הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים רשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים אנושיים למודל רטיניטיס פיגמנטוזה

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64045

⸱

16 ביוני 2022

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה, נוצרו אורגנואידים רשתית תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) המושרים על ידי מטופל רטיניטיס פיגמנטוזה. אורגנואידים אלה סיכמו בהצלחה כמה פנוטיפים קליניים של מחלת רטיניטיס פיגמנטוזה.

תקציר

רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) היא מחלה ניוונית נדירה ותורשתית של הרשתית עם שכיחות של כ-1/4,000 אנשים ברחבי העולם. לרוב חולי RP יש ניוון מתקדם של קולטני אור המוביל לאובדן ראייה היקפית, עיוורון לילה ולבסוף עיוורון מוחלט. עד כה, דווח על אלפי מוטציות ביותר מ-90 גנים הקשורות ל-RP. נכון לעכשיו, ישנם מעט מודלים של בעלי חיים זמינים עבור כל הגנים המושפעים וסוגים שונים של מוטציות, מה שפוגע במידה רבה בפענוח המנגנונים העומדים בבסיס הפתולוגיה של הגן/מוטציה ומגביל את הטיפול ופיתוח התרופות. אורגנואידים תלת-ממדיים ברשתית (ROs) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) המושרים על ידי מטופלים סיפקו מערכת טובה יותר למידול המחלה המוקדמת בבני אדם מאשר תאים ובעלי חיים. על מנת לחקור RP, נעשה שימוש באותם אורגנואידים רשתית תלת מימדיים שמקורם בחולה כדי לסכם את הפנוטיפים הקליניים של RP. ב-ROs שמקורם בחולה RP, מיקום שגוי של רודופסין הוצג בבירור. בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים, מודלים אורגנואידים ברשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים סיכמו בצורה קרובה יותר את מאפייני ה-RP ומייצגים גישה אידיאלית לחקירת הפתוגנזה של המחלה ולפיתוח תרופות.

מבוא

מחלות רשתית אנושיות, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה וניוון מקולרי הקשור לגיל, אינן מובנות היטב בשל היעדר מודלים ניסיוניים מתאימים 1,2. למרות שרשתית העכבר דומה מאוד לרשתית האנושית והיא כלי רב עוצמה לחקר האטיולוגיה של ניוון הרשתית, ישנם הבדלים עצומים בין מינים בין עכברים לבני אדם 3,4. לדוגמה, הארכיטקטורה הגרעינית של תאי קולטני האור בעכברים ובבני אדם שונה, ולרשתית העכבר אין מקולה 5,6. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מאפשרת לנו להחזיר את התאים המתמחים של אורגניזמים למצב הפלוריפוטנטי הראשוני באמצעות תהליכי "תכנות מחדש" על ידי שילובים של גורמי שעתוק ו/או תרכובות 7,8,9,10. ל-iPSCs אלה יש יכולת חלוקה והתפשטות כמעט בלתי מוגבלת והם יכולים להתפתח לסוגים שונים של תאים. לאחרונה, אורגנואידים רשתית תלת מימדיים שמקורם ב-iPSC פותחו כדי לדגמן את האירועים המוקדמים של התפתחות הרשתית האנושית ולתאר את הפתופיזיולוגיה של מחלות רשתית אנושיות 11,12,13,14,15. לאורגנואידים ברשתית יתרונות רבים: (1) ניתן להשתמש בהם כדי לסכם את התפתחות הרשתית in vivo ופתוגנזה של מחלות; (2) הם יכולים לשמש לסינון תרופות בתפוקה גבוהה ולניסויים פרה-קליניים של ריפוי גנטי; ו-(3) הם יכולים לשמש כהערכות פרה-קליניות של אפשרויות טיפול במחלות ניווניות של הרשתית16,17.

אחת המטרות של פרויקט זה הייתה לחקור את הפתוגנזה של פיגמנטוזה ברשתית (RP), מחלה שנותרה חשוכת מרפא בגלל ההטרוגניות הקיצונית שלה. עד כה, זוהו למעלה מ-90 גנים הקשורים ל-RP19,20. הגן RPGR, הנחשב לאחד הגנים הסיבתיים הנפוצים ביותר של RP15, מהווה כ-16% מכלל RP 4,21,22. iPSCs הנושאים מוטציה בשינוי מסגרת בגן RPGR נוצרו בהצלחה והתמיינו לאורגנואידים רשתית תלת מימדיים מאורגנים ומרובדים14. על ידי שימוש באורגנואידים אלה, נצפתה מורפולוגיה חריגה של שכבת קולטני האור וניתוק של אופסינים בקולטני האור.

בסך הכל, פרוטוקול צעד אחר צעד ונגיש מתואר כאן בפירוט כיצד ליצור אורגנואידים תלת מימדיים ברשתית שמקורם במטופל23,24. אורגנואידים אלה סיכמו בהצלחה כמה פנוטיפים קליניים של המחלה. זה מספק מודל מעודד לחקר התפתחות הרשתית ומנגנוני המחלה, לבדיקה טיפולית ולהערכת טיפול גנטי פרה-קליני עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר אנושי של האוניברסיטה הרפואית קפיטל.

1. תרבית תאים ויצירת iPSCs

  1. בחר חולי RPGR למחקר זה. כאן נעשה שימוש בשלושה חולים, נשא משפחתי אחד ושלושה ביקורת בריאים. לחולה 1 הייתה מוטציה c.1685_1686delAT באקסון 14 של הגן RPGR, לחולה 2 הייתה מוטציה c.2234_2235delGA באקסון 15 של הגן RPGR, ולמטופל 3 הייתה מוטציה c.2403_2404delAG באקסון 15 של הגן RPGR. בחר שלושה מתנדבים בריאים כביקורת14. אסוף דגימות דם מלא היקפיות מהמטופלים ומבקרות בריאות עם ניקור ורידים, והכניס אותן לצינורות איסוף דם (טבלת חומרים).
  2. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות עם מדיום שיפוע צפיפות25. הרחב את CD34+ PBMCs המופעלים עם ציטוקין ב-8 מ"ל של מדיום לשיפור גדילה (טבלה 1) בצלחת פטרי.
  3. לאחר שבוע אחד, אלקטרופורציה של התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי החיובי ל-CD34 עם מערכת טרנספקציה (טבלת חומרים) ובחר תאים חיוביים ל-CD34 ואת תוכנית T-01 המובנית ללא כל שינוי. טרנספקט קוקטייל של פלסמידים תכנות מחדש (2 מיקרוגרם) שיכול לייצר חלבוני OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC ו-KLF4 אנושיים.
  4. זרעו את התאים הטרנספטנטיים בצלחות שש בארות מצופות חלבון רקומביננטי אנושי ב-2 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0.5 מיקרומטר), bFGF (100 ננוגרם/מ"ל), CHIR99021 (3 מיקרומטר), HA-100 (10 מיקרומטר), A-83-01 (0.5 מיקרומטר) ו-hLIF (1000 U/mL) כדי לשמור על הצמיחה של iPSCs.
  5. 3 שבועות לאחר ההתמרה, בחרו את המושבות של iPSCs באופן ידני, לאחר מכן העבירו אותן ללוחות של שש בארות, ושמרו אותן במגיב B (טבלת חומרים) להרחבה.
    הערה: יש לצבוע את צלחות שש הבארות בחלבון רקומביננטי אנושי של ויטרונקטין. יש לדלל תמיסת ויטרונקטין ב-DPBS כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף את הוויטרונקטין המדולל לצלחות שש בארות שטופלו בתרבית רקמות. סובבו את כלי התרבות כדי לפזר את תמיסת הוויטרונקטין באופן שווה על פני השטח של צלחות שש הבארות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.
  6. ודא שהתאים מופרדים עם 0.5 מ"מ EDTA כאשר ה-iPSCs מגיעים לסביבות מפגש של 80%-90% ושיחס הפיצול הוא 1:8 או 1:10. ביום המעבר, הוסף בלביסטטין (2.5 מיקרומטר) למגיב B (טבלה 1).
    הערה: בלביסטטין שימש לקידום הידבקות תאים וחיוניות תאי גזע ומניעת אפופטוזיס של תאי גזע. 18 שעות לאחר מכן, יש לרענן את המדיום עם מגיב B.

2. יצירת ROs אנושיים

הערה: יש לנתק את ה-iPSCs כאשר ה-iPSCs מגיעים לסביבות מפגש של 80%-90%.

  1. נתק את מושבות ה-iPSC האנושיות (hiPSC) באמצעות 0.5 מ"מ EDTA ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. הפרד את גושי ה-hiPSC לתאים בודדים על ידי פיפטינג עדין. ספרו את התאים לתחזוקה וגידלו אותם במגיב B (טבלה 1).
  3. ביום 0, זרעו 12,000 תאים/באר ב-96 בארות חרוטיות עם תחתית V לצבירת תאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות (טבלה 1).
  4. ביום השישי, שאפו בזהירות את מדיום תרבית התאים והוסיפו 100 מיקרוליטר ממדיום ההתמיינות המכיל 20 מיקרומטר Y 27632 ו-1.5 ננומטר (55 ננוגרם/מ"ל) hBMP4.
  5. ביום התשיעי, החלף מחצית ממדיום ההתמיינות כדי לשמור על ריכוז ה-hBMP4 בסביבות 0.75 ננומטר.
  6. שאפו 60 מיקרוליטר של מדיום ההתמיינות מכל באר והוסיפו 60 מיקרוליטר של מדיום ההתמיינות הטרי המכיל 20 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
  7. ביום ה-12, החלף מחצית ממדיום ההתמיינות במדיום התמיינות טרי כדי להשיג 0.375 ננומטר hBMP4.
  8. ביום ה-18, העבירו את האגרגטים לצלחת פטרי חדשה עם קצות של 10 מ"ל וחתכו כל אגרגט ל-2-4 חתיכות בעזרת סכין מיקרו-כירורגית תחת מיקרוסקופ הפוך כדי ליצור אורגנואידים נוספים.
  9. העבירו את האגרגטים מאותה קבוצה לצינור צנטריפוגה אחד של 15 מ"ל. כאשר האגרגטים מתיישבים לתחתית הצינורות, שאבו את הסופרנטנט.
  10. השעו מחדש את האגרגטים עם 1 מ"ל של מדיום רשתית עצבית (DMEM/F12, 10% סרום בקר עוברי, 1% תוסף N-2, 0.5 מיקרומטר חומצה רטינואית, 0.1 מ"מ טאורין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין), והעבירו אותם לצלחות פטרי נון-סטיק עם 15 מ"ל של מדיום רשתית עצבית. שים 10-15 אורגנואידים ברשתית בצלחת פטרי אחת.
  11. רענן את מדיום התרבות כל 5 ימים. שמור את התרבית בחושך מכיוון שחומצה רטינואית רגישה לאור (איור 1) ובדוק את היווצרות רקמת הרשתית האנושית המארגנת את עצמה באמצעות מיקרוסקופ הפוך 26,27,28,29.

3. ניתוח אורגנואידים ברשתית

  1. צביעה אימונופלואורסצנטית של רשתית תלת מימדית שמקורה ב-hiPSC
    1. תקן את הרשתית התלת מימדית ב-1 מ"ל של פרפורמלדהיד טרי של 4% ב-DPBS למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את האורגנואידים עם 1 מ"ל של מאגר DPBS.
    2. מודדים 0.5 גרם אגרוז (טבלת חומרים), ומערבבים את אבקת האגרוז עם 100 מ"ל DPBS בבקבוק הניתן למיקרוגל. השתמש במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז למשך 1-3 דקות עד להמסה מלאה. נותנים לתמיסת האגרוז להתקרר לכ-40 מעלות צלזיוס.
    3. הטמע אותם ב-2% ב-DPBS.
    4. פורסים את הדגימות למקטעים בעובי של 50 מיקרומטר באמצעות ויברטום. מניחים את החלקים הפרוסים על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה (טבלת חומרים) ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    5. מפשירים את הפרוסות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. שוטפים את הפרוסות עם DPBS למשך 5 דקות, וחוזרים על הפעולה 3 פעמים.
    7. השתמש ב-0.5% Triton X-100 בתמיסת DPBS כדי לחלחל את הפרוסות למשך 15 דקות ב-RT.
    8. הסר את תמיסת החדירה, שטוף את הפרוסות עם DPBS למשך 5 דקות וחזור על הפעולה פי 3.
    9. דגרו את הפרוסות עם 1% BSA ו-0.5% טריטון X-100 ב-DPBS למשך 30 דקות ב-RT.
    10. דגרו את הפרוסות עם נוגדן נגד רודופסין (1:1000) ונוגדנים נגד L/M אופסין (1:1000) מדוללים ב-1% BSA ו-0.1% Triton X-100 למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    11. שוטפים את הפרוסות עם DPBS למשך 5 דקות, וחוזרים על הפעולה 3 פעמים.
    12. דגרו את הפרוסות עם נוגדן משני נגד עכבר וארנב (1:500) מדולל ב-1% BSA ו-0.1% טריטון X-100 למשך שעה אחת ב-RT.
    13. הוסף 30 ננומטר 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ב-DPBS למשך 15 דקות ב-RT לצביעה גרעינית.
    14. שוטפים את הפרוסות עם DPBS למשך 5 דקות, וחוזרים על הפעולה 5 פעמים.
    15. הרכיבו את הפרוסות במדיום הטבעה (טבלת חומרים) וכסו את השקופיות (טבלת החומרים). יש לשמור בקופסה חשוכה ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  2. מיצוי RNA וריצוף RNA
    1. אסוף 1-3 רשתית תלת מימדית (לפי גדלים) שמקורה בכל ביקורת ומטופל באותן נקודות זמן התמיינות (יום 0, יום 47, יום 91, יום 121 ויום 151) ב-1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (טבלת חומרים) על קרח.
    2. השתמש בהומוגנייזר (טבלת החומרים) כדי לשבש את הדגימות, דקה אחת ON, 30 שניות OFF, למשך שלושה מחזורים, ובדוק את הדגימה לאיתור שיבוש.
    3. עצור את ההומוגניזציה כאשר הדגימות הומוגניות לחלוטין, ומערבל את הצינור במרץ למשך 30 שניות.
    4. דגרו את הדגימות על קרח למשך 15 דקות.
    5. צנטריפוגה את הדגימות ב-13,800 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש נטול RNase בנפח 2 מ"ל.
    6. הוסף 0.4 מ"ל כלורופורם לצינור, למערבולת ולצנטריפוגה ב-13,800 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. העבירו בזהירות חלק (כ-2/3) מהשלב העליון חסר הצבע לצינור חדש נטול RNase. אין לשאוב או להפריע לממשק הלבן המכיל DNA.
    8. הוסף 0.5 מ"ל איזופרופנול קר, מערבולת למשך 30 שניות וצנטריפוגה ב-13,800 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. נוצר כדור בצד תחתית הצינור.
    9. שאפו בזהירות את הסופרנטנט עם קצה פיפטה ושמרו את הגלולה.
      הערה: כדור ה-RNA דמוי ג'לי ושקוף כאשר הטוהר גבוה מאוד.
    10. הוסף 1 מ"ל של אתנול 70% קר, מערבול את הדגימות במרץ במשך 30 שניות, וצנטריפוגה ב-13,800 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    11. שאפו בזהירות את הסופרנטנט עם קצה פיפטה וייבשו את הכדור באוויר במכסה המנוע ב-RT למשך 5-10 דקות. אין לייבש יתר על המידה את הגלולה.
    12. הוסף 20-50 מיקרוליטר מים ללא RNase והשהה את הגלולה בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    13. החל 1 מיקרוליטר RNA על ספקטרופוטומטר (טבלת חומרים). בסך הכל שימשו כ-10 מיקרוגרם של RNA מבקרות ומטופלים בהתאמה להכנת ספריית Illumina30.
    14. אחסן את ה-RNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

האיור הסכמטי מתאר את הליכי ההתמיינות ליצירת אורגנואידים רשתית בריאים ומטופלים שמקורם ב-iPSC (איור 1). מ-iPSC ועד ROs, ניתן לייצר וריאציות עקב מספר גורמים. הסטטוס של ה-iPSC הוא השלב הקובע של יצירת ה-RO. בנוסף, מומלץ מאוד לחוקרים לתעד כל שלב, קטלוג ומספר אצווה של כל המדיה, כך שניתן יהיה לעקוב אחר הניסויים כולם. באיור 2A, הצביעה החיסונית של סמן המוט רודופסין (אדום) וסמן החרוט L/M-opsin (ירוק) באורגנואידים רשתית בריאים ומטופלים שמקורם ב-iPSC ביום 130. ב-ROs שמקורם ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אורגנואידים ברשתית הם מבנים תלת מימדיים, למינציה שמקורם ב-hiPSCs או תאי גזע עובריים (ESCs) ומוצגים כמודל מבטיח מאוד לחיקוי הדפוסים המרחביים והזמניים של התפתחות הרשתית האנושית31,32. ה-ROs מורכבים מסוגים שונים של תאי רשתית, כולל קולטני אור, תאים דו קוטביים, תאי גנגליון, תאי אמקרין, תאים אופקיים ו-Müller glia33. תרבית דו-ממדית אינה יכולה לחקות במדויק את הכיוון וההתפתחות של המקטע החיצוני של תאי קולטני האור. למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים אינם מגלים ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים ל-M.S. Yan-ping Li ו-Zhuo-lin Liu על תמיכתם הטכנית והערותיהם המועילות בנוגע לכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014, 82125007) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 בארות חרוטיות עם תחתית VSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83– 01מו"פ D Systems2939/10
שקופיות מיקרוסקופ הידבקותCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection
System B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR& D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
צינור איסוף דםBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
שקופיות כיסויCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC בינוניNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham' s F12Gibco10565-042
חמור נגד עכבר 488InvitrogenA-21202
חמור נגד ארנב 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
הטמעת מדיוםFluorSaveTM ריאגנט345789
EX-CYTE מדיום שיפור צמיחהסיגמא811292שיפור גדילה בינוני
סרום בקר עובריGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8שיפוע צפיפות
בינוני FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061תוסף L-גלוטמין
HA-100STEMCELL Technologies72482
בשר חזיר s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
הומוגנייזרEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove' s שונה Dulbecco בינוניGibco12440053
החלפת סרום נוקאאוט - רב מיניםGibcoA3181502החלפת סרום
מדיה L/M-opsinMilliporeab5405
מונותיוגליצרולSigmaM6145
N-2 תוסףתרמו פישר מדעי17502048
Nanodrop ספקטרופוטומטרתרמו פישר מדעיND2000ספקטרופוטומטר
ncEpic 125x תוסףNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x תוסף
ncEpic בזאלי בינוניNuwacell BiotechnologiesRP01001-01בסיסי hpsc בינוני
ncLaminin511 חלבון רקומביננטי אנושיNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
BMP4 אנושי רקומביננטי D Systems314-BP
חומצה רטינואיתSigmaR2625
רודופסיןSigmaO4886
RNeasy מיני קיטQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM בינוניSTEMCELL טכנולוגיות09600
טאוריןסיגמאT8691
מגיב טריזולInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
סכין V-Lanceאלקון כירורגי8065912001
מו"פ

מקורות

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37(2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631(2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075(2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366(2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129(2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850(2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444(2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278(2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202(2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520(2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523(2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903(2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153(2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137(2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33(2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.