדPHD 2000שולט בזרימת הנוזל דרך תאי זרימה
תוכנת משאבת מזרקיםמכשיר הרווארד <חזק>70-6000בקרת זרימה מספקת שליטה חלקה וניתנת לתכנות של זרימת
נוזלים מזרקיםהמילטון81320אטום לגז, PTFE Luer Lock, חביות זכוכית עם בוכנות מצופות טפלון
שולחןThor LabsT36Hשולחן אופטי או לוח אב-טיפוס
לייזר לכידהסדרת Newport/Spectra PhysicsJ; לייזר BL106CNd:YAG; 1064 ננומטר; לייזר 5W
מכשיר תור יציאת' משאבת מזרקים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים