טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

Summary

טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.

Abstract

טכניקת הכנת רשת קריו-EM עם כתם קליפה היא שיטת הזרקה אחורית ששונתה באופן משמעותי במטרה להשיג הפחתה בשכבות של דגימות רב שכבתיות. הסרה זו של שכבות לפני הקפאת הדגימה יכולה לסייע בהפחתת עובי הדגימה לרמה המתאימה לאיסוף נתוני cryo-EM, שיפור שטוחות הדגימה והקלה על עיבוד התמונה. טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של ממברנות מולטי-למלריות לשכבות בודדות, של גבישים דו-ממדיים שכבתיים לגבישים בודדים, ושל מבנים מוערמים דמויי יריעות של חלבונים מסיסים כדי שגם אותם ניתן להפריד לשכבות בודדות. עובי הדגימה הגבוה של דגימות מסוג זה מהווה לעתים קרובות בעיות בלתי עבירות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה cryo-EM, במיוחד כאשר יש להטות את שלב המיקרוסקופ לצורך איסוף נתונים. יתר על כן, רשתות של ריכוזים גבוהים של כל אחת מהדגימות הללו יכולות להיות מוכנות לאיסוף נתונים יעיל מכיוון שניתן להגדיל את ריכוז הדגימות לפני הכנת הרשת ולהתאים את טכניקת הקילוף-כתם כדי לגרום לפיזור צפוף של דגימה חד-שכבתית.

Introduction

טכניקת ה-peel-blot פותחה על מנת להפריד גבישים דו-ממדיים מוערמים של חלבוני ממברנה לשכבות בודדות כדי לקבל דגימות דקות מתאימות לאיסוף נתונים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של cryo-EM ולהקל על עיבוד תמונה¹. הפרוטוקול מתאים באופן דומה לסוגים אחרים של דגימות מולטי-לאמלר וכן להשגת ריכוזי דגימה גבוהים של כל אחד מסוגי הדגימה ברשת מבלי להגדיל את העובי ב-Z.

הפחתת שכבות הדגימה לשכבה אחת מושגת על ידי הפעלת שילוב של לחץ נימי וכוחות גזירה בפרוטוקול המרחיב באופן משמעותי את שיטת ההזרקה האחורית² ומשנה אותה. שלב ראשון של הכתמה גורם לכריכה הדוקה ולהיצמדות לסרט הפחמן ולפס רשת משני צדי הדגימה הרב-שכבתית במהלך הכתם על תת-מיק....

Protocol

1. שלבי הכנה לטכניקת כתם הקליפה

הערה: ההכנה דורשת שהפריטים הבאים יוצבו בצמוד זה לזה.

1. ערמו שתי חתיכות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
2. מניחים סרט פרפין באורך ~8X10 ס"מ בצמוד לנייר הסינון כשהנייר פונה כלפי מעלה.
3. הניחו פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על גבי שתי פיסות נוספות של נייר סינון #4 (איור 1-1).
4. מקמו את המלקחיים נגד נימים כאשר הרגל הכפופה פונה כלפי מעלה והרגל הישרה פונה כלפי מטה. לאחר מכן, בחרו רשת של 600 רשתות עם הצד החלק/מבריק כלפי מעלה. מניחים את המלקחיים על צלחת פטרי או משטח מוגבה אחר כדי ל....

Results

ניסוי מוצלח של כתמי קילוף יביא לשכבות בודדות של דגימות בריכוזים גבוהים לעתים קרובות. יש לצפות כי אזורים מסוימים ברוב ריבועי הרשת עדיין יכילו שכבות מרובות, במיוחד במספר קטן יותר של איטרציות של מדרגות הכתמים. עם זאת, רוב ריבועי הרשת יכילו אזורים נרחבים של שכבות בודדות כפי שנצפה עבור גבישים דו-ממדיים של לויקוטרין C₄ סינתאז אנושי (איור 2) וליפוזומים (נוסף בשלב 3.2, איור 3). ייתכן שיהיה צורך לבדוק שלבים נוספים של כתמי קילוף עבור דגימות שאינן מראות את ההפחת.......

Discussion

כתם הקליפה הוא שיטה רבת עוצמה להתגבר על ערימה ועובי של גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים ודגימות דומות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה. החלטה על השימוש בכתם הקליפה תתבסס על פרמטרים ביולוגיים של הדגימה ותדרוש גם הערכה ברגע שיהיה מודל קריו-EM תלת-ממדי זמין. החשיבות הביולוגית של מגעים וגמישות פוטנציאלית של אזורי מגע יהיו חשובים במיוחד בהערכה זו.

מספר כתמי הקליפה ייקבע בתחילה באמצעות תצפית לאחר הכנת רשת כתמים שלילית סטנדרטית, כאשר שכבות או עובי מוגזמים ידרשו אסטרטגיות חלופיות להכנת רשת קריו-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
רשתות 600 רשת	SPI	2060-C-XA
מלקחיים אנטי נימיים	Ted Pella	510-5
פחמן לציפוי נציץ
רשתות Cryo-EM			Cryo-EM עשויות להיות מוקרנות ב-120 קילו וולט או 200 קילו וולט. נתונים ברזולוציה גבוהה נאספים ב -300 קילוואט.
Dumpont #5 מלקחיים	טד פלה	5622
קופסת רשת לאחסון cryo-EM	טד פלה	160-40
קים מגבונים
חנקן
נציץ	טד פלה	56	הנציץ מצופה פחמן ונחתך לריבועים גדולים יותר מרשת TEM. עובי הפחמן עשוי לדרוש אופטימיזציה כדי למנוע פחמן דק שנשבר בקלות עם כתמי קילוף מרובים.
כתם			1-2% אורניל אצטט מתאים לדוגמאות רבות.  ניתן להחליף כתמים אחרים כגון חומצה פוספוטונגסטית.
פרפילם
			ניתן למחזר מיכל משלוח מפוליסטירן למטרה זו ולרפד בנייר אלומיניום.
נייר סינון תת-מיקרוני	MilliporeSigma	DAWP04700
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	JEOL	JEM-1400	כל TEM המופעל במתח מאיץ של 80-120 קילו וולט יתאים להקרנה של רשתות מוכתמות שלילית.
טרהלוז			הכן תמיסת טרהלוז 4%.
Whatman #4 נייר סינון	MilliporeSigma	WHA1004150	זה מתאים ל 20-25 μ נייר סינון בגודל נקבוביות m בפרוטוקול.