הדמיית רנטגן של טיפול אבלטיבי מבוסס אתנול תוך דוקטלי למניעת סרטן השד במודלים של חולדות

סיכום

מתואר הליך להעברת תמיסה אבלטיבית כימית לעץ צינור החלב של החולדה לטיפול מונע מונחה הדמיה בסרטן השד. ניתן למקד תאי אפיתל של החלב עם נזק מינימלי לרקמות אגביות באמצעות קנולציה ישירות לתוך פתח הפטמה ועירוי תוך דוקטלי של תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול 70%.

תקציר

יש עדיין מספר מוגבל של התערבויות ראשוניות למניעת סרטן השד. עבור נשים בסיכון גבוה לפתח סרטן השד, ההתערבות היעילה ביותר היא כריתת שד מניעתית. זהו הליך כירורגי דרסטי שבו תאי אפיתל החלב שיכולים להוליד סרטן השד מוסרים לחלוטין יחד עם הרקמה הסובבת. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את ההיתכנות של הליך תוך פולשני מינימלי שיכול להפוך להתערבות ראשונית חדשה למניעת סרטן השד. הליך מקומי זה מעדיף לנטרל תאי אפיתל של החלב לפני שהם יכולים להפוך לממאירים. שיטות אינטרה-דוקטליות לאספקת פתרונות ישירות לתאי אפיתל אלה במודלים של מכרסמים של סרטן השד פותחו באוניברסיטת מישיגן סטייט ובמקומות אחרים. בלוטת החלב של החולדה מורכבת מעץ צינור יחיד בעל ארכיטקטורה פשוטה וליניארית יותר בהשוואה לשד האנושי. עם זאת, מודלים של חולדות המושרות כימית של סרטן השד מציעים כלים חשובים למחקרי הוכחת היתכנות של התערבויות מונעות חדשות ומדרגיות ממודלים של עכברים לבני אדם. כאן מתואר הליך להעברה תוך-דוקטרית של תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול המכילה ננו-חלקיקי תחמוצת טנטלום כחומר ניגוד רנטגן ותאית אתילית כסוכן ג'ללינג לעץ צינור החלב של החולדה. העברת ריאגנטים מימיים (למשל, תרכובות ציטוטוקסיות, siRNAs, AdCre) בהזרקה תוך-ורידית תוארה בעבר במודלים של עכברים וחולדות. תיאור פרוטוקול זה מדגיש שינויים מתודולוגיים וצעדים הנוגעים באופן ייחודי למתן פתרון אבלטיבי, שיקול ניסוח למזעור תופעות לוואי מקומיות ומערכתיות של התמיסה האבלטיבית, והדמיית רנטגן להערכת in vivo של מילוי עץ הצינור. טכניקות פלואורוסקופיה ומיקרו-CT מאפשרות לקבוע את ההצלחה של אספקת תמיסה אבלטיבית ואת היקף מילוי העץ הצינורי הודות לתאימות עם חומר הניגוד המכיל טנטלום.

מבוא

עבור נשים בארה"ב¹, סרטן השד (BC) ממשיך להיות סוג הסרטן המאובחן ביותר וגורם ליותר מקרי מוות מכל סוג סרטן אחר למעט סרטן ריאות. התחזיות לשנת 2022 מעריכות כי 51,400 נשים יאובחנו עם קרצינומה באתרן ו-287,850 נשים יאובחנו עם קרצינומה פולשנית, וכי 43,600 נשים ימותו^{מ-BC 1}. למרות השכיחות והתמותה הקשורות לפנה"ס, ישנן מעט אפשרויות זמינות למניעה ראשונית ולמחקר תרגומי על התערבויות חדשניות מכיוון שמניעה ראשונית אינה מתועדפת על ידי סוכנויות פדרליות². כריתת שד מניעתית היא ההתערבות היעילה ביותר למניעה ראשונית. עם זאת, הליך זה מומלץ רק עבור אנשים בסיכון גבוה כי זה ניתוח גדול עם השלכות משנות חיים³. ניתוח זה כרוך בהסרה מלאה של תאי אפיתל החלב שמהם מתפתח קרצינוגנזה וכן של הרקמה הסובבת את הרקמה הסובבת אותם. אנשים נרתעים לעתים קרובות משימוש בהליך זה כאפשרות הראשונה שלהם להתערבות ראשונית בשל ההשפעה השלילית של לחץ פיזי, פסיכולוגי וחברתי. מסיבות אלה, אפילו כמה אנשים בסיכון גבוה בוחרים לא לעבור הליך זה ובוחרים במקום זאת המתנה זהירה או אסטרטגיות מעקב דומות³. בפרסום הקודם, אספקה של 70% אתנול (EtOH) ישירות לעץ הצינור של מודלים של עכברים הייתה יעילה בפירוק כימי של תאי אפיתל של החלב עם נזק מוגבל לרקמות נורמליות סמוכות ובמניעת היווצרות גידולי שד⁴. EtOH משמש ביישומים קליניים מרובים כסוכן אבלטיבי לטיפול מקומי בסוגי סרטן מסוימים או כסוכן סקלרוזינג לטיפול מקומי בנפיחות עורקית ומומים 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . פרופיל הרעילות והבטיחות הנמוך של EtOH מבוסס היטב, שכן בהליכים מסוימים ניתן לתת עד 50 מ"ל של 95% EtOH לכל מפגש ^5,10.

הסרה מלאה של תאי אפיתל החלב שמהם מתפתח BC היא המרכיב החיוני ביותר הן בכריתת שד מניעתית והן באספקה מקומית של תמיסה אבלטיבית. לכן, אישור של מילוי עץ ductal מלא יש צורך להבטיח כי הפתרון ablative בא במגע ישיר עם כל תאי אפיתל החלב. אספקת פתרון בתוך עץ הצינור וההדמיה שלו על ידי פלואורוסקופיה מונחית תמונה או דוקטוגרפיה אפשריים באמצעות הליכים קליניים שכבר קיימים^15,16,17. לפיכך, ניתן יהיה ליישם ולהעריך בקלות הליך זה בניסויים קליניים. צעד מפתח בביסוס היעילות וההיתכנות התרגומית של אבלציה תוך-דוקטרית (ID) כהתערבות חדשה למניעה ראשונית יהיה להדגים את ההיתכנות של גישת הדמיית רנטגן זו במודלים של בעלי חיים בעלי גודל ומורכבות הולכים וגדלים של ארכיטקטורת העץ הצינורית שלהם 4,18,19. כאן מתואר פרוטוקול שמרחיב את ההליך האבלטיבי הזה מעכבר²⁰ למודלים של חולדות. בעוד שלעצי תעלה של עכבר וחולדה יש מבנה ליניארי ותבנית הסתעפות דומים, עץ צינור החולדה גדול יותר באופן יחסי ומוקף בסטרומה צפופה הרבה יותר. יישמנו שיטה במעבדה להזרקה מוצלחת של כל בלוטת חלב בחולדה במשך סדרה של מפגשים שבועיים עם תמיסה אבלטיבית המכילה חומר ניגוד. ריווח מפגשים נחוץ כדי להבטיח שלבעלי החיים יהיו תופעות לוואי מינימליות של EtOH (איור 1 ואיור 2). ההליך כולל הזרקה של תמיסה אבלטיבית ישירות לתוך פתח הפטמה של חולדה מורדמת איזופלורן עם מחט 33 גרם. כמה שיפורים מרכזיים של ההליך כוללים שימוש בטיפול אנטי דלקתי ממושך, הזרקה של נפחים גבוהים יותר לכל עץ צינור ממה שהוצע²¹, ומזרקים gastight עבור נוזלים וגזים. משך הטיפול ב-5 מ"ג/ק"ג קרפרופן (NSAID) מ-48 שעות לפני עד שבוע לאחר זריקות ה-ID דומה לפרוטוקול האנטי-דלקתי המשמש לטיפול במלפורמציה ורידית במרפאה. הטיפול מבוצע בחולים בהרדמה סיסטמית ולאחריה יומיים של תרופות אנטי דלקתיות כגון NSAIDs. ניתן להאריך את הטיפול האנטי דלקתי במספר ימים נוספים כדי להפחית את הדלקת המקומית ואת כל הכאב הפוטנציאלי¹³. כמו בעכברים²⁰, הזרקה תוך-צפקית של תמיסת סוכרוז 5% ממתנת את ההשפעה קצרת הטווח של הרעלת אלכוהול בחולדות. חולדות ניתן להזריק עד 1 מ"ל של 70% EtOH (עד 4 צינורות; 0.2 גרם / ד"ל של תוכן EtOH בדם) בפגישה אחת כאשר מנוהל עם תמיסת סוכרוז זו; בעלי חיים מתאוששים באופן מלא תוך 4 שעות לאחר זריקות תעודת זהות. אנו מבצעים מפגשים רציפים כדי לאפשר מספיק זמן התאוששות בעת הזרקת יותר מ -4 בלוטות ו / או ריכוזי EtOH גבוהים יותר. הרעלת אלכוהול אצל נשים תהיה הרבה פחות סבירה כמו הזרקת ID של כל עצי הצינור בשני השדיים, בהנחה^{16 צינורות עיקריים 16,17} ו 2 מ"ל לכל צינור^22,23, עם 70% EtOH יגרום פחות מ 0.1 גרם / ד"ל של תוכן EtOH בדם ועלול לגרום לפגיעה קלה.

הדמיית רנטגן מאפשרת לקבוע עד כמה מוצלחת ההעברה התוך-דוקטרית בכל בלוטה בודדת ואם כל העץ הצינורי מתמלא (איור 1, איור 2, איור 3). ניתן להשתמש בהדמיית פלואורוסקופיה בזמן אמת כהכנה לסריקת מיקרו-CT ו/או שחזור תלת-ממדי של נתוני קובץ DICOM כדי להעריך את היקף אספקת התמיסה לעץ הצינור וכל דליפה לסטרומה. שימוש בפלואורוסקופיה יכול לעזור להגביל את מינון הקרינה הכולל המוטל על החיה. טכניקת הפלואורוסקופיה מתקרבת יותר ליישום הקליני המיועד להנחיית תמונה של טיפול אבלטיבי זה. בוצעה השוואה של ננו-חלקיקי איזובו המכילים יוד המאושרים על ידי ה-FDA לננו-חלקיקים של תחמוצת טנטלום (TaO_x) על מנת לחדד עוד יותר את התועלת של התמיסה האבלטיבית ^4,19. נמצא כי TaO_x הוא חומר ניגוד מיקרו-CT מעולה מאשר Isovue להדמיה של המילוי הראשוני של עץ הצינור בעכברים ^4,19. כאן אנו מדגימים ש-TaOx הוא חומר ניגוד מתאים כדי לדמיין את המילוי הראשוני של עץ צינור החולדה (איור 2 ואיור 3). הן במחקר תרגומי והן ביישומים קליניים, סוכן הג'ללינג אתיל צלולוז (EC) נוסף לתמיסת EtOH כדי למזער את הדיפוזיה מהאזורים הממוקדים המיועדים 13,14,24,25,26,27,28,29^. מחקרים הראו כי תוספת של עד 1.5% EC לתמיסות אבלטיביות המכילות EtOH תואמת להדמיה מבוססת_{TaO x} (איור 3). אלה, כמו גם שיפורים נוספים לפתרון האבלטיבי, עשויים לסייע בתרגום מוכן של הליך מונחה הדמיה זה למרפאה.

פרוטוקול

כל הניסויים המתוארים נערכו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.

1. טיפול אנטי דלקתי מורחב

1. הכינו כוסות ג'ל סוכרלוז כמינון פומי של קרפרופן. לספק חולדות עם טיפול אנטי דלקתי זה מ 2 ימים לפני קבלת הזרקת מזהה של 70% EtOH עד 7 ימים לאחר ההליך.
2. לדלל תמיסה עובדת של קרפרופן ב- PBS סטרילי להזרקה לכוס. מתמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל, הכינו תמיסה מדוללת של 2 מ"ג/מ"ל צבועה בצבע כחול סטרילי של 1% v/v והזריקו 500 מיקרו-ליטר לכל. תוספת של הצבע מסייעת בהדמיה של ערבוב מלא של התרופה בתוך סוכרלוז של הגביע.
3. יש לעקוב אחר המלצת היצרן להכין את הגביע לתוספת קרפרופן. אלא אם כן צוין אחרת על ידי הספק, לחמם את הכוס באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולייבש עם ההסרה כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
   1. נקו את מכסה הסוכרלוז עם 70% EtOH באזור והכניסו את מחט המזרק המכילה את תמיסת הקרפרופן. יש להוציא את הנפח המתאים (500 μL).
   2. מכסים את הנקב במדבקה. נערו את הכוס במרץ במשך 15 שניות, ואז הניחו את הכוס במערבולת למשך 15 שניות נוספות. הערך חזותית את הערבוב ההומוגני והשלם לפני האחסון לשימוש מאוחר יותר. חפש את נוכחותו של צבע כחול כהה.
      הערה: יש לאפשר לכוסות להגיע לטמפרטורת החדר. אחסנו את הכוסות בטמפרטורת החדר במידת הצורך, אך שימו לב להנחיות ליעילות התרופה מהיצרן. לחלופין, יש לאחסן את הכוסות בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך חודש. תיארוך המדבקה הוא נוהג טוב למעקב אחר תאריך ההזרקה ללא הסיכון של עט או סמן חד לנקב את המכסה.
4. רגע לפני השימוש, נגבו את החלק החיצוני של הכוס עם 70% EtOH. הסר את המכסה לפני הנחת הספל בכלוב בעלי החיים. יש להחליף את הכוסות פעם ביומיים או כשהן ריקות. בדוק את רמת הג'ל מדי יום כדי להבטיח מינון הולם. אחת יכולה לספק קרפרופן לעד שתי חולדות למשך עד יומיים; עם זאת, חולדות עשויות לצרוך שלמה מוקדם יותר.

2. הכנה לפני הניתוח

הערה: ודא ששלב ההכנה של בעלי החיים מקדים את הליך הזרקת תעודת הזהות ב-2-3 ימים.

1. הפעילו את מכשיר האידוי איזופלורן (2%-3% איזופלורן, 1.5 ליטר לדקה של חמצן) כדי להרדים את החולדה. העבירו את החיה לחרוט אף על כרית חימום. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על החולדה, ולאחר מכן למקם את החיה על גבה. עקוב בקפידה אחר הנשימה של החיה כדי להבטיח כי מישור ההרדמה נשמר ב 1%-3% של isoflurane.
   הערה: ניתן להשתמש בסכין גילוח חשמלי כדי להסיר עודפי פרווה לפני דפילציה. יש להיזהר מאוד שלא לפגוע בפטמות עם סכין הגילוח. מסיבה זו, ניתן לדלג על שלב זה. חולדות רגישות יותר לקרם דפילציה מאשר עכברים, ולכן הסרת עודף קרם חשובה מאוד. הימנעו מהזרקת תמיסה המכילה אתנול לאזור שכבר יש בו שחיקה כתוצאה מדפילציה. קרמים מסוימים הוסיפו תרכובות כגון אלוורה ולנולין שיכולים לעזור למזער את הסבירות לשחיקה.
2. השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי למרוח את הקרם ללא מרשם על אזור הפטמה. השתמש באפליקטור כדי לשפשף את הקרם לתוך האזור במשך 10-30 שניות. בדוק אם הפרווה השתחררה במהירות.
   1. השאירו את הקרם על החולדה למרווח הקצר ביותר האפשרי והסירו לחלוטין כדי למנוע שריפה של העור. חולדות רגישות אפילו יותר להליך זה מאשר עכברים.
3. לאחר 10-30 שניות של יישום, גזה רטובה עם מים חמים ולהשתמש בו כדי לשטוף את השמנת ואת הפרווה משוחרר מן החיה. בצעו לפחות שלוש שטיפות של האזור עם גזה טרייה ולחה וייבשו עם גזה יבשה לאחר השטיפה הסופית. ודא ראות טובה וגישה לאזור הפטמה מהמקום שבו הפרווה מוסרת. חזור על הליך depilatory במידת הצורך.
4. הניחו את החולדה בכלוב נקי על כרית חימום ותנו לה להתאושש. בדקו את החולדה כדי לוודא שהיא התאוששה לחלוטין מההרדמה לפני שתחזירו אותה לכלוב הקבוע שלה.
5. יש להניח בכלוב סוכרלוז אחת במינון קרפרופן (1 מ"ג/) לטיפול אנטי דלקתי. בדקו את צריכת הג'ל מדי יום והחליפו בכוס טרייה לפי הצורך. אין להשאיר את הגביע במשך יותר מיומיים. בדרך כלל, יהיה צורך להחליף כוסות לאחר יום אחד.

3. הזרקה תוך דוקטלית

1. הכן את תמיסת המלאי TaO_x ב-333.3 mM כמתואר¹⁹ באמצעות תמיסת מלח סטרילית עם מאגרי פוספט (PBS). מחממים את התמיסה אם האבקה אינה מתמוססת לחלוטין. מערבבים בעדינות. אין להסתער או לרעוד במרץ כדי למנוע היווצרות בועות.
2. ערבבו שלושה חלקים של 333.3 mM TaO x עם שבעה חלקים של 100% EtOH לקבלת פתרון סופי של 70% EtOH 100 mM/TaO_x. לחלופין, יש להוסיף כמות מתאימה של 0.5%-1.5% אתיל צלולוז (EC) כחומר ג'ל כדי למקסם את השמירה המקומית של התמיסה האבלטיבית. הוסיפו 1% צבע מאכל כחול v/v לתמיסת האבלטיב לבדיקה ויזואלית של ההעברה לעץ הצינור במהלך העירוי.
3. להכין כרך המתאים לצרכים ניסיוניים. זוגות בלוטות 1 (צוואר הרחם) ו-6 (מפשעתי) ניתנים למילוי בעד 100 μL של התמיסה בעוד שכל הזוגות האחרים יכולים להיות מלאים בעד 300 μL.
4. הרדימו את החולדה כמו בשלב 2.1 והעבירו את החולדה לחרוט האף לאחר הרדמה מלאה. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים ולאחר מכן להניח את החיה על גבה. אבטחו את החולדה מתחת לסטריאוסקופ באמצעות סרט ליד הפטמות שיוזרק, אם תרצו. משקלה של החולדה בדרך כלל מספיק כדי למנוע ממנה לנוע באופן משמעותי מבלי להקיש.
5. כדי להכין את הפטמות להזרקה, יש להסיר כל עור מת המכסה את פתח הפטמה במלקחיים מחודדים עדינים, במידת האפשר. לחולדות יש לעתים קרובות תקע בולט מפתח הפטמה שיכול למנוע שיכרון מוצלח של הפטמה אם לא מסירים אותה.
   הערה: חשוב לציין כי נפחי הזרקה גדולים יותר של תמיסות אבלטיביות המשמשות בחולדות עשויים להיות בסבירות גבוהה יותר לגרום לפצעים שטחיים בעור ליד אתרי ההזרקה. מסיבה זו, הזרקת כל פטמה שנייה בפגישה אחת פחות מזיקה ומרגיזה את החיה מאשר הזרקת פטמות סמוכות. ניטור החולדות לאיתור שפשופים במשך 7 ימים לאחר ההזרקה מסייע להבטיח שלא יהיו השפעות בריאותיות חמורות מהגירוד של בעל החיים והצגת האפשרות של זיהום מזיהום בפסולת רצפת הכלוב. משחה אנטיביוטית משולשת או שטיפות עם תמיסת chlorhexidine ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סימנים של זיהום פציעה שעלול להתרחש (טבלה 1).
6. השתמש מזרק 500 μL עם מחט 33 גרם כדי לשאוף 101-301 μL של תמיסה אבלטיבית. שאפו 1 מיקרוליטר נוספים של התמיסה לדליפה קלה אפשרית בעת הסרת המחט המשומרת.
   הערה: אלה הן המלצות לנפחים שמטרתם למלא באופן מלא את העץ הרדוקטלי: עד 100 μL בבלוטות צוואר הרחם והמפשעה, ועד 300 μL בבלוטות האחרות. עבור יישומים אחרים, ייתכן שיהיה נכון להשתמש באמצעי אחסון קטנים או גדולים יותר.
7. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק בעדינות את הפטמה ולהחדיר את המחט לפתח הפטמה. ממשיכים בעדינות להחדיר את המחט עד שהשיקוע נמצא במלואו בתוך הפטמה. כדי למקם את המחט בפטמה, הביאו את הפטמה כלפי מעלה לכיוון המחט במקום לדחוף את המחט כלפי מטה לתוך הפטמה. (טבלה 1). הקפידו ללכת בדרך של פתח הפטמה.
   הערה: פטמות עכברוש הן בדרך כלל הרבה יותר קלות למניפולציה ולשימור מוצלח מאשר אלה בעכברים בשל גודל גדול יותר. עם זאת, כמות השומן המוגברת סביב פתח הפטמה גם מגדילה את הסבירות להזריק בטעות את כרית השומן אם המחט חורגת מהצינור הראשי.
8. לאחר החדרת המחט במלואה, החדירו לאט לאט את התמיסה בקצב קבוע של כ-100 μL/min בחולדות. שינויים פתאומיים בקצב העירוי יכולים להתפוצץ או לפגוע בעץ הצינור. המתן 30 שניות לאחר סיום העירוי לפני הסרת המחט מהעץ המשומר עם סיוע באמצעות מלקחיים; זה מבטיח שהנפח המוזרק נשאר בתוך העץ הדוקטלי (איור 2) ומפחית את הסבירות לדליפה.
9. נקה כל תמיסה שנשפכה עם גזה לחה או מגבון EtOH כדי למנוע תמיסת ניגודיות חיצונית בתמונות.
10. להזריק PBS המכיל 5% סוכרוז (10 מ"ל/ק"ג) באופן תוך-צפקי כדי למתן את ההשפעות של הרעלת אלכוהול אם אתנול כלול בתמיסות הזרקת ID. מינון זה עשוי להינתן בתחילת ובסוף ההליך.

4. הדמיית מיקרו-CT

1. לאחר שכל הבלוטות הרצויות הוזרקו, העבירו את החיה במהירות למערכת המיקרו-CT והמשיכו לשמור על הרדמה באמצעות מכשיר אידוי איזופלורן משולב.
2. יישרו את עמוד השדרה של החיה והדביקו כל רגל אחורית במצב מורחב, כך שעצמות הרגליים של החיה יהיו רחוקות יותר מהבלוטות התחתונות של העניין ולא יחפפו את אזור העניין בתמונה הסרוקה.
3. סרט על פני הבטן כדי למזער את חפצי הנשימה אם סורקים את הבלוטות התחתונות.
   הערה: ניתן לצלם בעלי חיים עם פרמטרי סריקה שונים (למשל, רזולוציה גבוהה, סריקות אורך) אם מקפידים לקבוע מינון קרינה מתאים לכל החיים עבור חולדות ולהבטיח שהמינון המצטבר לא יעלה על רמה זו. ניתן להפחית עוד יותר את החשיפה לקרינה על-ידי רכישת תמונות סטילס וסרטונים של פלואורוסקופיה ללא ביצוע סריקות (איור 2).
4. בצע הדמיית_{TaO x} של עץ צינור החולדה ברזולוציה טובה והזדמנות לסריקות רכישה סטנדרטיות חוזרות (2 דקות) באמצעות פרמטרי הסריקה הבאים: 90 kVp/88 μA; שדה ראייה (FOV), 72 מ"מ; מספר פרוסות, 512; עובי פרוסה, 72 מיקרומטר; רזולוציית ווקסל, 72 מיקרומטר³. סריקות ברזולוציה גבוהה לפרקי זמן ארוכים יותר (4-14 דקות) ניתן לרכוש גם בבעלי חיים שלא ייסרקו לאורך באמצעות אותם פרמטרים.
5. לאחר איסוף הנתונים, קחו בזהירות את החולדה מקונוס ההרדמה והניחו בכלוב חדש ונקי על כרית חימום. בדקו את החולדה כדי לוודא שהיא התאוששה לחלוטין מההרדמה לפני שתחזירו אותה לכלוב הקבוע שלה. יש להניח את הסוכרלוז המכילה קרפרופן ולהחליף כראוי כמתואר בשלב 2.5 כדי להבטיח שבעלי החיים ימשיכו לקבל טיפול אנטי דלקתי במשך 7 הימים הבאים.
6. עבדו את התמונות הסרוקות לעיבודים מהירים בתוך תוכנת המיקרו-CT כדי להעריך טוב יותר דליפות ניגודיות, מילוי חלקי בלבד או מילוי יתר (איור 2).
7. המשך לחלק הבא כדי לבצע עיבוד תמונה רשמי לפרסום או ניתוח מפורט של סריקות במידת הצורך (איור 3).

5. ניתוח תמונות

1. השתמש בחבילות תוכנה מיוחדות כדי לייצר עיבודים של עץ הצינור המלא.
   הערה: עדיף לפלח את כרית שומן החלב על מנת לקבל את הביצוע הטוב ביותר של עץ הצינור המוזרק. Spline מתחקה אחר הגבולות הכהים של כרית השומן לאורך כל העובי השלם של החיה על מנת להשיג פילוח זה.
2. כדי לפלח את כרית השומן (בניגוד לעכברים, גבולות תא זה אינם ניתנים להבחנה בקלות מחלל הצפק, שרירי הירך והעור בשל יחידות הונספילד דומות) שבתוכה נכלל העץ הדוקטלי המעניין, בחירת האפשרות "עקבות spline" מהתפריט הידני היא הצעד הראשון ביצירת עיבוד.
3. Spline לעקוב אחר קווי המתאר של כרית השומן בכל פרוסה שלישית. לחץ על האפשרות להפיץ אובייקטים מהתפריט החצי אוטומטי. זה יהיה להפיץ ולחבר את כל הפרוסות לתוך אובייקט אחד מפולח של עניין.
   הערה: שינוי הסף בתוך האזור המקוטע מאפשר הדמיה של האות רק בטווח מסוים של יחידות Hounsfield (HU); עבור חומרי ניגוד אחרים או פרמטרי הדמיה, ייתכן שיהיה צורך להתאים טווח זה. ניתן להשתמש בחבילת תוכנה או בניתוח בינה מלאכותית כדי לבצע מדידות ותמונות אחרות כדי להראות כמה העץ הדוקטלי התמלא.
4. הגדר ערכי HU לנקודה נמוכה של 300 ולנקודה גבוהה של 3,000 בתפריט החצי אוטומטי תחת לשונית עוצמת הקול של סף. זה מאפשר יצירת עיבוד המציג רק את הניגודיות (TaO_x) בתוך עץ הצינור.
5. הגדר את העיבוד כראשי באמצעות לחצן "תצוגה". פעולה זו תשנה את התצוגה כך שתציג רק את העיבוד התלת-ממדי של עץ הצינור.
   הערה: בצע שחזור של העץ הצינורי לצורך ניתוח נוסף.

תוצאות

כל אחת מ-12 בלוטות החלב של נקבת חולדה מכילה עץ דוקטלי יחיד שנפתח בפתח הפטמה. למרות הבדלי הגודל בין העכבר לחולדה, התזמון ההתפתחותי של בלוטות החלב והזמן שבו בעלי חיים אלה מגיעים לבגרות דומה מאוד^ל-30,31. תיאור קצר של שלבי המפתח של התפתחות בלוטת החלב בחולדות כמייצג של שני מיני המכרסמים מסופק. ניצני קצה סופיים (TEBs) הם המבנים המתרבים מאוד בקצות העץ הצינורי המתארך, המכוונים את הסתעפות הצינורות^30,31. שיא ההתפשטות והצפיפות של ה- TEBs מתרחש בגיל 3-4 שבועות במהלך שלב ההתארכות של עץ הצינור בהתפתחות ההתבגרות³⁰. עד גיל 9-10 שבועות, נותרו מעט TEBs מכיוון שעץ הצינור גדל לתפוס את כל אורכו של כרית השומן³⁰. לאחר מכן, הצמיחה וההתרחבות של העץ הצינורי פרופורציונלית לזו של כרית השומן ושל החיה³². יחידות לובולריות סופניות (TDLUs) בשד האנושי מבצעות תפקיד דומה ל- TEBs במכרסמים. TDLUs הם המקור העיקרי להתחלת קרצינוגנזה והתקדמות עד^33,34 לפנה"ס. אנו יכולים להזריק עד 300 μL של תמיסת EtOH של 70% כדי למלא את כל העץ הצינורי של בלוטות החלב החזה והבטן של חולדת ספראג-דאולי בת 9 שבועות (איור 1, איור 2, איור 3). בניגוד לעכברים^{בני 20}, הפטמות של בלוטות צוואר הרחם והמפשעה של חולדות ספראג-דאולי מתאימות בדרך כלל להזרקה ביותר מ-80% מבעלי החיים, ועד 100 μL של 70% תמיסת EtOH נדרשים כדי למלא את כל העץ הצינורי (איור 2). אנו מזריקים באופן שגרתי עד 10 בלוטות חלב עם הפתרון האבלטיבי הנחקר. תכנון ניסויי טיפוסי מורכב משני מפגשי הזרקת ID שבועיים בלתי תלויים, שבהם חמש בלוטות מתחלפות מוחדרות לתמיסה אבלטיבית המכילה חומר ניגוד רנטגן ו/או EC כסוכן הג'ללינג (איור 2). עבור תמיסה אבלטיבית המכילה_{TaO x} (50-200 mM), פלואורוסקופיה ו/או מיקרו-CT מתבצעת לאחר סיום כל מפגש כדי לקבוע ולתעד את ההצלחה האישית של החדרת כל עץ צינור עם כמות חלקית או מלאה של תמיסה חדורת (איור 2). הדמיה מיידית ואורכית לאחר ההזרקה מאפשרת להעריך כיצד שינויים בפורמולציה, במיוחד ריכוז של חומר ג'לינג EC, משפיעים ומגבילים את הדיפוזיה החיצונית של התמיסה האבלטיבית כפונקציה של הנפח המוזרק (איור 3). ניתוח הדמיה זה מספק מידע להבנת הפרמטרים האופטימליים להשגת אבלציה מקסימלית עם נזק מינימלי לרקמות בטחוניות.

איור 1: סכמות של הפרוצדורה להזרקה תוך-ורידית וניתוח תמונה בחולדות. ההליך שלב אחר שלב להזרקה תוך דודית וניתוח תמונה מודגשים. אנא עיין בסרטון לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: דוגמאות לתיעול פטמות ותוצאת העברה של התמיסה האבלטיבית לתוך בלוטות חלב מרובות . (A) הצגה אופיינית של צורות פטמות בזן החולדה Sprague-Dawley. אורך הפטמה מתואם עם הסבירות לקנולציה מוצלחת. פטמות ארוכות יותר קלות יותר לזיוף מאשר פטמות קצרות, בעוד שפטמות קצרות מדי או שרידיות אינן ניתנות לזיהוי. לאחר הלידה, ניתן להחדיר את התמיסה גם לפטמות הארוכות וגם לקצרות ולהשיג אחוזי הצלחה דומים של הלידה. ניתן להשתמש בצבע מזון כחול בתמיסה המוזרקת כעדות in vivo למילוי עץ הצינור ולהצלחת האספקה (ככל הנראה, היווצרות כיפה, להזרקת פד שומן לא מוצלחת). עיבודי פלואורוסקופיה בזמן אמת (B) ומיקרו-CT תלת-ממדיים שנוצרו לאחר רכישת תמונה (C) מספקים עדות in vivo להצלחת המסירה והערכה כמותית יותר של הפתרון המגיע ל- TEBs. (B) כל בלוטת חלב בטן של הזוג הראשון (#4, #10) קיבלה תמיסה אבלטיבית עם 1% EC (מתאר כתום) או בלעדיה (מתאר ירוק) (C) אספקה מוצלחת (מתאר כחול) של התמיסה האבלטיבית בצוואר הרחם הימני , זוג שני של בלוטות החלב (#3, #9) וזוג ראשון של בלוטות החלב (#4, #10), והזרקה לא מוצלחת (קו מתאר לבן מקווקו) בבלוטת החזה השמאלית . פסי קנה מידה תואמים ל- 1 מ"מ בתמונות בהגדלה שונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: שחזור תלת-ממדי והערכה של מילוי תמיסה אבלטיבית ודיפוזיה . 70% ננו-חלקיקי EtOH/100 mM TaO_x עם 1% EC (למעלה) או ללא EC (למטה) הוזרקו באופן אינטרדוקטי לזוג בלוטות החלב השני בבטן (#4 ו-#10) ומיד צולמו על ידי מיקרו-CT. כל חולדה של ספראג-דאולי קיבלה נפח הולך וגדל של כל אחד מהתמיסות. עצים דוקטליים בודדים שוחזרו באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תמונה (עקיבה spline + אובייקט התפשטות + עיבוד סף). עם 1% EC, ניתן לראות את הפתרון מגיע לקצוות הטרמינל. ככל שהנפח שנמסר גדל, מספר ה- TEBs המלאים בולט יותר. סרגל קנה המידה מתאים ל- 10 מ"מ בכל העיבודים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בעיה	מראה	תמיסה
פטמה קצרה (איור 2)	לפטמה פרופיל נמוך – קשה לתפוס	לעיתים קל יותר להחזיק את העור ליד הפטמה ולמקד את מרכז הפטמה באמצעות המחט. סביר להניח שהמחט תצלול מתחת לעור. משיכה איטית עשויה לחשוף את הפטמה מעט מעל קצה המחט ולתת מקום לתפוס ולמשוך אותה בהמשך הדרך אל המחט. היזהר מאוד בעת צלילה מתחת לעור על זווית המחט. קל לקבל בשוגג זריקת כרית שומן על ידי דקירה בזווית הלא נכונה.
הזרקת פד שומן (איור 2)	נפוח סביב הפטמה ואולי בפטמה עצמה – הכי קל לראות אם מוסיפים צבע לתמיסת ההזרקה	אם הפטמה מתנפחת עם הזרקת האול הראשונים, יש להסיר את המחט ולנסות להחדיר שוב בזהירות רבה יותר בזווית. יש להתחיל שוב בהזרקה ולצפות לנפיחות נוספת. אם הנפיחות נמשכת, יש לנטוש את הניסיון. נדיר מאוד להזריק בהצלחה פטמה שהתחילה כהזרקת פד שומן.
פצעים/צלקות	פצע פתוח או scabbing ליד אתר ההזרקה של פתרון EtOH	חולדות נוטות יותר מעכברים לפתח פצעים או scabbing ליד אזור ההזרקה. אם נמצאו פצעים, יש למרוח משחה אנטיביוטית משולשת כדי לפתוח פצעים, אך להשאיר את הפצעים המכוסים לבדם. מריחת משחה על גלדים יכולה להגדיל את הסבירות שבעל החיים יטריד את הגלד ויסיר אותו. יש לבדוק כל 1-2 ימים עד להחלמה בהתאם לחומרת הפצע. יש לתת קרפרופן עד לריפוי גם אם מעבר לחלון הרגיל.
להזריק בלוטות מתחלפות	נ/א	נפחי הזרקה גדולים יותר בחולדות מגדילים את הסיכוי לגרום לשפשופים בעור אם מזריקים בלוטות עוקבות. עבור הסבירות הנמוכה ביותר של טראומה לאזור ההזרקה, בלוטות חלופיות מוזרק בתוך מפגש אחד (כלומר להזריק #1, 3, 4 ו 6 ולא #1-4). ריווח בין צמדי הבלוטות השלישי (#3 ו-#9) והרביעי (#4 ו-#10) מאפשר הזרקה של שתי הבלוטות הללו בפגישה אחת.

טבלה 1: עצות מועילות ופתרון בעיות

דיון

כפי שמוצג כאן, העברת ID של 70% EtOH מעדיפה את תאי אפיתל החלב עם נזק אגבי מוגבל לסטרומה ולכלי הדם הסובבים בעכברים⁴. אבלציה מקומית של עץ התעלה יעילה במניעת היווצרות גידולים במודלים של עכברים⁴. כאן אנו מדגימים כי ניתן להרחיב את ההליך האבלטיבי הזה לחולדות.

זהו השלב הבא בדרך לתרגום הליך אבלטיבי זה כהתערבות חלופית לכריתת שד מניעתית למניעה ראשונית של סרטן השד אצל אנשים בסיכון גבוה. הוספת ננו-חלקיקי TaO_x כחומר ניגוד רנטגן לתמיסה האבלטיבית מאפשרת להעריך את יעילות התמיסה במניעת היווצרות הגידול, שכן ניתן לקבוע אם ההליך היה מוצלח או לא במילוי מלא של עץ הצינור. שימוש בפלואורוסקופיה כדי לדמיין את בלוטת החלב המוזרקת משקף את מה שככל הנראה ייעשה במרפאה כדי להנחות הליך זיהוי זה. הדרכה ויזואלית של כמה התמיסה מילאה את עץ הצינור ומתי להפסיק את העירוי תהיה היבט מרכזי ביישום הקליני כדי להבטיח מילוי מקסימלי של כל עץ צינורי. פתרון בעיות ועצות מועילות מפורטים בטבלה 1. היעילות של הליך אבלטיבי זה דורשת שהתמיסה המוחדרת תיצור מגע ישיר עם כל תאי האפיתל כדי למקסם את קצב הרג התא. תאי אפיתל רזרביים בתוך עץ אחד או יותר יכולים בסופו של דבר לשמש כמקור להתפתחות לפני הספירה. הקבוצות האחרות דיווחו על העברת ID של חלקיקים נגיפיים (למשל, רכיבים של Cre/LoxP ו/או מערכות Cas9/CRISPR), הורמונים ואנטגוניסטים הורמונליים (למשל, פרולקטין, פולווסטרנט), חומרים כימותרפיים (למשל, ציספלטין), siRNAs ו/או נוגדנים או חומרי מיקוד אחרים בעכברים 4,19,21,35,36,37,38,39,40^, 41,42,43,44,45^, חולדות 21,33,46,47,48 ו/או ארנבות 18,49,50,51,52,53 . קנולציה מוצלחת של עד שמונה עצים צינוריים לכל שד אנושי לצורך אספקה מקומית של כימותרפיה דווחה במחקרים קליניים עצמאיים ^47,54,55. הנחיית תמונות לעירוי של פתרונות אחרים אלה המכוונים למניעת גידולים או מיועדים לטיפול מקומי תמקסם באופן דומה את יעילותם.

המדרגיות והעידון של הליך זה מעכבר לעץ צינור חולדה מודגמת כאן. ננו-חלקיקי TaO_x בעץ המורין ^4,19 ובחולדה (נתונים שלא פורסמו) מספקים הדמיה ברזולוציה גבוהה העולה על חומרי הניגוד המכילים יוד שאושרו על ידי ה-FDA. באופן דומה, איננו מודעים לגישות אחרות להדמיית עצים דוקטליים בעכברים^40,41 או במודלים אחרים של בעלי חיים¹⁸ שיכולים לספק רזולוציה דומה ל-TaO_x. רלוונטית לתרגום קליני היא העובדה שאפקט ה-gelling של EC במודלים של חולדות בגודל בינוני זה הוא עידון פורמולציה המאפשר למזער נזק לרקמות אגברות. ככל שנמשיך להעריך את הליך הזיהוי האבלטיבי הזה על יכולתו למנוע BC, נוכל לקבוע, ליתר דיוק, מאילו בלוטות BC מתפתחות באמצעות המידע הנוסף המסופק על ידי הדמיה לאחר מסירת ID במודלים של חולדות המושרות כימית ואחרות של BC. נתונים אלה יקבעו את בטיחותו של הליך זה ויצביעו על כל חשש או ליקוי בשאלה אם עצים צינוריים מטופלים חלקיים או לא מוצלחים עשויים להיות מועדים יותר לפתח BC אצל אישה בסיכון גבוה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AnalyzeDirect  v12.0	קליפר	n/a	לעיבוד תמונה מיקרו-CT
Carprieve, קרפרופן 50 מ"ג/מ"ל	Allivet	50647	לטיפול אנטי דלקתי
אתיל תאית	Acros Organics	9004-57-3	להזרקה תוך-צינורית
אוונס כחול	סיגמא	E2129-50G	להדמיית הזרקה
מים חמים אמבט	Toolots	Yidu_HH-S2	להכנת כוסות קרפרופן
כוסות סוכרלוז MediGel	ClearH2O	74-02-5022	למשלוח קרפרופן
דגם 1750 TTL, מזרק PTFE Luer Lock, 500μ L	המילטון	81220	להזרקה תוך-צינורית
פוטושופ 2021	Adobe	n/a	לעיבוד תמונה
מערכת הדמיה מיקרו-CT קוונטית GX2	פרקין אלמר	CLS149276	לרכישת תמונות מיקרו-CT
מחט רכזת מתכת, מד 33, מותאם אישית (זווית שיפוע, 0.4 אינץ', סגנון נקודה 4)	המילטון	7747-01	להזרקה תוך-צינורית
מיקרוסקופ סטריאו סדרת SZM	AmScope	SM-4TPZ-144	להזרקה תוך-צינורית
צבע מאכל כחול סטרילי	McCormick	930641	להדמיית
הזרקהמלח פוספט סטרילי (PBS)	ThermoFisher	14190250	להכנת תמיסה
מדבקות	DOT Scientific	DOTSCI-C50	להכנת כוסות קרפרופן
סוכרוז	Calbiochem	8550-5KG	להזרקה תוך-צינורית
מזרקים	פישר	14-826-79	להכנת כוסות קרפרופן
מערבולת	VWR	10153-834	להכנת כוסות קרפרופן
משאבת חימום Braintree	Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	להזרקה תוך-צינורית/הכנה טרום ניתוחית